Apsorpcija citokina tijekom perfuzije ljudskog bubrega smanjuje upalni genski potpis povezan s odgođenom funkcijom presatka

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

John R. Ferdinand1,2|Sarah A. Hosgood2,3|Tom Moore2,3|Ashley Ferro1|Christopher J. Ward1|Tomas Castro-Dopico1|Michael L. Nicholson2,3|Menna R. Clatworthy1,2

1 Jedinica za molekularni imunitet, Odjel za medicinu Sveučilišta u Cambridgeu, Laboratorij za molekularnu biologiju, Cambridge, UK

2 Nacionalni institut za zdravstvena istraživanja Jedinica za istraživanje krvi i transplantacije u doniranju organa, Cambridge, UK

3 Odjel za kirurgiju Sveučilišta u Cambridgeu, Cambridge, UK

Transplantacija je optimalno liječenje za većinu bolesnika u završnom stadijububregbolestali nedostatak organa je veliki izazov. Normotermna strojna perfuzija (NMP) korištena je za obnovu rubnih organa; međutim, mehanizmi pomoću kojih NMP može imati koristi za organe nisu dobro shvaćeni. Koristeći parove ljudskih bubrega dobivenih od istog donora, usporedili smo učinak NMP-a s učinkom hladnog skladištenja na globalnububregtranskriptom. Otkrili smo da je hladno skladištenje dovelo do globalnog smanjenja ekspresije gena, uključujući gene za upalni put i one potrebne za procese stvaranja energije, kao što je oksidativna fosforilacija (OXPHOS). Nasuprot tome, tijekom NMP-a došlo je do izražene regulacije gena OXPHOS, ali i brojnih gena imunološkog i upalnog puta. Koristeći biopsije iz bubrega podvrgnutih NMP-u koji su naknadno transplantirani, otkrili smo da se veća ekspresija gena upale javlja u organima s produljenom odgođenom funkcijom presatka (DGF). Stoga smo upotrijebili hem-adsorber (HA) za uklanjanje proupalnih citokina. Ova oslabljena ekspresija upalnog gena povećala je OXPHOS gene i imala potencijalno klinički važne učinke u smanjenju ekspresije genskog potpisa povezanog s DGF-om. Zajedno, naši podaci sugeriraju da adsorpcija proupalnih medijatora iz perfuzata predstavlja potencijalnu intervenciju koja može poboljšati održivost organa.

KLJUČNE RIJEČI:klinička istraživanja/praksa, odgođena funkcija presatka (DGF), darivatelji i donacija: preminuli,bubreg(alograft) funkcija/disfunkcija,bubregbolest: imunološki / upalni, bubrezi

Cistanche biljka koja poboljšava rad bubrega

1. UVOD

Bubregtransplantacija predstavlja optimalno liječenje za većinu bolesnika szavršni stadijbubregbolest, s dobrobitima i za kvalitetu i za kvantitetu života.1 Nedostatak organa veliki je izazov, a nekoliko je strategija korišteno za povećanje broja dostupnih bubrega, uključujući upotrebu preminulih davatelja cirkulacijske smrti (DCD) i davatelja proširenih kriterija (ECD ), a oba su povezana s višim stopama odgođene funkcije presatka (DGF) u usporedbi s preminulim darivateljem u slučaju smrti moždanog debla (DBD).2,3 Kod DCD bubrega, izloženost toploj ishemiji tijekom procesa prestanka cirkulacije daje značajan doprinos DGF-u . DGF se javlja zbog oštećenja ili smrti ishemijskih tubularnih stanica, što može stimulirati urođenu imunološku aktivaciju putem inflamasomskog sklopa NLRP3 što dovodi do stvaranja interleukina (IL)1 i IL18.4-6 Doista, prisutnost upalnih citokina u urinu je utvrđena koristi se kao biomarkerakutanbubregozljedai DGF.7-9

Normotermna strojna perfuzija (NMP) omogućuje perfuziju transplantiranih organa toplim, oksigeniranim crvenim krvnim stanicama, u nedostatku cirkulirajućih imunoloških komponenti, uključujući komplement i neutrofile.10-14 Ovaj se postupak koristi za procjenu rubnih organa15 i za " recondicionirati" organe kako bi se olakšala transplantacija bubrega koji su prvotno odbijeni nakon ponude putem nacionalne službe za dodjelu organa.16 Naše prethodno iskustvo s uporabom NMP-a dalo je obrazloženje za randomizirano kontrolirano ispitivanje za procjenu njegove učinkovitosti u sprječavanju DGF-a u DCD bubrezima,17 ali mehanizmi pomoću kojih bi NMP mogao koristiti presađenim bubrezima nisu u potpunosti shvaćeni. Nadalje, pitanje je li dodatna manipulacijabubregtijekom NMP-a, na primjer uklanjanjem proupalnih citokina i kemokina iz perfuzata, može ponuditi dodatne prednosti u optimizaciji organa prije transplantacije nije se bavilo ljudskim bubrezima, ali naše istraživanje svinjskog NMP-a pokazalo je obećavajuće rezultate.18

Ovdje smo zauzeli nepristran pristup rješavanju ova dva pitanja koristeći transkriptomsku analizu čovjekabubregbiopsije uzete na početku i na kraju NMP-a za procjenu globalnih promjena u ekspresiji gena. Upotrijebili smo parove ljudskih bubrega od jednog donora što je omogućilo usporedbu učinaka različitih intervencija u organima s identičnom genetskom pozadinom i mogli smo procijeniti utjecaj tih promjena na predviđanje ishoda presađivanja.

