Dodatak arsena u prehrani izaziva oksidativni stres potiskivanjem nuklearnog faktora eritroidnog 2-srodnog faktora 2 u jetrima i bubrezima kokoši nesilica

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

SAŽETAK

Ova studija istraživala je učinke dodataka arsena u prehrani na nosivost, kvalitetu jaja, histopatologiju jetre i bubrega te oksidativni stres u jetri ibubrezi kokoši nesilica. Nadalje, istraživan je put proteina 1 (Keap1) povezanog s nuklearnim faktorom eritroid {{0}} faktor 2 (Nrf2) sličan ECH-u (Keap1) kako bi se otkrio molekularni mehanizam stresa. Pet stotina i dvanaest 40- tjedana starih kokoši nesilica Hyline White nasumično je raspoređeno u 4 skupine s 8 boksa po skupini i 16 kokoši po boksu. Doze arsena primijenjene u 4 skupine bile su 0.95, 20.78, 40.67 i 60.25 mg/kg. Rezultati su otkrili da dodatak arsena u prehrani značajno smanjuje proizvodnju jaja (P, 0.05), prosječnu težinu jaja (P, 0,05), Haughove jedinice (P, 0,05), visinu bjelanjka (P, 0,05) i čvrstoću ljuske jajeta (P, 0,05). Dodatak arsena u prehrani također je potaknuo nakupljanje arsena i histopatološka oštećenja u jetri ibubreg. Sukladno tome, dodatak arsena u prehrani značajno je povećao serumsku alanin aminotransferazu (P, {{0}}.05), aspartat aminotransferazu (P, 0.05) , razine dušika ureje u krvi (P, {{10}}.05) i mokraćne kiseline (P, 0.05). Nakon izlaganja arsenu, aktivnosti superoksid dismutaze (SOD) (P, 0,05), katalaze (P, 0,01), glutation reduktaze (P, 0,05), glutation peroksidaze (P, 0,05) i sadržaj glutationa (P, 0,05) bili su značajno smanjena, dok je razina malondialdehida značajno povećana (P, 0,05) u jetri i bubrezima. Pojavile su se pozitivne korelacije između aktivnosti antioksidativnih enzima i ekspresije gena antioksidativnih enzima u jetri i bubrezima, osim ekspresije gena za mangan superoksid dismutazu u bubrezima i aktivnosti SOD. Dodatno, jetrena i bubrežna ekspresija mRNA Nrf2 bila je u pozitivnoj korelaciji s ekspresijom gena antioksidansa i u negativnoj korelaciji s ekspresijom mRNA Keap1. Ukratko, dodatak arsena u prehrani izazvao je oksidativni stres potiskivanjem puta Nrf2-Keap1 u jetrima i bubrezima kokoši nesilica.

