Echinacoside modulira put CGAS-STING kako bi ublažio upalne ozljede izazvane LPS-om u stanicama alveolarnog epitela (A549)

 

Autori:Jianfeng Luo; Tao Bai
Pripadnost:Odjel 1, Odjel za zarazne bolesti, bolnica Wuhan Jinyintan, Wuhan 430000, Hubei, Kina

 

Ključni zaključci (za čitatelje istraživanja i razvoja prirodnih sastojaka i dodataka)

Izlaganje LPS-u oštetilo je stanice alveolnog epitela A549, smanjujući markere proliferacije i povećavajući apoptozu i upalne citokine.

Echinacoside (ECH) pokazao je zaštitu ovisnu o dozi: poboljšana vitalnost/proliferacija stanica i smanjena apoptoza i upalni medijatori.

Mehanički gledano, koristi su bile povezane ssmanjena regulacija cGAS–STING–TBK1–IRF3 signalne osii na razini mRNA i na razini proteina.

Aktivator puta cGAS–STING (RocA) oslabio/antagonizirao zaštitne učinke ECH-a, podržavajući uključivanje puta.

Značaj za botanički razvoj: Cistanche(肉苁蓉) nadaleko je poznat kao botanički proizvod bogat ehinakozidom, što ga čini praktičnim uzvodnim materijalom koji treba uzeti u obzir za istraživanje i razvoj proizvoda - imajući na umu da je ova studijain vitroi koristi pročišćeni ECH.

Tablica 1. Učinci različitih koncentracija ECH i RocA na stanice A549 (OD570_{570}570​, xˉ±s\\bar{x}\\pm sxˉ±s, n=6n=6n=6)

Koncentracija (μmol/L)	ECH (OD570_{570}570​)	RocA (OD570_{570}570​)
0	0.45 ± 0.03	0.43 ± 0.04
3	0.42 ± 0.05	0.45 ± 0.06
6	0.43 ± 0.04	0.42 ± 0.05
9	0.46 ± 0.06	0.46 ± 0.07
12	0.44 ± 0.05	0.44 ± 0.05
24	0.47 ± 0.06	0.20 ± 0.03¹

F/P vrijednost:ECH: 0,857 / 0,521; RocA: 22.050 /<0.001
Bilješka:U usporedbi s 0 μmol/L: ¹ P<0.05P<0.05P<0.05.

 

Sažetak (prepisan na engleskom, točku po točku)

Cilj

Za procjenu je liehinakozid (ECH)štiti ljudske alveolarne epitelne stanice odupalna ozljeda izazvana lipopolisaharidom (LPS).te je li ta zaštita povezana s regulacijomcGAS–ŽALACsignalni put.

Metode (dizajn studije)

Model ćelije:Ljudska alveolarna epitelna stanična linijaA549.

Provjera citotoksičnosti/viabilnosti:MTT test za testiranje ECH i cGAS-STING aktivatora puta (RocA) za toksičnost.

Grupiranje:

Kontrola (standardna kultura)

LPS (30 mg/L)

LPS + ECH niska/srednja/visoka doza (9, 12, 24 μmol/L)

LPS + ECH (24 μmol/L) + RocA (12 nmol/L)

Krajnje točke:

Proliferacija:EdU bojenjeiPCNA(Western blot)

Apoptoza:Protočna citometrija (Annexin V‑FITC/PI); Bax/Bcl‑2(Western blot)

Upala:TNF‑, IL‑6u supernatantu (ELISA)

Očitavanja staze:cGAS, STING mRNA(qRT‑PCR);cGAS, STING, TBK1, IRF3 proteini(Western blot)

 

Tablica 2. Usporedba EdU-pozitivne stope, ekspresije PCNA, stope apoptoze, ekspresije Bax/Bcl-2 i razina TNF- /IL-6 u stanicama A549 među skupinama (xˉ±s\\bar{x}\\pm sxˉ±s, n=6n=6n=6)