Prednost ekstrakta cistanche: sprječavanje akutnogbubregozljeda

2. REZULTATI

2.1. Upareni bubrezi genetski su slični i koristan su model za procjenu intervencija

Istraživali smo transkripcijske promjene povezane s očuvanjem organa i NMP u dvije neovisne studije, svaka s pet pari bubrega, što čini ukupno 10 pari/20 ljudskih bubrega. Od toga, dva su bila od DBD i osam od DCD donatora (Tablica S1, S2 i Slika S1). U tim studijama uzeli smo kortikalne biopsije prije i poslije intervencije (hladno skladištenje ili NMP) i istražili transkripcijski krajolik pomoću RNA sekvenciranja (RNA-Seq). Korištenje parnih bubrega i parnih biopsija iz istihbubregomogućilo nam je kontrolu bioloških varijacija i izbacivanje ove zbunjujuće tvari iz analize (Slika S2A). To smo potvrdilibubregparovi započinju zajedničkim transkripcijskim krajolikom (sl. S2B) i primjenom različitih intervencija na svakibubregu paru, možemo proučavati učinak intervencije neovisno o biološkim varijacijama.

SLIKA 1. Bubrezi izloženi hladnom skladištenju pokazuju ograničene promjene u ekspresiji gena u usporedbi s onima koji su podvrgnuti NMP-u. Dobiven je par bubrega koji je odbijen za korištenje u transplantaciji. Jedanbubregdržan je u statičkom hladnom skladištu, a drugi je podvrgnut normotermnoj strojnoj perfuziji (NMP). Biopsije su uzete iz vanjskog korteksa na početku i nakon 2 sata. B, grafikon vulkana koji pokazuje promjenu ekspresije gena nakon 2 sata za naznačenu grupu u usporedbi s početkom. Crvene točke označavaju različito izražene gene s prilagođenom P-vrijednošću<0.05 and="" the="" experimental="" group="" is="" indicated="" above="" the="" plot.="" c,="" gene="" set="" enrichment="" analyses="" of="" the="" differential="" expressions="" from="" b="" against="" the="" hallmarks="" pathways.="" only="" significant="" pathways="" (fdr="" q="" value=""><0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="" (nes).="" d,="" heatmap="" of="" the="" top="" 20="" significantly="" upregulated="" genes="" during="" nmp,="" genes="" are="" ranked="" by="" log2="" fold="" change.="" e,="" string="" analysis="" of="" the="" top="" 50="" genes="" upregulated="" during="" nmp.="" the="" color="" of="" each="" node="" indicates="" membership="" of="" each="">

SLIKA 2 Korelacija transkriptoma nakon NMP s duljinom odgođene funkcije presatka. Ekspresija gena bila je u korelaciji s duljinom DGF-a u biopsijama uzetim nakon NMP-a kao dio randomiziranog kliničkog ispitivanja. Ucrtane su razine ekspresije 1000 gena s najvećom korelacijom s ishodom. B, GSEA je provedena za korelaciju iz A u odnosu na skup podataka o znakovima. Samo značajni putovi (FDR q vrijednost<0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="">

2.2. NMP rezultira povećanjem OXPHOS i gena upalnog puta u usporedbi s hladnim skladištenjem

Kako bismo istražili potencijalne mehanizme kojima bi NMP mogao utjecati na bubrege, u početku smo uzeli petbubregparova (n {{0}} DCD davatelja i n=1 preminulog davatelja smrti moždanog debla [DBD], slika S1, tablica S1) i izvršili kortikalnu biopsiju u trajanju od 0 (0 sati) . U ovom trenutku, bubrezi su randomizirani u statično hladno skladište ili NMP, kao što je prethodno opisano 10 (Slika 1A). Nakon 2 sata, druga je biopsija uzeta iz oba bubrega i učinjen je RNA-Seq. Uspoređujući ekspresiju gena između biopsija u vremenu od 0- do 2- sata, otkrili smo da bubrezi smješteni u statično hladno skladište nisu imali statistički značajnu promjenu u ekspresiji bilo kojeg pojedinačnog gena kada su ispravljeni za višestruko testiranje (Slika 1B , lijeva ploča). Nasuprot tome, tijekom 2 sata NMP-a, 956 gena je regulirano prema gore, a 353 gena je regulirano prema dolje (Slika 1B, desna ploča). Zatim smo procijenili promjene u ekspresiji grupa gena unutar zajedničkog puta, uspoređujući desetke ili stotine gena, a ne bilo koji pojedinačni gen, čime smo dodatno smanjili učinak biološke interindividualne varijacije na analizu. Ovo je otkrilo promjene u funkcionalno važnim putovima, gdje ekspresija svakog pojedinačnog gena unutar tog puta nije bila promijenjena u dovoljnoj mjeri da bi se postigla statistička značajnost. Ova analiza obogaćivanja skupa gena (GSEA) pokazala je da je hladno skladištenje imalo značajan utjecaj na niz metaboličkih puteva (Slika 1C, lijevi panel). Konkretno, došlo je do značajnog smanjenja gena uključenih u oksidativnu fosforilaciju (OXPHOS), ključnog puta potrebnog za generiranje ATP-a.19 Nasuprot tome, OXPHOS je bio među putevima koji su značajno pojačano regulirani tijekom NMP (Slika 1C, desna ploča), s potencijalnim prednostima za vitalnost stanica i obnovu stanične homeostaze. Osim toga, brojni putovi uključeni u imunološke ili upalne procese inducirani su tijekom NMP-a, pri čemu je "TNF signaliziranje putem NFkB" pokazalo najveće povećanje. U skladu s tim, TNF, kao i IL1B i kemokini CXCL8 (IL8) i CXCL2 koji regrutiraju neutrofile, bili su među najreguliranijim genima u 2--satnim NMP biopsijama (Slika 1D). Analiza nizova prvih 50 pojačano reguliranih gena otkrila je pojačanu regulaciju biokemijski povezanih gena koji su bili grupirani u četiri glavna čvora; IL8 i kemokini koji regrutiraju neutrofile, geni povezani s inflammasomom, signalizacija NFkB i regulacija transkripcije (Slika 1E). Treba napomenuti da su DBD i DCD bubrezi bili transkripcijski slični na početku (Slika S2C), a genski putovi koji su se mijenjali tijekom NMP bili su slični u DBD i DCD bubrezima (Slika S2D). Zajedno, naša analiza pokazuje da tijekom NMP-a dolazi do povećane ekspresije gena koji promiču stvaranje energije, s potencijalno korisnim učincima za organ, ali istovremenom indukcijom proupalnih gena, što može biti štetno.