Ključne riječi:arsen, kokoš nesilica, Nrf2-Keap1 put, oksidativni stres, bubrezi

UVOD

Posljednjih godina utvrđeno je da se opasnosti za okoliš pojavljuju u sve većim koncentracijama. Arsen je vrlo metaloidni otrov, čak i u vrlo niskim koncentracijama u hrani za perad. Njegova fiziološka uloga u peradi je dobro definirana, jer je neophodan za sintezu metabolita metionina uključujući cistein. Preporučene koncentracije arsena u hrani za perad su između {{0}}.012 i 0,050 mg/kg (Balo s i sur., 2019.). Međutim, prethodno istraživanje pokazalo je da su koncentracije arsena u hrani za perad vjerojatno iznad razina tolerancije životinja kada hrana za perad sadrži morske alge, bakrov karbonat, bakrov sulfat pentahidrat, dibakrov klorid trihidroksid ili željezni karbonat (Adamse et al., 2017.) . Kazi i sur. (2013.) izvijestili su da postoji velika mogućnost da arsen u hrani za perad utječe na zdravlje tovnih pilića. Prekomjerne količine arsena u hrani za perad i njegovi toksikološki učinci na perad još su uvijek ozbiljni problemi. Kada višak arsena uđe u životinju, može izazvati niz štetnih učinaka na zdravlje, kao što su imunotoksičnost, respiratorna toksičnost, kardiovaskularna toksičnost, hepatotoksičnost, hepatotoksičnost, nefrotoksičnost, neurovirulentnost, reproduktivna toksičnost i genotoksičnost. Toksikološki učinci arsena na visceralne organe prvenstveno su dokumentirani u studijama na sisavcima, što ukazuje na to da arsen predstavlja rizik za funkcije jetre i bubrega (Waalkes i sur., 2004.; Mazumder, 2005.; Zheng i sur., 2014.). Ipak, toksikološki učinci izloženosti arsenu hranom na jetru i bubrege kokoši nesilica još uvijek nisu jasni. Toksičnost arsena kod životinja usko je povezana s oksidativnim stresom koji remeti pro/antioksidacijsku ravnotežu (Flora, 2011.). Kada arsen uđe u stanicu, veže se s intracelularnim glutationom (GSH) ili ga oksidira, što dovodi do stvaranja slobodnih radikala. Kao što znamo, citoprotektivne gene može regulirati niz intracelularnih transkripcijskih faktora, uključujući nuklearni faktor eritroid 2-srodan faktor 2 (Nrf2), aktivatorski protein 1 i nuklearni faktor kappa-B (Kwak et al., 2001. ). Transkripcijski faktor Nrf2 vitalna je molekula koja regulira razinu stresa u stanicama. Pod mirnim uvjetima, Nrf2 stupa u interakciju s proteinom 1 (Keap1) koji je povezan s ECH-om sličnim Kelchu, koji se uglavnom nalazi u citoplazmi. Kada se pokrene oksidativni stres, Nrf2 prelazi iz citoplazme u jezgru nakon odvajanja od molekule Keap1 i zatim aktivira ekspresiju citoprotektivnih gena (Motohashi i Yamamoto, 2004.). Nakon toga, citoprotektivni geni dalje reguliraju aktivnosti nizvodnih antioksidativnih enzima, uključujući superoksid dismutazu (SOD), glutation reduktazu (GR), glutation peroksidazu (GSH-Px) i katalazu (CAT). Prethodna studija pokazala je da transkripcijski faktor Nrf2 sudjeluje u stresu izazvanom arsenom kod sisavaca (Sinha et al., 2013.). Međutim, točni učinci izloženosti arsenu na učinke oksidativnog stresa kod kokoši nesilica ostaju nepoznati. U ovoj studiji istraživali smo učinak dodataka arsena u prehrani na nesivost, kvalitetu jaja, biokemijske indekse seruma, histopatološke promjene jetre i bubrega te oksidativni stres u kokoši nesilica. Nadalje, istražen je put Nrf2-Keap1 kako bi se identificirao molekularni mehanizam u jetri ibubregakokoši nesilica. Ova studija daje neke uvide u biološku teoriju o prekomjernoj toksičnosti arsena u prehrani u jetri ibubregkokoši nesilica.

cistanche redditdoublažiti bolove bubrega

MATERIJALI I METODE

Ovu studiju odobrio je Institucionalni odbor za skrb i korištenje životinja. Svi eksperimentalni postupci provedeni na životinjama provedeni su u skladu s Kineskom udrugom za laboratorijske životinjske znanosti.

Životinje, prehrana i dizajn pokusa

Petsto dvanaest {{0}} tjedana starih Hyline White kokoši nesilica sa sličnim tjelesnim stanjem nasumično je odabrano i razdvojeno u 4 skupine. Svaka grupa je sadržavala 8 replika od 16 ptica. Arsen je dodan osnovnoj prehrani kukuruznim grahom u 4 različite koncentracije (0, 20, 40 i 60 mg/kg; u obliku arsanilne kiseline) (dodatna tablica 1). Koncentracije arsena u hrani su mjerene atomskom apsorpcijskom spektrometrijom hidridne generacije prema prethodnoj metodologiji (Dos Passos i sur., 2012.). Stvarne koncentracije arsena u 4 skupine bile su 0,95, 20,78, 40,67 i 60,25 mg/kg. Ptice su držane u kavezima (60 ! 50 ! 50 cm3) opremljenim s 1 hranilicom i 2 nipl pojilice, au kavezu su bile smještene 2 kokoši. Tijekom cijelog pokusnog razdoblja kokoši su imale slobodan pristup hrani i piću. Cijeli eksperiment trajao je 10 tjedana, uključujući 1-tjedno razdoblje prilagodbe i 9-tjedno formalno eksperimentalno razdoblje.

Nesivost i kvaliteta jaja

Tijekom cijelog pokusnog razdoblja svakodnevno su bilježeni indeksi nosivosti, uključujući potrošnju hrane, proizvodnju jaja i masu jaja (EW). Određivanje unosa hrane i EW u svakoj skupini provedeno je pomoću osjetljive vage za težinu (XS2002S, Mettler Toledo, Zurich, Švicarska). Omjer konverzije hrane (FCR) izračunat je prema sljedećoj formuli: FCR 5 unos hrane u gramima/masa jaja u gramima. Ukupno 40 jaja iz svake skupine nasumično je sakupljeno za mjerenje parametara kvalitete jaja unutar 24 sata od polaganja jaja na kraju eksperimenta. Jaja su izvagana pomoću osjetljive vage (XS2002S, Mettler Toledo). Nakon toga, Haugh jedinica, visina bjelanjka, boja žumanjka i čvrstoća ljuske jaja određeni su digitalnim testerom za jaja (DET6000, Nabel Co. Ltd., Kyoto, Japan). Debljina ljuske jajeta s unutarnjom membranom određena je na oštrom, srednjem i tupom dijelu jajeta pomoću mikrometra s brojčanikom(547-350, Mitutoyo, Kawasaki, Japan), a srednje vrijednosti korištene su za statističku analizu.