Skupina	EdU-pozitivna stopa	PCNA/GAPDH	Stopa apoptoze (%)	Bax/GAPDH	Bcl-2/GAPDH	TNF- (ug/ml)	IL-6 (ng/ml)
Kontrolirati	57.38 ± 3.24	1.67 ± 0.15	4.38 ± 1.09	0.37 ± 0.06	1.63 ± 0.12	4.65 ± 1.08	18.47 ± 1.19
LPS	27.51 ± 1.68¹	0.49 ± 0.08¹	36.75 ± 2.31¹	1.59 ± 0.13¹	0.28 ± 0.06¹	30.71 ± 1.68¹	49.23 ± 2.75¹
ECH-L	33.72 ± 1.96²	0.86 ± 0.10²	29.16 ± 2.27²	1.24 ± 0.11²	0.67 ± 0.08²	22.58 ± 1.52²	41.78 ± 2.46²
ECH-M	40.59 ± 2.40²,³	1.27 ± 0.13²,³	21.93 ± 1.64²,³	0.85 ± 0.09²,³	1.08 ± 0.10²,³	15.83 ± 1.16²,³	32.64 ± 2.18²,³
ECH-H	48.21 ± 2.57²,³,⁴	1.58 ± 0.14²,³,⁴	13.86 ± 1.45²,³,⁴	0.49 ± 0.08²,³,⁴	1.35 ± 0.11²,³,⁴	7.91 ± 1.13²,³,⁴	23.59 ± 1.57²,³,⁴
RocA	35.79 ± 2.38⁵	0.92 ± 0.11⁵	25.74 ± 1.69⁵	0.93 ± 0.10⁵	0.74 ± 0.09⁵	19.76 ± 1.20⁵	36.78 ± 2.61⁵

F vrijednost: 118.927; 85.600; 245.724; 131.552; 159.598; 321.852; 161.353
P vrijednost:sve<0.001

Bilješke (više usporedbi):
U usporedbi sKontrolirati: ¹ P<0.05P<0.05P<0.05
U usporedbi sLPS: ² P<0.05P<0.05P<0.05
U usporedbi sECH-L: ³ P<0.05P<0.05P<0.05
U usporedbi sECH-M: ⁴ P<0.05P<0.05P<0.05
U usporedbi sECH-H: ⁵ P<0.05P<0.05P<0.05

 

 

Rezultati (glavni nalazi)

U usporedbi s kontrolom,LPS:

SmanjenEdU-pozitivna stopa,PCNA, iBcl‑2

Povećanastopa apoptoze,TNF‑, IL-6

Pojačano reguliranocGAS i STING na razini mRNA

PovećanaProteini puta Bax i cGAS–STING (cGAS, STING, TBK1, IRF3)
(Sve statistički značajno, P<0.05P<0.05P<0.05.)

U usporedbi sa samim LPS-om,ECH (9→12→24 μmol/L)ovisno o dozi:

Obnovljena proliferacija(viša stopa EdU-pozitivnih i PCNA)

Smanjena apoptoza(niža stopa apoptoze, niži Bax, viši Bcl‑2)

Potisnute upale(niži TNF- i IL-6)

Smanjena cGAS–STING signalizacija(niži cGAS/STING mRNA; niži cGAS, STING, TBK1, IRF3 proteini)
(Ovisno o dozi, P<0.05P<0.05P<0.05.)

RocA je uzvratioECH-ova zaštita u uvjetima LPS ozljede (str<0.05P<0.05P<0.05), consistent with cGAS–STING pathway involvement.

Zaključak

ECHpovećana vitalnost i proliferativna aktivnostalveolarnih epitelnih stanica izazvanih LPS-om ipotisnuta apoptoza i upalni odgovori. Zaštitni mehanizam je vjerojatno povezan sinhibicija/blokada prekomjerno aktiviranog cGAS-STING signaliziranja.

 

Pozadina (zašto je ovo važno)

U pacijenata izloženih ili zaraženih LPS-om (glavna gram-negativna bakterijska komponenta),akutna ozljeda pluća (ALI)i njegov teški oblikARDSključni su pokretači morbiditeta i mortaliteta. Karakteristična patologija uključuje difuznu ozljedualveolarni epitelikapilarni endotel, što dovodi do propuštanja barijere i plućnog edema.

