Određivanje ehinakozida u vodenom ekstraktu Cistanche Herba pomoću HPLC

Sažetak:

Cilj HPLC metoda uspostavljena je zaodređivanje ehinakozidauvodeni ekstrakt Cistancheherba.

Metode Echinacoside je određen HPLC-om. Razdvajanje je provedeno na koloni Inertsil ODS-SP C18 s mobilnom fazom koja se sastoji od acetonitrila (A) i 0.4% otopine fosforne kiseline (B), gradijentnom elucijom. Valna duljina detekcije postavljena je na 333 nm, a temperatura stupca bila je 30 stupnja. Brzina protoka bila je 1,0 mL·min-1, a volumen injekcije bio je 10 μL. Rezultati Linearni odnos ehinakozida unutar raspona koncentracije od 44.939 7-539.276 4 ug ·mL- 1 bio je dobar (r=0.999 8). Oporavici su bili 94,59%-105.31% (RSD= 2.93%,n=9). Sadržaj ehinakozida u vodenim ekstraktima Cistanche herba bio je 15,527,7,347,12,267 mg·g-1. Zaključak Utvrđena HPLC metoda s dobrom ponovljivošću je točna, jednostavna i izvediva. Pogodan je za određivanje ehinakozida u vodenom ekstraktu Cistanche herba.

Ključne riječi:HPLC;vodeni ekstrakt Cistanche herba; ehinakozid; određivanje sadržaja

Cistanche deserticola je tonik tradicionalne kineske medicine koji se obično koristi u kliničkoj praksi i poznat je kao "pustinjski ginseng" [1]. Cistanche deserticola zabilježena u izdanju Kineske farmakopeje iz 2015. je osušena mesnata stabljika s ljuskastim listovima Cistanche deserticola YC Ma ili Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Topla je, slatka i slana, vraća se u meridijane bubrega i debelog crijeva. Ima učinke njegovanja yanga bubrega, obnavljanja esencije i krvi, vlaženja crijeva i laksativa [2]. "Shen Nongova Materia Medica" kaže da može "tonizirati sredinu, nahraniti pet unutarnjih organa, ojačati yin i nahraniti esenciju". Cistanche deserticola uglavnom sadrži feniletanoidne glikozide, iridoide i njihove glikozide, lignane i njihove glikozide, polisaharide, esterske spojeve i alkaloide [3]. Feniletanol glikozidi su glavni aktivni sastojci Cistanche deserticola. Među njima su ehinakozid i verbaskozid navedeni u Cistanche deserticola u Kineskoj farmakopeji.

Indikativne komponente za identifikaciju i određivanje sadržaja. Farmakološke studije [4] pokazuju da Cistanche deserticola ima različite farmakološke učinke poput laksativa, zaštite jetre, protiv osteoporoze, antioksidansa, protiv starenja i umora. Vodeni ekstrakt Cistanche deserticola može pospješiti ekspresiju gena koštanog morfogenetskog proteina 2 u osteoblastima štakora, kisele fosfataze otporne na tartrat, osteokalcina u serumu ovarijektomiranih miševa i gena Smad1, mad5, transformirajućeg faktora rasta, itd. u koštanoj srži. , djeluje protiv osteoporoze [5-6].

Echinacea može potaknuti proliferaciju osteoblasta i potaknuti diferencijaciju mezenhimalnih matičnih stanica koštane srži uzgojenih in vitro u osteoblaste [7-9]. Posljednjih godina bilo je mnogo izvještaja o istraživanju o određivanju sadržaja ehinakozida i verbaskozida u etanolnom ekstraktu Cistanche deserticola i pripravcima njegovih spojeva [10-12], ali malo je izvješća o određivanju sadržaja komponenti indeksa u Cistanche deserticola vodeni ekstrakt. U ovom istraživanju korištena je tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti (HPLC) za određivanje sadržaja echinaceasida u vodenom ekstraktu Cistanche deserticola.