Ekstrakt Cistanche tubulosa: poboljšava funkciju bubrega

2.3. Geni upalnog puta u NMP bubrezima povezani s produljenom odgođenom funkcijom presatka

Kako bismo povezali transkripcijske promjene koje se događaju tijekom hladnog skladištenja i NMP-a s kliničkim ishodima, izveli smo RNA-Seq na biopsijama uzetim iz 33 DCD bubrega koji su bili podvrgnuti NMP-u kao dio randomiziranog kliničkog ispitivanja koje trenutno procjenjuje njegovu učinkovitost.17 Uzorci su bili dostupni na podskup bubrega randomiziranih u NMP krak studije koji je naknadno presađen (tablica S3, slika S1). DGF je češći kod DCD bubrega i klasično se definira kao potreba za dijalizom u prvom tjednu nakon transplantacije. Međutim, u razdoblju neposredno nakon transplantacije, neki pacijenti primaju jednu epizodu dijalize zbog hiperkalijemije, što ne odražava nužno prisutnost značajne akutne tubularne nekroze. Stoga smo upotrijebili model koji povezuje ekspresiju gena s vremenom između operacije transplantacije i zadnje sesije dijalize (tj. trajanje DGF-a). Ovo je pokazalo izraženije transkripcijske promjene u transplantatima koji zahtijevaju dijalizu nakon prva 24 sata nakon transplantacije (Slika 2A), kao i značajnu pozitivnu korelaciju između ekspresije gena upalnog puta uključujući "TNFA signaliziranje putem NFkB" i puteve "upalnog odgovora" i duljina DGF-a, s većim obogaćivanjem ovih putova u bubrezima koji su iskusili dulje vrijeme nakon transplantacije DGF-a (Slika 2B). Nasuprot tome, duljina DGF-a negativno je korelirala s veličinom ekspresije gena puta "OXPHOS" (Slika 2B). Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da su nakon NMP-a bubrezi koji imaju nižu ekspresiju gena upalnog puta i veću ekspresiju gena "OXPHOS" puta manje osjetljivi na produženi DGF nakon transplantacije. To bi poduprlo zaključak da molekularne promjene koje se događaju tijekom NMP-a mogu imati i korisne (indukcija gena puta OXPHOS) i štetne (indukcija gena putova upale) učinke.

2.4. Izlučivanje urina i bubrežni protok krvi tijekom NMP-a pokazuju različite povezanosti s OXPHOS i genima upalnog puta

Količina urina proizvedenog tijekom NMP-a jedan je od niza parametara uključenih u rezultate procjene kirurške kvalitete koji se koriste za usmjeravanje odluka o korištenju organa,15 no nagovještava li visoka količina urina tijekom NMP-a doista dobru prognozu za bubreg i temeljne molekularne putove aktivirane u bubrezi s velikim izlučevanjem urina nejasni. U ukupno 10 bubrega podvrgnutih NMP-u (samo NMP bubrezi, tablica S1 i S2, slika S1), promatrali smo raspon izlaza urina od 0 do 340 ml tijekom 2-satnog razdoblja perfuzije (Slika 3A lijevi panel). Važno je napomenuti, kada smo usporedili putove koji se mijenjaju tijekom NMP-a u pet bubrega u dva neovisna eksperimenta, otkrili smo da su inducirani slični putovi (Slika S3A) što potvrđuje ponovljivost našeg eksperimentalnog dizajna i korisnost usporedbe putova, a ne pojedinačnih gena. U 2--satnim postperfuzijskim biopsijama, ekspresija 11 gena značajno je korelirala s volumenom urina proizvedenog tijekom tog razdoblja. To uključuje proteine ​​toplinskog šoka (HSP), HSPA1A, HSPA1B i HSPH1, koji su pozitivno korelirali s povećanim izlučevanjem urina (Slika 3A desna ploča). Analiza obogaćivanja skupa gena pokazala je da je izlaz urina također u pozitivnoj korelaciji s genima puta "TNF signaliziranja putem NFkB", te u negativnoj korelaciji s OXPHOS genima u postperfuzijskim biopsijama (Slika 3B, S3C). Slično, u biopsijama prije perfuzije, OXPHOS je negativno korelirao s izlučenim urinom u ovim bubrezima, dok su putovi povezani s imunološkom aktivacijom uključujući "TNF signaliziranje putem NFkB" i "alograft odbacivanje" pozitivno korelirali s izlučenim urinom, što sugerira da je NMP imao mali učinak na te procese , ili na drugim analiziranim putovima, u bubrezima s velikim izlučenjem urina (Slika 3B, S3C-D). Budući da je indukcija gena upalnog puta primijećena u našim kliničkim uzorcima s produljenim DGF-om (Slika 2B), ovi podaci dovode u pitanje dogmu da se velika količina urina javlja kod održivijih, "zdravijih" bubrega i sugeriraju da zapravo ti bubrezi mogu imati više upalnog potencijala, manje su sposobni generirati energiju i da se to bitno ne mijenja tijekom NMP-a.