Zbirka uzoraka

Nakon eksperimenta uzgoja, 32 ptice iz svake skupine su nasumično odabrane i eutanazirane rezanjem vratnih vena. Uzorci krvi skupljeni su u sterilne epruvete za centrifugiranje i odmah transportirani u laboratorij za mjerenje biokemijskih indeksa seruma. Nakon toga, ptice su secirane, a jetra ibubregaizvađeni su iz trbušne šupljine. Jetra ibubreguzorci su izrezani na 4 dijela. Jedan dio je odmah fiksiran u 4 posto paraformaldehida za histopatološku pretragu. Ostala 3 dijela odmah su pohranjena u tekućem dušiku za daljnje određivanje parametara oksidativnog stresa, taloženja arsena i ekspresije gena.

Ispitivanje taloženja arsena

Nakon mjerenja kvalitete jaja žumanjak je odvojen od bjelanjaka. Akumulacija arsena u bjelanjku i žumanjku mjerena je atomskom apsorpcijskom spektrometrijom generacije hidrida prema prethodnoj metodologiji (Dos Passos i sur., 2012.). Nakupljanje arsena u cijelom jajetu izračunato je zbrajanjem sadržaja arsena u bjelanjku i žumanjku. Na sličan način, atomska apsorpcijska spektrometrija stvaranja hidrida korištena je za određivanje nakupljanja arsena u jetri ibubreg kokoši nesilica(Dos Passos i sur., 2012.).

Određivanje biokemijskih indeksa seruma

Razine ukupnih proteina, albumina, globulina, alanin aminotransferaze (ALT) i aspartat aminotransferaze (AST) važni su pokazatelji za procjenu funkcije jetre. Ovi su parametri izmjereni korištenjem odgovarajućih kompleta za ispitivanje (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kina) u skladu s uputama proizvođača. Razine dušika ureje u krvi (BUN), mokraćne kiseline (UA) i kreatinina (CT) važni su pokazatelji za procjenu funkcije bubrega i određene su pomoću pribora za otkrivanje (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute).

Histopatološke promjene

Tkiva jetre i bubrega fiksirana u 4 posto paraformaldehida su dehidrirana u 70, 80, 90, 95 i 100 postotnom etanolu i na kraju uklopljena u parafin. Tkiva su izrezana na dijelove debljine 6- mm i zatim obojena hematoksilinom i eozinom. Nakon toga, opažanja histopatoloških promjena u jetri ibubregtkiva izvršio je patolog pod optičkim mikroskopom (Olympus, Melville, NY).

Testovi lipidne peroksidacije (LPO) i antioksidativne enzimske aktivnosti

Aktivnosti SOD, CAT, GR i GSH-Px te sadržaj malondialdehida (MDA) i GSH u jetri i bubrezima određeni su odgovarajućim setovima za analizu (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). Ukratko, sadržaj MDA mjeren je spektrofotometrijskom metodom koja se temelji na reakciji između tiobarbiturne kiseline i MDA (Janero, 1990.). GR aktivnost i sadržaj GSH određeni su korištenjem 5,5- ditiobis(2-nitrobenzojeve kiseline) (Carlberg i Mannervik, 1985; Abegg i sur., 2012). Aktivnost SOD određena je prema inhibitornoj reakciji između redukcije nitroplavog tetrazolija i ksantin oksidaze. Aktivnost CAT određena je na temelju stvaranja stabilnog hidrogen peroksid amonij molibdat kompleksa (Aebi, 1984). Aktivnost GSH-Px određena je procjenom redukcije t-butil hidroperoksida (Wheeler et al., 1990).