Unatoč napretku u suportivnoj njezi,učinkovite ciljane terapije ostaju ograničene, stoga je važno identificirati nove kandidate za lijekove i mete.

Ehinakozid (ECH)je feniletanoidni glikozid s prijavljenim djelovanjem uključujući antioksidativno, protuupalno, citoprotektivno i antiapoptotsko djelovanje.
Za programere prirodnih proizvoda:Cistanche (肉苁蓉)je tradicionalni botanički često istaknut zbog toga što jebogat ehinakozidom, što ga čini praktičnim izvornim materijalom pri istraživanju ECH-orijentiranih formulacija - dok također zahtijeva pažljiv rad na standardizaciji i prevođenju izvan staničnih testova.

ThecGAS–STING putje citosolna DNA osjetna os koja potiče proizvodnju interferona tipa I i upalnog medijatora. Dokazi sugeriraju dapretjerana aktivacijacGAS–STING-a pridonosi upalnoj i autoimunoj patologiji te da suzbijanje ove pretjerane aktivacije može pomoći u ublažavanju upalne ozljede pluća.

 

Materijali i metode (sažetak prilagođen istraživanju i razvoju)

Stanična linija i kultura

Stanice A549 uzgajane su uDMEM s niskim sadržajem glukozes10% FBSi1% antibiotika, sa srednjim izmjenama svaka 2 dana. Pokusi su izvedeni na~80–90% konfluencija.

Reagensi (visoka razina)

ECH(podaci o dobavljaču navedeni u izvornom radu)

LPS

RocA(ovdje se koristi kaocGAS–STING aktivator puta)

Kompleti za analizu: MTT, EdU, pribor za apoptozu (Annexin V‑FITC/PI), kompleti ELISA za TNF‑ i IL‑6

Molekularni testovi: ekstrakcija RNA, reverzna transkripcija, qRT‑PCR reagensi; antitijela za Western blot (PCNA, Bax, Bcl‑2, cGAS, STING, TBK1, IRF3, GAPDH)

Odabir doze (provjera održivosti)

ECH (0-24 μmol/L)pokazaonema značajne citotoksičnostiu stanicama A549 i prema tome9/12/24 μmol/Lkorišteni su.

RocAbio netoksičan iznutra0–12 nmol/L, dok je veća koncentracija smanjila sposobnost preživljavanja;12 nmol/Lje odabran.

Indukcija i grupiranje LPS ozljede

Ozljeda LPS-a izazvana je s30 mg/L LPS.

Grupe liječenja bile su kako je opisano u sažetku (kontrola; LPS; LPS+ECH niska/srednja/visoka; LPS+ECH visoka+RocA).

Mjerenja ishoda

Proliferacija:EdU-pozitivne stanice fluorescentnom mikroskopijom; PCNA pomoću Western blota.

Apoptoza:Protočna citometrija (Annexin V‑FITC/PI); Bax i Bcl‑2 razine proteina.

Medijatori upale:TNF‑ i IL‑6 u supernatantu kulture pomoću ELISA.

Izraz putanje:cGAS i STING mRNA pomoću qRT‑PCR pomoću GAPDH kao unutarnje kontrole; proteina (cGAS, STING, TBK1, IRF3) Western blotom.

Statistika:ANOVA sa SNK‑q post-hoc testiranjem (GraphPad Prism 9.0), značaj postavljen na P<0.05P<0.05P<0.05.

 

Rezultati (što se promijenilo s LPS, ECH i RocA)

1) Prozor održivosti/toksičnosti stanica

ECH se dobro podnosio do testiranog raspona korištenog za mehaničke studije.

RocA je zahtijevao oprezno doziranje; odabrana je netoksična radna koncentracija.

Slika 1. Proliferacija stanica A549 u svakoj skupini (EDU bojanje, ×200)

 

2) Proliferaciju je potisnuo LPS, a obnovio ECH

LPS smanjenOsnivanje EdUiPCNAekspresije, što ukazuje na smanjenu proliferativnu aktivnost.

ECH je povećao EdU‑pozitivne stope i PCNAna način ovisan o dozi.

Dodavanje RocA smanjilo je ove dobitke, sugerirajući da put doprinosi ECH-ovom učinku za preživljavanje/pro-proliferaciju.