Bubrežni protok krvi tijekom perfuzije također je procijenjen kao parametar koji može odražavati kasniju funkciju transplantacije.15 U 10 proučavanih bubrega, bubrežni protok krvi u 2 sata perfuzije varirao je od 14,1 do 168,8 ml/min (Slika 3C lijevo). U 2--satnim postperfuzijskim biopsijama, osam gena značajno je pozitivno koreliralo s povećanjem bubrežnog protoka krvi (Slika 3C desna ploča), uključujući HSPA1L, ali nije bilo izravnog preklapanja između ovog popisa gena i onih koji su u korelaciji s izlučenim urinom (Slika 3A ). Analiza obogaćivanja skupa gena pokazala je da je visok bubrežni protok krvi u pozitivnoj korelaciji s OXPHOS genima u 0-satnim biopsijama, ali za razliku od onih s najvećom količinom urina, perfuzija je imala značajan utjecaj, što je rezultiralo negativnom korelacijom s "OXPHOS" gena puta za 2 sata (Slika 3D, Slika S4A-B). Bubrežni protok krvi u negativnoj je korelaciji s brojnim imunološkim i upalnim genskim putovima u 0- i 2-satnim biopsijama (Slika 3D, Slika S4B), za razliku od izlaza urina (Slika 3B, Slika S3C). Zajedno ovi podaci sugeriraju da bubrežni protok krvi i izlučivanje urina ne moraju biti ekvivalentni pokazatelji održivijeg bubrega, ali da prvi može vjernije identificiratibubregmanje vjerojatno da će imati produljeni DGF.

korist i nuspojave cistanche: protuupalno

2.5. Dodatak hem-adsorbera perfuzijskom krugu nema učinka na parametre perfuzije, ali značajno smanjuje ekspresiju gena upale, uključujući NLRP3 i IL1B

Analize odbubregperfuzata pokazali su značajno povećanje koncentracije proupalnih citokina i kemokina tijekom hipotermije i NMP.20,21 Ove bioaktivne molekule ponovno cirkuliraju u bubreg, s potencijalom induciranja daljnje upale. S obzirom da je naša analiza presađenihbubreguzorci su pokazali da je indukcija TNF-ovisnih gena u NMP bubrezima povezana s DGF-om (Slika 2B), pretpostavili smo da uklanjanje citokina i kemokina iz perfuzijskog kruga može oslabiti indukciju gena upale, s potencijalnim korisnim učincima za bubreg. Takav pristup pokazao je određenu učinkovitost kod pacijenata sa sindromom sustavnog upalnog odgovora,22,23, i bio je povezan s povećanim bubrežnim protokom krvi u svinjskim bubrezima koji su podvrgnuti NMP-u.18 Da bismo to testirali na ljudskim bubrezima, uzeli smo dodatnih pet pari bubrega i izveli NMP tijekom 4 sata s biopsijama uzetim u 0, 2 i 4 sata (Slika S1). U svakom slučaju, citosolni hem-adsorber (HA) koji uklanja molekule s molekularnom težinom od 10-50 kDa dodan je u perfuzijski krug jednog bubrega unutar svakog para (NMP plus HA) (Slika 4A). Kao što se očekivalo, dodavanje HA rezultiralo je nižim koncentracijama raznih citokina u perfuzatu (Slika 4B), ali nije imalo učinka na bubrežni protok krvi, izlučivanje ili sastav urina, potrošnju kisika i acidobaznu homeostazu (Slika 4C, Tablica S4, S5). Stoga, tijekom 4 sata NMP-a, HA nije imao utjecaja na parametre perfuzije koji se trenutno klinički koriste za generiranje rezultata procjene kvalitete, ali je imao značajan učinak na ekspresiju gena; Nakon NMP-a, 1794 i 4026 gena su regulirani na gore nakon 2 odnosno 4 sata, uključujući TNF i IL6 (Slika 4D, E). ali samo polovica ovog broja (n=898 i n=2606) je povećana kada je HA bio prisutan (Slika 4D, Slika S5A i B). Broj gena s niskom regulacijom također je smanjen dodatkom HA (Slika 4D). Nakon 4 sata NMP-a, 46 gena je značajno pojačano, a 181 smanjeno s dodatkom HA (Slika 4F). Ovaj oslabljeni transkripcijski odgovor uključivao je gene povezane s aktivacijom inflamasoma NLRP3, kao što su IL1B, NLRP3 i CASP1 (Slika 4G, Slika S4B) i neke kemokine koji regrutiraju neutrofile (Slika S5C), koji su prethodno bili povezani s oštećenjem bubrega u životinjskim modelima.24,25 Ovo pokazuje da su topljivi medijatori oslobođeni izbubregponovno cirkuliraju i pokreću de novo ekspresiju upalnih gena unutar organa, ali da se to može ublažiti njihovim uklanjanjem iz perfuzijskog kruga.