Totalna RNA izolacija i kvantitativni PCR u stvarnom vremenu

Ukupna RNA izolirana je iz tkiva jetre i bubrega pomoću Trizol RNAiso Kita (Invitrogen, Carlsbad, CA) prema uputama proizvođača. Uzorci RNA su obrnuto transkribirani u cDNA korištenjem PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa, Dalian, Kina). Prednji i obrnuti primeri za mangan superoksid dismutazu (MnSOD), bakar-cink superoksid dismutazu (CuZnSOD), CAT, GR, GSH-Px, Nrf2, Keap1 i gen za domaćinstvo (b-aktin) prikazani su u Dodatnoj tablici 2. Obilje gena mjereno je StepOnePlus Real-Time PCR sustavom (ABI 7500, Applied Biosystems, Foster City, CA). Uvjeti ciklusa bili su 95 C tijekom 30 s, nakon čega je slijedilo 35 ciklusa od 95 C tijekom 5 s, 59 C tijekom 10 s i 72 C tijekom 30 s. Višestruka razlika u ekspresiji mRNA izmjerena je metodom relativne kvantifikacije uz korištenje učinkovitosti PCR-a u stvarnom vremenu i normalizirana na razinu b-aktina, kako bi se usporedile relativne CT promjene među svim skupinama (Livak i Schmittgen, 2001.).

Statističke analize

Svi podaci su izraženi kao srednja vrijednost 6 SE. Statistička analiza provedena je jednosmjernom ANOVA koristeći SPSS verziju 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Kada su razlike između grupa bile značajne (označene s P, 0.05), srednje vrijednosti su uspoređivane s Tukeyjevom iskreno značajnom razlikom za post hoc višestruke usporedbe. Pearsonove korelacije analizirane su bivarijatnom korelacijskom analizom (SPSS verzija 20.0, SPSS Inc.). Koeficijenti značajnosti i korelacije predstavljeni su kao "p" odnosno "r".

REZULTATI

Učinkovitost nesivosti i kvaliteta jaja U usporedbi s onima u skupini s {{0}}.95 mg/kg arsena, proizvodnja jaja na dan kokoši i EW bili su značajno smanjeni u 6{0.25 mg/ kg skupine arsena (P, 0.05). Međutim, arsen u prehrani nije utjecao na unos hrane ili FCR (Tablica 1). U usporedbi s onom u skupini {{20}}.95 mg/kg arsena, Haughova jedinica bila je značajno smanjena u 40.67 mg/kg (P, 0,05) i 60,25 mg /kg (P, 0,05) arsenskih skupina. Nadalje, i visina bjelanjka i čvrstoća ljuske jajeta značajno su smanjeni u skupini koja je primala arsena od 20,78 mg/kg u usporedbi sa skupinom koja je primala 0,95 mg/kg arsena (P, 0,05), dosegnuli su plato u skupini koja je primala 40,67 mg/kg arsena i oštro su se smanjili u skupini koja je primala 60,25 mg/kg skupine arsena (P, 0,05). Dijetalni arsen nije utjecao na boju žumanjka ili debljinu ljuske jajeta (Tablica 1)

Taloženje arsena

Taloženje arsena u bjelanjku (P, {{0}}.05), žumanjku (P, 0.05) i cijelom jajetu (P, 0.05) značajno se povećao kako se doza arsena u prehrani povećala s 0,95 na 60,25 mg/kg (Tablica 2). Slično, s povećanjem doze arsena iz hrane s 0,95 na 60,25 mg/kg, taloženje arsena u jetri (P, 0,05) i bubrezima (P, 0,05) značajno se povećalo (tablica 2)

Analiza korelacije između kvalitete jaja i taloženja arsena u jajetu

Taloženje arsena u bjelančevinama negativno je korelirano s Haughovom jedinicom (r {{0}}.622, P, 0.{{10}}1), bjelančevina visina (r 5 20.878, P, 0.01) i čvrstoća ljuske jajeta (r 5 20.897, P, 0.{{ 30}}1). U međuvremenu, taloženje arsena u žumanjku također je negativno povezano s Haughovom jedinicom (r 5 20.654, P, 0.01), visinom bjelanjka (r 5 20.893, P, 0.01) i čvrstoća ljuske jajeta (r 5 20.902, P, 0,01). Slično tome, pronađeni su negativni odnosi između taloženja arsena u cijelom jajetu i Haughove jedinice (r 5 20.640, P, 0.01), visine albumena (r 5 20.888, P, 0.01) i čvrstoća ljuske jajeta (r 5 20.902, P, 0,01) (Tablica 3)

Biokemijski indeksi seruma

U usporedbi s onima u skupini koja je primala {{0}}.95 mg/kg arsena, razine ALT bile su značajno povećane u skupini od 2{0.78 mg/kg (P , 0.{). {16}}5), 40.67 mg/kg (P 0,05) i 60,25 mg/kg (P 0,05) arsenskih skupina. U međuvremenu, razine AST-a u skupini s 60,25 mg/kg arsena bile su značajno povećane u usporedbi s onima u skupini s 0,95 mg/kg arsena (P, 0,05). Dijetalni arsen nije utjecao na ukupne proteine ​​ili razine albumina u serumu (Tablica 4).