3) Apoptoza se povećala s LPS-om, a inhibirao ju je ECH

LPS je povećao stopu apoptoze, povećanBax, i smanjio seBcl‑2.

ECH je preokrenuo ove promjene ovisno o dozi (niža stopa apoptoze i Bax, viši Bcl-2).

RocA je pomaknula fenotip natrag prema apoptozi, slabeći ECH zaštitu.

Slika 2. Western blot analiza ekspresije PCNA, Bax i Bcl-2 u svakoj skupini

 

4) ECH je smanjio upalne citokine (TNF‑, IL‑6)

LPS je povisio TNF- i IL-6 u supernatantima.

ECH je smanjio oba citokina ovisno o dozi.

RocA ih je povećao u odnosu na samu visoku dozu ECH, u skladu s reaktivacijom puta koja pojačava upalu.

5) transkripciju cGAS i STING inducira LPS, a potisnu ECH

LPS povećancGAS i STING mRNA.

ECH je smanjio njihovu ekspresiju (ovisno o dozi).

RocA je povećao ekspresiju u usporedbi s visokom dozom ECH.

Slika 3. Usporedba apoptoze stanica A549 u svakoj skupini

 

6) Proteini cGAS–STING puta su regulirani prema dolje pomoću ECH

LPS povećancGAS, STING, TBK1 i IRF3ekspresija proteina.

ECH je smanjio ove proteine ​​ovisno o dozi.

RocA je povećao razine proteina puta naspram same visoke doze ECH.

 

Tablica 3. Usporedba ekspresije proteina cGAS/STING mRNA i cGAS–STING putanje u stanicama A549 među skupinama (xˉ±s\\bar{x}\\pm sxˉ±s, n=6n=6n=6)

Skupina	cGAS mRNA	STING mRNA	cGAS/GAPDH	STING/GAPDH	TBK1/GAPDH	IRF3/GAPDH
Kontrolirati	1.00 ± 0.12	1.00 ± 0.11	0.32 ± 0.07	0.36 ± 0.08	0.29 ± 0.05	0.25 ± 0.06
LPS	2.15 ± 0.16¹	2.28 ± 0.17¹	1.68 ± 0.13¹	1.85 ± 0.16¹	1.57 ± 0.13¹	1.62 ± 0.14¹
ECH-L	1.74 ± 0.13²	1.83 ± 0.14²	1.34 ± 0.12²	1.42 ± 0.13²	1.24 ± 0.11²	1.23 ± 0.12²
ECH-M	1.36 ± 0.11²,³	1.31 ± 0.12²,³	0.82 ± 0.09²,³	1.03 ± 0.11²,³	0.86 ± 0.09²,³	0.78 ± 0.09²,³
ECH-H	0.73 ± 0.09²,³,⁴	0.62 ± 0.08²,³,⁴	0.45 ± 0.08²,³,⁴	0.57 ± 0.09²,³,⁴	0.47 ± 0.08²,³,⁴	0.38 ± 0.07²,³,⁴
RocA	1.58 ± 0.12⁵	1.69 ± 0.15⁵	1.17 ± 0.11⁵	1.28 ± 0.14⁵	1.12 ± 0.10⁵	0.97 ± 0.10⁵

F/P vrijednosti:

cGAS mRNA: 103,612 /<0.001

STING mRNA: 124,857 /<0.001

cGAS/GAPDH: 160,066 /<0.001

STING/GAPDH: 124.141 /<0.001

TBK1/GAPDH: 150.139 /<0.001

IRF3/GAPDH: 158,576 /<0.001

 

Slika 4. Ekspresija proteina cGAS-STING puta u stanicama svake skupine

 

Rasprava (tumačenje za čitatelje proizvoda i mehanizama)

LPS se obično koristi za modeliranje upalne ozljede pluća. Ovdje je LPS izravno oslabio proliferativni kapacitet alveolarnih epitelnih stanica i pospješio apoptozu, praćenu povišenim TNF- i IL-6-dva citokina koji su široko povezani s upalnim oštećenjem pluća.