SLIKA 4 Dodavanje hem-adsorbera normotermnom strojnom perfuzijskom krugu ima značajne učinke na razinu citokina u perfuzatu i transkriptomu, ali ne i na fizičke parametre zabilježene na uređaju. Par ljudskih bubrega uzet je od istog donora, jedan od para podvrgnut je standardnom protokolu normotermne strojne perfuzije (NMP) tijekom 4 sata, a drugibubregpodvrgnut NMP-u uz dodatak hem-adsorbera u krug. Uzorci su uzeti za RNA-Seq prije perfuzije (0 sati), nakon 2 sata i na kraju (4 sata). B, Koncentracija ključnih citokina u perfuzatu nakon 4 sata NMP. Linija označava parove bubrega. Mjerenja citokina normalizirana su na ukupni sadržaj proteina perfuzata. Navedena P-vrijednost je iz testiranja uparenog t-testa za smanjenje citokina uz dodatak HA. C, Proizvodnja urina i bubrežni protok krvi (RBF) tijekom vremenskog tijeka perfuzije. Zelena linija označava sam NMP, a narančasta s dodatkom hem-adsorbera. D, Vennov dijagram koji prikazuje brojeve gena koji su značajno različito izraženi kada se uspoređuju uzorci od 2-hr ili 4-hr s uzorcima prije (0-hr). Crveni dijagrami su regulirani geni prema gore, a plavi prema dolje. Presjek su geni koji se deferencijalno eksprimiraju u obje vremenske točke u istom smjeru. E, log2 normalizirane vrijednosti ekspresije za naznačene gene preko perfuzije iz transkriptoma tkiva, prikazane su standardne trake pogrešaka. F, Dijagram vulkana za parnu usporedbu NMP samog s NMP plus HA na 4 sata. Crveno označava različito izražene gene s prilagođenom P-vrijednošću<0.05. g,="" as="" for="">

liječiti bubrežne bolesti ekstrakt cistanhe

2.6. HA povezana sa smanjenjem genskog potpisa povezanog s odgođenom funkcijom presatka

Analiza obogaćivanja skupa gena pokazala je značajno smanjenje u "TNF signalizaciji putem NFkB" puta u NMP plus HA bubrezima u usporedbi sa samim NMP (Slika 5A-B). Značajno, prisutnost HA ne samo da je smanjila ekspresiju upalnog gena unutarbubregali i povećani OXPHOS i putevi metabolizma masnih kiselina, koji pridonose stvaranju energije (Slika 5A-B). Stoga bi promjene u putovima ekspresije gena koje se javljaju s HA ​​poduprle zaključak da su njegovi učinci klinički korisni, budući da je smanjio "TNFA signaliziranje putem NFkB" gena puta i povećao "OXPHOS" put gena, a oba su povezana s kraćim trajanje DGF-a (Slika 2B).

Kako bismo dodatno istražili odnos između transkripcijskih promjena u NMP-u i kliničkih ishoda, pokušali smo kurirati genski potpis prisutan u bubrezima s DGF-om. Identificirali smo prvih 100 pozitivno (GORE) i negativno (DOLJE) reguliranih gena (rangiranih po logaritamskoj promjeni nabora) koji su bili u korelaciji s duljinom DGF-a u 33 uzorka kliničkih ispitivanja (Slika 5C, Podaci S1). Pronašli smo značajno obogaćivanje genskog potpisa povezanog s povećanom duljinom DGF-a u uzorcima s većom izlučenošću urina (Slika 5D), što sugerira da visoka izlučenost urina tijekom NMP-a identificira bubrege u riziku od produljenog DGF-a. Nije bilo statistički značajne korelacije između DGF potpisa i gena povezanih s većim bubrežnim protokom krvi (Slika 5E). Zatim smo procijenili je li i kako dodavanje HA u NMP krug utjecalo na ekspresiju DGF "UP" i "DOWN" genskih potpisa. Zanimljivo, ovo je pokazalo da je ekspresija genskog potpisa povezana s povećanom duljinom DGF-a značajno smanjena dodatkom HA, a signatura povezana sa smanjenom duljinom DGF-a značajno je povećana dodatkom HA (Slika 5F).

Sve u svemu, transkripcijske promjene koje smo identificirali sugeriraju da NMP ima potencijalne prednosti u odnosu na hladno skladištenje u smislu njegovih učinaka na stvaranje energije u bubrezima. Međutim, tijekom perfuzije, neke se bioaktivne molekule otpuštaju iz bubrega u perfuzijski krug, generirajući petlju pojačanja koja pokreće upalu kada ponovno uđu u bubreg. Uklanjanje ovih molekula prekida ovu petlju i može biti korisno za smanjenje upale i povećanje proizvodnje energije, dodatno pojačavajući blagotvorne učinke NMP-a i smanjujući osjetljivost na DGF (Slika 6).