U usporedbi s onima u skupini koja je primala {{0}}.95 mg/kg arsena, razine BUN i UA bile su značajno povećane u skupini koja je primala 60,25 mg/kg arsena (P, 0,05), dok izloženost arsenu hranom nije utječu na razinu CT u serumu (Tablica 4).

Histopatološke promjene

Izgled jetrenog tkiva bio je normalan i nepromijenjen u skupini {{0}}.95 mg/kg arsena. Međutim, kako se doza prehrambenog arsena povećala s 20,78 na 60,25 mg/kg, proliferacija žučnog kanala, steatoza hepatocita i deformacija središnje vene postali su ozbiljniji (slike 1A-1D). Izgled bubrežnog tkiva bio je normalan i nepromijenjen u skupini koja je primala 0,95 mg/kg arsena. Međutim, došlo je do ozbiljnog skupljanja glomerula u skupini koja je primala 20,78 mg/kg arsena u usporedbi sa skupinom koja je primala 0,95 mg/kg arsena. Kako se doza arsena u prehrani povećala s 40,67 na 60,25 mg/kg, proširenje bubrežnih tubula, tubularna fibroza i hijalinizacija postali su ozbiljniji (slike 1E-1H).

Biomarkeri oksidativnog stresa

U usporedbi s onima u skupini s {{0}}.95 mg/kg arsena, razine MDA u jetri bile su značajno povećane u skupini s 6{0.25 mg/kg arsena (P, {{12} }.05), a bubrežne razine MDA bile su značajno povećane kod arsena od 20,78 mg/kg (P 0,05), 40,67 mg/kg (P 0,05) i 60,25 mg/kg (P 0,05). skupine (Slika 2A). Razine GSH u jetri ibubregznačajno smanjen u skupini s 20.78 mg/kg arsena u usporedbi s onima u skupini s 0.95 mg/kg arsena (P, 0.05) , a na platou u skupinama 40.67 i 60.25 mg/kg arsena (Slika 2B). Aktivnost SOD u jetri bila je značajno smanjena u skupinama s arsenom od 40,67 mg/kg (P, 0,05) i 60,25 mg/kg (P, 0,05) u usporedbi sa skupinom s arsenom od 0,95 mg/kg. Bubrežna aktivnost SOD bila je značajno smanjena u skupini koja je primala 20,78 mg/kg arsena u usporedbi sa skupinom koja je primala 0,95 mg/kg arsena (P, 0,05) i dosegla plato u skupinama koje su primale 40,67 i 60,25 mg/kg arsena (Slika 2C). CAT aktivnost u jetri ibubregznačajno se smanjio kako se doza arsena u prehrani povećala s {{0}}.95 na 60.25 mg/kg (P, 0.05, slika 2D). U usporedbi s onom u skupini koja je primala 0.95 mg/kg arsena, GR aktivnost u jetri i bubrezima bila je značajno smanjena u skupini koja je primala 60.25 mg/kg arsena (P, 0.05, slika 2E). ). Osim toga, u usporedbi sa skupinom koja je primala 0,95 mg/kg arsena, aktivnost jetrenog GSH-Px bila je značajno smanjena u skupini koja je primala 60,25 mg/kg arsena (P, 0,05), a aktivnost bubrežnog GSH Px naglo je smanjena u skupini koja je primala 20,78 mg/kg arsena. (P, 0,05) i dosegao plato u skupinama s 40,67 i 60,25 mg/kg arsena (Slika 2F).