1 materijal

1.1 Instrumenti

LC-20AT tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti, SPD-20A detektor, SIL-20A autouzorkivač, CTO-10ASvp pećnica na stupcu, LC otopinska radna stanica za tekućinsku kromatografiju, Shimadzu Corporation of Japan; MES125P-OCE-DU elektronička analitička vaga, Sartorius Company, Njemačka; SHZ-D (Ⅲ) višenamjenska vakuumska pumpa s cirkulirajućom vodom, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.; RC2B SO25 rashladni cirkulacijski sustav rotacijskog isparivača, RV 10 D S96 rotacijski isparivač, IKA Company, Njemačka; DK-S26

Električna vodena kupelj konstantne temperature, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.; Stroj za ultračistu vodu serije UPR, Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.

1.2 Medicinski materijali i reagensi

Ljekoviti materijal Cistanche deserticola kupljen je od Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Pieces Co., Ltd., broj serije: 1801001, 1806001, 181001. Tu Xingming, glavni tradicionalni kineski ljekarnik u Trećoj pridruženoj bolnici Sveučilišta kineske medicine Guangzhou, identificirao ga je kao osušena mesnata stabljika s ljuskastim listovima Cistanche deserticola YCMa. Uzorak je pohranjen u sobi za testiranje lijekova Treće pridružene bolnice Sveučilišta kineske medicine Guangzhou; Echinacea Glycoside referentna tvar, sadržaj 89,7%, Kineski institut za kontrolu hrane i lijekova, broj serije: 111670-

201706; acetonitril je kromatografski čist (Merck, Njemačka); metanol i fosforna kiselina su analitički čisti (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); voda je ultračista voda.

2. Metode i rezultati

2.1 Priprema vodenog ekstrakta Cistanche deserticola

Uzmite grubi prah ljekovitog materijala Cistanche deserticola, dodajte 10 puta više od količine destilirane vode, dvaput zagrijte i refluksirajte za ekstrakciju, svaki put 1 sat, filtrirajte, sjedinite filtrat i koncentrirajte filtrat pomoću rotacijskog isparivača do sadržaja sirovog lijeka od 0,100 g·mL-1, i pohranite ga na 4 stupnja za kasniju upotrebu.

2.2 Kromatografski uvjeti i prikladnost sustava

Kromatografska kolona: Inertsil ODS SP C18 kolona (150 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobilna faza: acetonitril (A)-0.4% otopina fosforne kiseline (B), gradijent eluacije: 0 ~ 5 min, 17%

A; 5 ~ 25 min, 20% A; 25 ~ 30 min, 17% A; valna duljina detekcije: 333 nm; temperatura stupca: 30 stupnjeva; brzina protoka: 1,0 mL·min-1;

Volumen injekcije: 10 μL. U ovim kromatografskim uvjetima, razmak između pikova ehinakozida i susjednih komponenata veći je od 1,5, a broj teoretskih ploča na temelju pika ehinacezida ne smije biti manji od 4,000. Kromatogram je prikazan na slici 1.

2.3 Priprema otopine

2.3.1 Otopina referentne tvari Izvažite odgovarajuću količinu referentne tvari ehinakozida, točno je izvažite, stavite u odmjernu tikvicu od 10 mL, dodajte metanol da se otopi i pripremite otopinu referentne tvari koja sadrži 898,794 ug ehinaceazida po ml, 4 stupnja Sačuvajte za kasniju upotrebu.

2.3.2 Otopina ispitivanja

Precizno izmjerite 2.0 mL vodenog ekstrakta Cistanche deserticola, isparite do suhog u vodenoj kupelji, dodajte metanol da se otopi, razrijedite do volumena u odmjernoj tikvici od 10 mL, dobro protresite i filtrirajte s mikroporoznu membranu od 0,22 μm.