SLIKA 5 Dodatak ham-adsorbera smanjuje potpis gena povezan s DGF-om. GSEA analiza učinka dodavanja HA transkriptomu nakon 4 sata NMP-a u odnosu na karakteristični put genetskog skupa. Ucrtavaju se samo značajni putovi. Crvene točke označavaju pozitivno obogaćenje, a plave negativno, veličina točke je u obrnutoj korelaciji s FDR q vrijednošću, a položaj označava normalizirani rezultat obogaćenja (NES). B, Dijagrami obogaćivanja iz GSEA za ključne putove iz baze podataka Hallmark za usporedbu iz A. Crta označava tekući rezultat obogaćivanja, a grafikon violine označava distribuciju gena članova geneseta kroz rangiranu listu gena korištenu u svakoj analizi. C, Toplinska karta prve četiri najveće pozitivne (GORE) i negativne (DOLJE) korelacije s duljinom DGF-a i korištena kao dio potpisa genske ekspresije za DGF. Potpuni potpis DGF-a dat je u dodatnim podacima. DF, DGF povezani genski potpis upotrijebljen je s GSEA za istraživanje ekspresije potpisa u korelaciji 2-hr izlaznog urina s 2-hr transkriptomom (D), korelacija 2-hr RBF s 2-hr transkriptomom (E), i učinak dodavanja HA na transkriptom nakon 4 sata (F). Parcele kao i za A

SLIKA 6 Grafički sažetak. A, Tijekom hladnog skladištenja, postoji globalno smanjenje transkripcije. Tijekom NMP ekspresija gena u nizu putova je regulirana na gore, uključujući oksidativnu fosforilaciju (OXPHOS) i gene za upalni put kao što su TNF, IL8 i NFkB. B lijevi panel, Tijekom NMP-a, upalni medijatori (žuti kružići) se oslobađaju izbubregu perfuzijsku otopinu. Oni ponovno kruže i stimuliraju proupalnu transkripciju gena u bubrezima i povezani su sa smanjenjem gena za proizvodnju energije, smanjujući ATP. Desna ploča, prisutnost hem-adsorbera (HA) prekida ovu upalnu petlju pojačanja

Cistanche biljka koja poboljšava rad bubrega

3. RASPRAVA

Naši podaci pokazuju da je hladno skladištenje učinkovito u ograničavanju značajnih promjena u ekspresiji gena. To je u skladu s modelima glodavaca, gdje su bubrezi pohranjeni do 18 sati u hladnom skladištu pokazali malu promjenu u ekspresiji proupalnih citokina, uključujući IL1, TNF i IL6.26 Naša upotreba nepristranog, globalnog transkripcijskog profiliranja, a ne mjerenje malog broja gena kandidata omogućilo nam je analizu ekspresije grupa gena pronađenih unutar specifičnih puteva. Ovo je otkrilo značajno smanjenje ekspresije gena OXPHOS i putanje glikolize u hladnim bubrezima, potencijalno smanjujući kapacitet tih bubrega za stvaranje ATP-a, u skladu s prethodnom studijom koja je pokazala smanjeni ATP u hladnim ljudskim bubrezima.27 Brojni proupalnih puteva također su smanjeni tijekom hladnog skladištenja, uključujući aktivaciju TNF-a putem NFkB i puteva reaktivnih kisikovih vrsta koji mogu biti potencijalno korisni. Međutim, može biti da hladno skladištenje samo privremeno zaustavlja te putove i da će se nakon reperfuzije kod primatelja pojaviti slične promjene u ekspresiji gena upale kao što je uočeno u NMP.

NMP je imao suprotan učinak od hladnog skladištenja na OXPHOS i gene za put glikolize, povećavajući njihovu ekspresiju, s potencijalom povećanja staničnog kapaciteta za stvaranje ATP-a i obnavljanje homeostaze. Treba napomenuti da se također pokazalo da hipotermijska oksigenirana perfuzija ljudskih bubrega povećava razine ATP-a u usporedbi s hladnim skladištenjem 27, stoga bi ponovno uspostavljanje oksigenacije moglo biti glavni poticaj za te procese, a ne normotermija. Unatoč tome, ove će promjene vjerojatno biti korisne za organ s obzirom na naše opažanje negativne korelacije između povećane ekspresije gena puta OXPHOS i produljenog DGF-a.

Nedavni rad Hameeda i suradnika28 također je izvršio transkriptomsku analizu NMP-a u tri bubrega podvrgnuta NMP-u. Nažalost, autori nisu svoje podatke učinili javno dostupnima, stoga nije moguća dubinska usporedba s našim skupom podataka. Međutim, njihov rukopis ukazuje na indukciju gena povezanih s imunološkim odgovorom tijekom NMP, uključujući IL1B, CXCL2 i TNF, što je u skladu s našim nalazima.