Ekspresija gena antioksidativnih enzima, Nrf2 i Keap1 molekula

Ekspresija gena CuZnSOD u jetri bila je značajno smanjena u skupini koja je primala 20.78 mg/kg arsena u usporedbi sa skupinom koja je primala 0.95 mg/kg arsena (P, 0.{{16} }5) i na platou u skupinama 40.67 i 60.25 mg/kg arsena. Bubrežna ekspresija CuZnSOD gena bila je značajno smanjena u 40.67 mg/kg (P , 0.05) i 60.25 mg/kg (P , 0.05) grupe arsena u usporedbi sa skupinom arsena 0.95 mg/kg (Slika 3A). U usporedbi sa skupinom koja je primala 0.95 mg/kg arsena, ekspresija gena MnSOD u jetri bila je značajno smanjena u skupini koja je primala 20.78 mg/kg arsena (P, 0.{{73 }}5) i na platou u skupinama 4{{80}}.67 i 60.25 mg/kg arsena. Bubrežna ekspresija MnSOD gena nije se značajno razlikovala među skupinama (Slika 3B). Ekspresija jetrenog CAT gena bila je značajno smanjena u skupini koja je primala 20,78 mg/kg arsena u usporedbi sa skupinom koja je primala {{105}},95 mg/kg arsena (P, 0,05) i dosegla plato u skupinama s 40,67 i 60,25 mg/kg arsena. Ekspresija renalnog CAT gena bila je značajno smanjena u skupini koja je primala arsena od 20,78 mg/kg u usporedbi sa skupinom koja je primala 0,95 mg/kg arsena (P, 0,05) i dosegla plato u skupini koja je primala 40,67 mg/kg arsena, a oštro je smanjena u skupini koja je primala 60,25 mg/kg skupinu s arsenom u usporedbi sa skupinom s 0,95 mg/kg arsena (P, 0,05, slika 3C). Ekspresija GR gena u jetri i bubrezima bila je značajno smanjena u skupini koja je primala arsena od 20,78 mg/kg u usporedbi sa skupinom koja je primala 0,95 mg/kg arsena (P, 0,05) i dosegla plato u skupinama koje su primale 40,67 i 60,25 mg/kg arsena (Slika 3D). Uz to, ekspresija gena GSH-Px u jetri značajno se smanjila kako je doza arsena u prehrani porasla s 0,95 na 40,67 mg/kg (P, 0,05), a zatim je dosegla plato u skupini koja je primala 60,25 mg/kg arsena. Bubrežna ekspresija GSH-Px gena značajno se smanjila u skupini koja je primala 20,78 mg/kg arsena u usporedbi sa skupinom koja je primala 0,95 mg/kg arsena (P, 0,05) i dosegla plato u skupinama koje su primale 40,67 i 60,25 mg/kg arsena (Slika 3E). Ekspresija gena Nrf2 u jetri i bubrezima bila je značajno smanjena u skupini koja je primala arsena od 20,78 mg/kg u usporedbi sa skupinom koja je primala 0,95 mg/kg arsena (P, 0,05) i dosegla plato u skupinama koje su primale 40,67 i 60,25 mg/kg arsena (slike 4A i 4C). ). Nasuprot tome, ekspresija gena Keap1 u jetri i bubrezima bila je naglo povećana u skupini koja je primala arsena od 20,78 mg/kg u usporedbi sa skupinom koja je primala 0,95 mg/kg arsena (P, 0,05) i dosegla plato u skupinama koje su primale 40,67 i 60,25 mg/kg arsena (slike 4B i 4D).

Korelacijske analize povezane s Nrf2- Keap1 stazom

Ekspresija gena CuZnSOD (jetra, r {{0}}.613, P, 0,01;bubreg, r {{0}}.687, P , 0.{{10}}1), CAT (jetra, r 5 0.738, P , 0.01; bubreg, r 5 0.903, P , 0.01), GR (jetra, r 5 0.477, P, 0,05; bubreg, r 5 0.485, P, 0,05) i GSH-Px (jetra, r 5 0.450, P, 0,05; bubreg , r 5 0.767, P, 0,01) u jetri i bubrezima, i ekspresija patičnog MnSOD gena (r 5 0,707, P, 0,01) bili su u pozitivnoj korelaciji s aktivnostima njihovih odgovarajućih antioksidativni enzimi. Nadalje, ekspresija gena Nrf2 bila je u pozitivnoj korelaciji s ekspresijom gena CuZnSOD (jetra, r 5 0.756, P, 0,01;bubreg, r {{0}},736, P, 0,01), CAT (jetra, r 5 0,893, P, 0,01;bubreg, r {{0}}.740, P , {{10}}.01), GR (jetra, r 5 0 0,837, P, 0,01; bubreg, r 5 0,915, P, 0,01) i GSH-Px (jetra, r 5 0,822, P, 0,01; bubreg, r {{17} }.722, P, 0,01) u jetri ibubregi ekspresija gena MnSOD u jetri (r {{0}}.720, P, 0,01). Postojala je negativna korelacija između ekspresije mRNA Nrf2 i Keap1 (jetra, r 5 20.746, P, 0,01;bubreg, r {{0}}.771, P , 0,01) u jetri i bubrezima. Osim toga, nije bilo korelacije između ekspresije gena MnSOD i enzimske aktivnosti SOD, ili ekspresije mRNA Nrf2 ububrezi kokoši nesilica(Tablica 5).