2.4 Istraživanje linearnog odnosa

Precizno izmjerite {{0}}.25, 0.50, 1.00, 2.00, 2.50, 3.00 mL referentne otopine pod točkom 2.3.1, stavite je u odmjernu tikvicu od 5 mL, dodajte metanol da dopunite volumen i dobro protresite da dobijete gradijent koncentracije od 44.{{17} }, 89.879 4. 179.758 8, 359.517 6, 449.397 0, 539.276 4 ug·mL-1 referentna otopina, filtrirana kroz mikroporoznu membranu od 0,22 μm. Mjerite u skladu s kromatografskim uvjetima pod 2.2. i zabilježite površinu vrha. Provedite linearnu regresiju s masenom koncentracijom referentne tvari kao apscisom (X, ug·mL-1) i površinom vrha kao ordinatom (Y), i dobit ćete regresijsku jednadžbu: Y=13 185 .0X-32 273.0, r=0.999 8. Rezultati pokazuju da ehinacea ima dobar linearni odnos unutar raspona koncentracije od 44.939 7 ~ 539.276 4 ug·mL-1.

2.5 Ispitivanje preciznosti

Uzmite 539.276 4 ug ·mL- 1 referentne otopine, ubrizgajte i mjerite 6 puta kontinuirano u skladu s kromatografskim uvjetima pod 2.2 i zabilježite površinu vrha. Rezultati su pokazali da je RSD površine pika ehinakozida 1,81%, što ukazuje na dobru preciznost instrumenta.

2.6 Ispitivanje stabilnosti

Precizno izmjerite 2.0 mL vodenog ekstrakta Cistanche deserticola, isparite do suhog u vodenoj kupelji, dodajte metanol da se otopi, razrijedite u odmjernu tikvicu od 10 mL, dobro protresite, filtrirajte {{ 7}}.22 μm mikroporozne membrane, slijedite kromatografske uvjete pod točkom 2.2 i postavite na 0 odnosno 2. , 4, 8, 12, 24 h mjerenje injekcije, zabilježite površinu vrha. Rezultati su pokazali da je RSD površine vrha ehinakozida 1,16%, što ukazuje da je ispitivana otopina imala dobru stabilnost unutar 24 sata.

2.7 Ispitivanje ponovljivosti

Precizno izmjerite 2.0 mL vodenog ekstrakta Cistanche deserticola i paralelno pripremite 6 ispitnih otopina prema metodi pod 2.3.2. Ubrizgajte uzorke za mjerenje u skladu s kromatografskim uvjetima pod 2.2. i zabilježite površinu vrha. Rezultati su pokazali da je RSD odehinakozidmasena koncentracija bila je 1,28%, što ukazuje na dobru ponovljivost metode.

2.8 Ispitivanje iskorištenja uzorka

Precizno izmjerite 9 obroka od 1.0 mL vodenog ekstrakta Cistanche deserticola, dodajte 0.8, 1.0 i 1,2 mL referentne otopine (1,552 mg·mL{{11 }}) ispariti do suhog u vodenoj kupelji, dodati metanol da se otopi i podesiti na odmjernu tikvicu od 10 mL; Dobro protresite i filtrirajte kroz mikroporoznu membranu od 0,22 μm kako biste pripremili ispitne otopine visoke, srednje i niske koncentracije. Paralelno pripremite 3 kopije svake koncentracije. Mjerite prema kromatografskim uvjetima pod 2.2. Zabilježite površinu vrha i izračunajte iskorištenje uzorka. Stopa. Rezultati su prikazani u tablici 1.

2.9 Određivanje sadržaja uzorka

Precizno odmjerite 3 obroka od 2.0 mL vodenog ekstrakta Cistanche deserticola, isparite do suhog u vodenoj kupelji, dodajte metanol da se otopi, razrijedite u odmjernu tikvicu od 10 mL, dobro protresite, filtrirajte s mikroporoznu membranu od 0,22 μm i izmjerite u skladu s kromatografskim uvjetima pod 2.2. Zabilježite površinu vrha i izračunajte sadržaj echinaceasida. Rezultati su prikazani u tablici 2.

Tablica 1. Rezultati testova iskorištenja ehinakozida

Tablica 2. Rezultati određivanja sadržaja ehinakozida u vodenom ekstraktu Cistanche herba