ECH je djelovao kaocitoprotektivno i protuupalno sredstvou ovom in-vitro okruženju, u skladu s prethodnim izvješćima da ECH može ublažiti oksidativni stres, upalu i apoptozu u kontekstu ozljede pluća.

Čini se da je os cGAS–STING (i nizvodno TBK1/IRF3) mehanički čvor:ECH je smanjio markere puta cGAS–STING, iRocA je otupio prednosti ECH-a, podupirući hipotezu da ECH štiti stanice barem djelomičnoblokiranje pretjerane aktivacije cGAS–STING-a.

Što to sugerira za prirodni botanički razvoj (kontekst Cistanche)

JerCistanche (肉苁蓉)je poznat povisok sadržaj ehinakozida, to je logičan botanički kandidat kada se istražuju ECH-centrirane formulacije usmjerene na upalnu ravnotežu i zaštitu epitela.

Međutim, prevođenje ovoga na dodatke zahtijeva oprez: ovo djelo jestbaziran na staničnoj liniji, koristiLPS ozljedaipročišćeni ECH, i ne utvrđuje učinkovitost kod ljudi, oralnu bioraspoloživost, metabolizam ili klinički relevantno doziranje.

Ograničenja i sljedeći koraci (kao što impliciraju autori)

Nalaze je potrebno potvrditiin vivo ALI/ARDS modelikako bi se potvrdila učinkovitost i mehanička povezanost s cGAS–STING-om u fiziološkim uvjetima.

Daljnji rad bi bio potreban kako bi se mapirali uzvodni okidači i potvrdilo jesu li učinci izravna inhibicija puta u odnosu na sekundarno smanjenje staničnog stresa.

 

Reference (sadržati potpune, kako je navedeno)

Li N, Liu B, Xiong R, et al. Nedostatak HDAC3 štiti od akutne ozljede pluća održavanjem integriteta epitelne barijere kroz očuvanje kontrole kvalitete mitohondrija.Redox Biol, 2023;63(1):102746-61.

Long ME, Mallampalli RK, Horowitz JC. Patogeneza pneumonije i akutne ozljede pluća.Clin Sci (Lond), 2022;136(10):747-69.

Mokrý AD. Akutna ozljeda pluća-od patofiziologije do liječenja.Physiol Res, 2020;69(Dodatak 3):S353-66.

Wang W, Jiang S, Zhao Y, et al. Echinacoside: obećavajući aktivni prirodni proizvodi i farmakološka sredstva.Pharmacol Res, 2023;197(1):106951-66.

Pan Y, Liu Y. Echinacoside ublažava remodeliranje dišnih putova i upalu u neonatalnom mišjem modelu astme izazvanom ovalbuminom modulirajući put SIRT1-NF-κB.Allergol Immunopathol (Madr), 2023;51(4):71-7.

Cui YH, Li KF, Jin B, et al. Ehinakozid inhibira ozljedu plućnih epitelnih stanica izazvanu bleomicinom i upalni odgovor.Kineski časopis za patofiziologiju, 2021;37(11):2024-30.

Xie W, Deng L, Lin M, et al. Sirtuin1 posreduje u zaštitnim učincima ehinakozida protiv akutne ozljede pluća izazvane sepsom putem regulacije osi NOX4-Nrf2.Antioksidansi (Basel), 2023;12(11):1925-45.

Alonso Paiva IM, Santos AR, Brito CB, et al. Uloga cGAS/STING puta u kontroliBrucella abortusinfekcija dobivena respiratornim putem.Front Immunol, 2023;14:1116811.

Zhao J, Zhen N, Zhou Q, et al. MREŽE potiču upalnu ozljedu aktiviranjem puta cGAS-STING kod akutne ozljede pluća.Int J Mol Sci, 2023;24(6):5125-45.

Wu X, Jiang Y, Li R, et al. Ficolin B koji izlučuju egzosomi alveolarnih makrofaga pogoršava ozljedu pluća izazvanu bleomicinom putem feroptoze kroz cGAS-STING signalni put.Cell Death Dis, 2023;14(8):577-92.