U našoj analizi bubrega podvrgnutih NMP-u u kontekstu kliničkog ispitivanja, korelirali smo potpise genske ekspresije s duljinom DGF-a, a ne s incidencijom DGF-a (definirana kao potreba za dijalizom unutar prvog tjedna nakon transplantacije). Naime, bubrezi s trajanjem DGF-a od 1 dana ili manje bili su vrlo transkripcijski slični onima bez DGF-a, što vjerojatno odražava potrebu za dijalizom zbog hiperkalemije povezane s peri-operacijom, a ne bona fide DGF-a. Otkrili smo da je dulji DGF povezan s većom ekspresijom TNFA signalizacije putem gena puta NFkB i nižom ekspresijom gena povezanih s OXPHOS. Ovi podaci sugeriraju da bubrezi s povećanim OXPHOS-om i smanjenom imunološkom signalizacijom mogu predstavljati bolji potencijal kao bubrezi donora, ali ovaj zaključak zahtijeva potvrdu u većoj prospektivnoj studiji.

Također smo procijenili molekularne procese koji su u korelaciji s izlučenim urinom i bubrežnom krvlju tijekom NMP. Ti su se parametri ranije koristili, zajedno s nizom drugih mjera, za generiranje ocjene kvalitete prokrvljenih bubrega. Smatra se da visoke vrijednosti izlučenog urina i bubrežnog protoka krvi odražavaju održiviji transplantat.15 Naši podaci otkrivaju da se putovi koji koreliraju s visokim izlučenim urinom i visokim bubrežnim protokom krvi razlikuju, i zapravo ti parametri pokazuju polarne suprotne povezanosti s upalnim putovima . Visoka količina urina bila je povezana s većom ekspresijom gena imunološkog puta, dok je visok bubrežni protok krvi bio u negativnoj korelaciji s tim putevima. Također smo otkrili da je DGF genski potpis koji smo generirali bio obogaćen u bubrezima s visokom količinom urina tijekom NMP-a, što sugerira da ovaj parametar može identificirati bubrege u riziku od dužeg DGF-a, za razliku od trenutne dogme. Jedno od mogućih objašnjenja je da vrlo visoka količina urina odražava bubrege s jače oštećenim tubulima koji nemaju sposobnost koncentriranja urina. Dakle, može postojati "efekt Zlatokose" u pogledu izlučivanja urina, pri čemu su bubrezi s niskim/malim izlučivanjem urina oni sa značajnim abnormalnostima u stvaranju filtrata, a oni s vrlo visokim izlučenjem urina imaju značajna tubularna oštećenja koja onemogućuju koncentraciju urina. Ovu bi hipotezu trebalo provjeriti na većem broju bubrega koji su naknadno presađeni.

Tijekom 4 sata NMP-a došlo je do indukcije upalnih gena u bubregu. Međutim, vrijedi napomenuti da trenutna klinička praksa uključuje samo 1 sat NMP-a, a ovaj učinak možda neće biti vidljiv tijekom kraćeg vremena perfuzije. Međutim, duža perfuzija može imati koristi u smislu obnove oksigenacije i stvaranja energije, au našem eksperimentu, negativni učinci indukcije imunološkog gena mogli bi se značajno poništiti uvođenjem citosola HA u perfuzijski krug. Ovi podaci pokazuju da upalni medijatori koje generiraju bubrezi tijekom NMP-a ulaze u perfuzijski krug i sposobni su pogoršati sterilnu upalu te da njihovo uklanjanje poboljšava indukciju gena puta upale opaženih tijekom NMP-a. Važno je da smo pokazali da dodavanje HA utječe na ekspresiju gena koji su povezani s lošijim kliničkim ishodima. Naš DGF genski potpis izveden je iz uzoraka podvrgnutih NMP-u kao dijelu kliničkog ispitivanja u kojem se procjenjuje njegova učinkovitost, što nam omogućuje čvrsto povezivanje promjena koje smo uočili u našim studijama uparenih bubrega s kliničkim krajnjim točkama u bubrezima koji su podvrgnuti transplantaciji. Međutim, bit će potrebna njegova primjena u kontekstu kliničkog ispitivanja kako bi se definitivno dokazala korisnost njegove primjene na bubrege prije transplantacije. HA je nespecifična i može ukloniti molekule koje su korisne, uz one koje su štetne za organ. Otkrili smo da se ukupni učinak HA na bubrežni transkriptom čini korisnim, ali bi moglo biti da bi usavršavanje za specifično uklanjanje dokazanih, štetnih medijatora moglo biti još učinkovitije.

Parovi bubrega koje smo koristili bili su od iste osobe i stoga su bili genetski identični i iskusili su slično okruženje tijekom života donora. Potvrdili smo da je njihov vremenski 0 transkriptom izuzetno sličan (Slika S2 A, B). Međutim, ove biopsije uzorkuju mali dio bubrega, a parovi bubrega mogu biti asimetrično zahvaćeni patologijom, na primjer, cistama ili bolešću malih krvnih žila. Dodatno upozorenje je da su svi bubrezi korišteni u ovdje predstavljenim intervencijskim eksperimentima odbijeni za transplantaciju, a neki predstavljaju presađene organe na donjem kraju spektra kvalitete. Ipak, primijetili smo visoko ponovljive rezultate pri usporedbi genskih puteva u skupinama od pet bubrega. Također smo uspjeli pokazati da su bubrezi iz DCD i DBD imali sličan odgovor na perfuziju. Kombinirajući to s našim odabranim post-NMP DGF potpisom, mogli smo predvidjeti potencijalne kliničke koristi. Ovaj eksperimentalni pristup mogao bi se upotrijebiti kao predklinički alat za provjeru potencijalne terapijske učinkovitosti budućih intervencija kako bi se omogućio racionalan odabir mogućih intervencija za klinička ispitivanja.