RASPRAVA

Arsen je u prirodi sveprisutan i toksičan metaloid. Izaziva nekoliko toksikoza kod ljudi i životinja, uključujući hepatotoksičnost, nefrotoksičnost, neurovirulentnost, imunotoksičnost, kardiovaskularnu toksičnost, hepatotoksičnost i reproduktivnu toksičnost (Mandal i Suzuki, 2002.). Arsen najjače cilja na reproduktivni sustav životinja. Prethodne studije pokazale su da izloženost roksarsonu hranom remeti nesivost i proizvodnju jaja (Chiou i sur., 1999.; Zhang i sur., 2017.). U ovoj studiji dodatak arsena u prehrani značajno je smanjio nesivost, uključujući proizvodnju jaja i EW. Prethodne studije su otkrile da dodatak arsena u prehrani potiče nakupljanje arsena u jajima i smanjuje kvalitetu jaja (Chiou i sur., 1998.; Zhang i sur., 2017.). U ovoj studiji, dodatak arsena u prehrani značajno je smanjio Haughovu jedinicu, visinu bjelančevine i čvrstoću ljuske jajeta. Osim boje žumanjka i debljine ljuske jajeta, utvrđene su negativne korelacije između taloženja arsena u jajima i parametara kvalitete jaja. To sugerira da bi Haughova jedinica, visina bjelanjka i čvrstoća ljuske jajeta mogli biti pod utjecajem taloženja arsena u jajetu. Kao što znamo, debljina palisadnog sloja u ljusci jajeta je determinanta debljine ljuske jajeta (Ruiz i Lunam, 2000), dok taloženje pigmenta određuje boju žumanjka. Stoga smo nagađali da dodatak arsena u prehrani možda neće utjecati na debljinu sloja palisade taloženog pigmenta u jajima kokoši nesilica. Novi dokazi pokazuju da su jetreni i bubrežni poremećaji česti kod sisavaca nakon izlaganja arsenu (Liu i Waalkes, 2008.; Huang et al., 2009.). Prethodno istraživanje pokazalo je da izloženost arsenu izaziva histopatološke lezije u jetri, uključujući dezorijentaciju tkiva, peliozu i vakuolizaciju praćenu kariolizom, apoptozom i nekrozom hepatocita u Channa punctatus (Roy i Bhattacharya, 2006.). U ovoj smo studiji uočili ozbiljne promjene u proliferaciji žučnog kanala, steatozu hepatocita i deformaciju središnje vene u jetri kako se doza arsena u prehrani povećavala s 20,78 na 60,25 mg/kg. Roy i Bhattacharya (2006.) također su otkrili da izloženost arsenu uzrokuje skupljanje glomerula, nepravilnosti u bubrežnom tubulu i povećanje Bowmanova prostora. U ovom istraživanju, kao doza arsena u prehrani

porasla s 20,78 na 60,25 mg/kg, bubrežne histopatološke promjene bile su vrlo ozbiljne, uključujući povećanje bubrežnih tubula, skupljanje glomerula te tubularnu fibrozu i hijalinizaciju, što je u skladu s prethodnom studijom (Roy i Bhattacharya, 2006.). Prema prethodnim izvješćima, dokazano je da su razine AST i ALT u serumu surogat markeri jetrene upalne reakcije i fifibroze (Wang i sur., 2008.; Khattab i sur., 2015.). U ovoj studiji, povećanje razina AST i ALT u serumu impliciralo je da je jetreni upalni odgovor pojačan nakon izlaganja arsenu, što je bilo u skladu s uočenim histopatološkim promjenama u jetri kokoši nesilica. Patel i Kalia (2013.) također su otkrili da se hepatotoksičnost izazvana arsenom očituje povećanjem serumskih razina ALT i AST u Wistar štakora. Bubrežna funkcija se rutinski prati razinama BUN, CT i UA u serumu. Otkrili smo da su razine BUN i UA u serumu bile značajno povećane, a razina CT u serumu imala je tendenciju porasta nakon prehrambenog dodatka arsena, što implicira dabubregšteterezultat je izloženosti arsenu kod kokoši nesilica, što je u skladu s prethodnim istraživanjima (Liu i sur., 2000.). Dobro je utvrđeno da je oštećenje tkiva izazvano izloženošću arsenu usko povezano s oksidativnim stresom (Jomova i sur., 2011.). Kada se pokrene oksidativni stres, intracelularne reaktivne kisikove vrste (ROS) induciraju LPO, što se može pratiti unutarstaničnim razinama MDA (Storey, 1996.). U ovoj studiji, jetrene i bubrežne razine MDA bile su značajno povećane nakon dijetetskog dodatka arsena, što implicira da je došlo do povećanja LPO, što je moglo ukazivati ​​na oksidacijsku štetu u jetri ibubrezi kokoši nesilica.GSH također igra vitalnu ulogu u regulaciji intracelularnog oksidativnog stresa (Finkel i Holbrook, 2000). U usporedbi s onima u skupini s 0,95 mg/kg arsena, razine GSH