Zhang SW, Cheng SL, Xing QF. Pahimična kiselina ublažava ozljede epitelnih stanica debelog crijeva kod štakora s ulceroznim kolitisom inhibicijom cGAS-STING signalnog puta.Imunološki časopis(Kina), 2023;39(8):672-80.

Zhang JJ, Li YY, Qin J. lncRNA LUCAT1 cilja na miR-203a-3p kako bi utjecao na apoptozu i upalni odgovor u epitelnim stanicama alveola tipa II izazvanih LPS-om.Imunološki časopis(Kina), 2023;39(8):689-95.

Li J, Deng SH, Li J, et al. Obacunone ublažava feroptozu tijekom akutne ozljede pluća izazvane lipopolisaharidima pojačavajući antioksidativne odgovore ovisne o Nrf2.Cell Mol Biol Lett, 2022;27(1):29-48.

Hong H, Lou S, Zheng F, et al. Hydnocarpin D ublažava akutnu ozljedu pluća izazvanu lipopolisaharidima putem MAPK/NF-κB i Keap1/Nrf2/HO-1 puta.Fitomedicina, 2022;101(1):154143-50.

Sasaki M, Kishimoto M, Itakura Y, et al. Kultura interfaze zrak-tekućina daje osjetljivost na SARS-CoV-2 stanicama alveolarnog epitela A549.Biochem Biophys Res Commun, 2021;577:146-51.

Wang Y, Fan Y, Huang Y, et al. TRIM28 regulira ulazak SARS-CoV-2 u stanice ciljajući ACE2.Stanični signal, 2021;85:110064.

Yang X, Ma L. Naknadno liječenje propofolom inhibira upalni odgovor u LPS-induciranim alveolarnim epitelnim stanicama tipa II.Exp The Med, 2022;23(4):249.

Duan XY, Sun Y, Zhao ZF, et al. Baicalin ublažava ozljedu alveolarnih epitelnih stanica tipa II A549 uzrokovanu LPS-om slabljenjem signalnog puta FSTL1 povećanjem ekspresije miR-200b-3p.Urođeni imuni, 2021;27(4):294-312.

Lei X, Liu X, Yu J, et al. 3-metiladenin ublažava akutnu ozljedu pluća inhibicijom oksidativnog oštećenja i apoptoze.Heliyon, 2024;10(13):e33996.

Li M, Song J, Tang X, et al. Kritične uloge PAI-1 u akutnoj ozljedi pluća izazvanoj lipopolisaharidima.Adv Med Sci, 2024;69(1):90-102.

Jiang T, Yuan D, Wang R, et al. Echinacoside, obećavajući inhibitor sortaze A, u kombinaciji s vankomicinom protiv mišjih modela MRSA-inducirane upale pluća.Med Microbiol Immunol, 2023;212(6):421-35.

Yang Y, Liu Y, Wang Y, et al. Regulacija SIRT1 i njegove uloge u upali.Front Immunol, 2022;13(1):831168-83.

Jiang Z, Jiang Y, Fan J, et al. Inhibicija cGAS-a ublažava akutnu ozljedu pluća izazvanu nanočesticama cinkovog oksida.Toxicol Lett, 2023;373(1):62-75.

Domizio JD, Gulen MF, Saidoune F, et al. Put cGAS-STING pokreće imunopatologiju IFN tipa I kod COVID-19.Priroda, 2022;603(7899):145-51.

Messaoud-nacer Y, Culerier E, Rose S, et al. STING agonist diABZI inducira PAnoptozu i sindrom akutnog respiratornog distresa (ARDS) posredovan DNK.Cell Death Dis, 2022;13(3):269-85.

Wen J, Qin S, Li Y, et al. Flavonoidi dobiveni iz sladića suzbijaju akutnu ozljedu pluća izazvanu LPS-om u miševa inhibicijom cGAS-STING signalnog puta.Food Chem Toxicol, 2023;175(1):113732.

 

O proizvođaču ekstrakta Cistanche (肉苁蓉) (za programere proizvoda)

Za timove koji istražujuNa bazi cistanherazvoj prirodnih sastojaka - posebno standardizirani ekstrakti smješteni okoloehinakozid-podatke o proizvođaču i mogućnostima možete pronaći ovdje:
https://www.xjcistanche.com/about-us