su značajno smanjeni u skupinama liječenim višim koncentracijama arsena, što sugerira da bi se arsen mogao vezati s GSH kako bi oslabio antioksidativne sposobnosti jetre ibubreg.Flora i sur. (1997) izvijestili su da izloženost arsenu smanjuje koncentraciju GSH i proizvodi izražene lezije u jetri ibubregaštakora. Osim toga, unutarstanični antioksidativni enzimski sustavi daju zaštitnu ulogu u zaštiti od oksidativnog stresa, uključujući SOD, CAT, GR i GSH-Px (Finkel i Holbrook, 2000.). U ovoj studiji, dodatak arsena u prehrani značajno je smanjio aktivnosti SOD, CAT, GR i GSH-Px u jetrima i bubrezima kokoši nesilica. Kada antioksidativni sustavi ne mogu neutralizirati višak unutarstaničnog ROS-a, dolazi do oksidativnog oštećenja zbog LPO, što bi zauzvrat moglo oslabiti aktivnosti antioksidativnih enzima. Prethodno istraživanje na sličan je način izvijestilo da arsen izaziva oksidativni stres u bubrezima štakora (Sener et al., 2016.). Antioksidativni enzimi su proteini i mogu biti regulirani genima na transkripcijskoj razini. U ovoj studiji, izloženost arsenu je značajno smanjila ekspresiju mRNA CuZnSOD, CAT, GR i GSHPx. Nadalje, ekspresija gena CuZnSOD, CAT, GR i GSH-Px bila je u pozitivnoj korelaciji s aktivnostima antioksidativnih enzima, što implicira da je izloženost arsenu smanjila aktivnosti antioksidativnih enzima inhibicijom ekspresije mRNA. Slično su zabilježene korelacije između aktivnosti antioksidativnih enzima i ekspresije gena u jetrima i bubrezima kokoši nesilica nakon izlaganja živi. Međutim, dodatak arsena u prehrani nije utjecao na ekspresiju MnSOD ububreg.To je moglo biti zato što SOD ima nekoliko izoenzima, a na njegovu aktivnost ne utječe gen MnSOD. Nrf2 igra vitalnu ulogu u obrambenom sustavu od oksidativnog stresa. Pod bazalnim uvjetima, Nrf2 se veže za Keap1 u citoplazmi. Jednom kada je unutarstanična razina ROS-a dovoljno visoka da modificira reaktivne tiolne skupine Keap1, Nrf2 se mnogo lakše translocira u jezgru, gdje iritira stanice koje reagiraju na antioksidanse

element i zatim aktivira nizvodne zaštitne gene (Sinha et al., 2013). U ovoj smo studiji otkrili da je izloženost arsenu značajno smanjila ekspresiju Nrf2 gena i ekspresiju nizvodnih antioksidativnih enzima. Niža regulacija Nrf2 i nizvodno gena antioksidativnog enzima nakon izlaganja arsenu sugerira da arsen inhibira ekspresiju gena antioksidativnog enzima potiskivanjem ekspresije gena Nrf2 u jetri ibubreg. Uz to, pojačanje ekspresije gena Keap1 bilo je u negativnoj korelaciji s ekspresijom gena Nrf2 i antioksidativnog enzima, što implicira da pojačana regulacija citoplazmatskog Keap1 potiče translokaciju Nrf2 iz citoplazme u jezgru (Kensler et al., 2007.). Slična je studija objavila da je unutarstanični put Nrf2-Keap1 inaktiviran kao odgovor na izloženost arsenu (Janasik et al., 2018.). Usprkos tome, prethodna studija također je objavila da izloženost arsenu pojačava put Nrf2-Keap1 za zaštitu od oksidativnog oštećenja (Massrieh et al., 2006.). Ovi nalazi nisu u suprotnosti s ovom studijom. U ranim fazama oksidativnog stresa, zaštitni učinci Nrf2-Keap1 mogu se aktivirati kako bi se spriječio oksidativni stres. Bez obzira na to, put Nrf2-Keap1 možda neće odoljeti oksidativnim oštećenjima izazvanim trajnim izlaganjem visokim dozama arsena (Kensler et al., 2007.). Nakon toga bi put Nrf2- Keap1 mogao biti inhibiran, a u jetrima i bubrezima kokoši nesilica može doći do intracelularnog oksidativnog oštećenja ili čak apoptoze. S obzirom na sadašnje rezultate, ova studija daje neke nove dokaze za antioksidacijsku obranu jetre i bubrega pod izloženošću arsenu kod kokoši nesilica i po prvi put razjašnjava središnju ulogu puta Nrf2-Keap1 u oksidativnom stresu izazvanom arsenom . Ukratko, dodatak arsena u prehrani smanjio je nesivost i kvalitetu jaja kokoši nesilica. Histopatološka oštećenja nastala su u jetri ibubregnakon izlaganja arsenu hranom. Osim toga, izloženost arsenu u ishrani izazvala je jetreni i bubrežni oksidativni stres ometanjem puta Nrf2-Keap1 kod kokoši nesilica.