Ukratko, naša studija pruža prvi globalni transkripcijski profil ljudskih bubrega koji su podvrgnuti NMP-u, rješavajući različite molekularne putove koji se aktiviraju u NMP-u u usporedbi s hladnim skladištenjem i pokazujući da štetni učinci bioaktivnih molekula proizvedenih ili otpuštenih iz bubrega tijekom NMP-a mogu biti poništen dodavanjem HA. Nadalje, ova je intervencija smanjila ekspresiju gena povezanih s produljenim DGF-om, pružajući snažno mehaničko obrazloženje za primjenu takve intervencije u budućem kliničkom ispitivanju. Naši podaci također imaju implikacije na strategije perfuzije izvan bubrega, uključujući transplantaciju jetre i pluća, što sugerira da bi uklanjanje bioaktivnih molekula iz perfuzata trebalo istražiti u ovim kontekstima gdje se NMP sve više koristi. Konačno, naša studija naglašava korisnost globalnog transkripcijskog profiliranja u parububregaza procjenu novih intervencija na prokrvljenim organima; transkripcijske promjene prethode promjenama u obilju proteina (koji se tradicionalno koriste kao biomarkeribubregozljeda) i deseci tisuća transkripata gena mogu se lako izmjeriti. Stoga mjerenje RNA ima potencijal pružiti rano, osjetljivo očitavanje stanične funkcije ljudskih organa uzetih za transplantaciju koje se može primijeniti u budućim studijama.

ZAHVALA

Autori zahvaljuju svim darivateljima organa i njihovim obiteljima. Laboratorij Clatworthy zahvalan je na osnovnim sadržajima koje pruža MRC Laboratorij za molekularnu biologiju. Ovaj rad je obavljen pomoću resursa koje je osigurala Cambridgeova usluga za otkrivanje temeljeno na podacima (CSD3) kojom upravlja Sveučilište Cambridge Research Computing Service, a koju su osigurali Dell EMC i Intel koristeći Tier-2 financiranje od Inženjerskih i fizičkih znanosti Vijeće (kapitalna potpora EP/P020259/1) i financiranje DiRAC-a od Vijeća za znanstvene i tehnološke ustanove (www. Dirac. ac. UK).

RAZOTKRIVANJE

Autori nemaju sukob interesa za otkriti kako je opisano u American Journal of Transplantation.

AUTORSKI PRILOZI

JRF, SH, MLN i MRC osmislili su studiju i protumačili podatke. JRF, SH, TM, CJW, AF i TCD izveli su eksperimente. JRF, SH i MRC izradili su slike i tablice. MRC je napisao glavni rukopis. JRF i SH izradili su metode i legende slika, JRF, SH i MLN uredili su rukopis.

Dobrobit Cistanche: poboljšava rad bubrega

Reference:
1. Methven S, Steenkamp R, Fraser S. 19. godišnje izvješće UK Renal Registry: 5. poglavlje Preživljavanje i uzroci smrti odraslih pacijenata UK-a na nadomjesnoj bubrežnoj terapiji u 2015.: Nacionalne analize i analize specifične za centre. Nefron. 2017;137(1):117–150.
2. Summers DM, Johnson RJ, Allen J, et al. Analiza čimbenika koji utječu na ishod nakon transplantacije bubrega doniranih nakon srčane smrti u UK: kohortna studija. Lanceta. 2010;376(9749):1303-1311.
3. Summers DM, Johnson RJ, Hudson A, Collett D, Watson CJ, Bradley JA. Učinak dobi darivatelja i vremena skladištenja u hladnjači na ishod kod primatelja bubrega doniranih nakon cirkulacijske smrti u UK: kohortna studija. Lanceta. 2013;381(9868):727–734.
4. Friedewald JJ, Rabb H. Upalne stanice u ishemijskom akutnom zatajenju bubrega.BubregInt. 2004;66(2):486–491.
5. Kono H, Stijena KL. Kako umiruće stanice upozoravaju imunološki sustav na opasnost. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):279–289.
6. Berry M, Clatworthy MR. Imunoterapija za akutnebubregozljeda. Imunoterapija. 2012;4(3):1–12.
7. Parikh CR, Coca SG, Thiessen-Philbrook H, et al. Postoperativni biomarkeri predviđaju akutnibubregozljede i loši ishodi nakon kardiokirurških zahvata kod odraslih. J Am Soc Nephrol. 2011;22(9):1748–1757.
8. Hall IE, Yarlagadda SG, Coca SG, et al. IL-18 i NGAL u mokraći predviđaju dijalizu i oporavak presatka nakonbubregtransplantacija. J Am Soc Nephrol. 2010;21(1):189–197.
9. Malyszko J, Lukaszyk E, Glowinska I, Durlik M. Biomarkeri odgođene funkcije presatka kao oblika akutnogbubregozljeda ububregtransplantacija. Sci Rep. 2015;5:11684.
10. Hosgood SA, Nicholson ML. Prva transplantacija bubrega kod čovjeka nakon ex vivo normotermne perfuzije. Transplantacija. 2011;92(7):735–738.
11. Yong C, Hosgood SA, Nicholson ML. Ex-vivo normotermna perfuzija u transplantaciji bubrega: prošlost, sadašnjost i budućnost. Curr Opin Transplantacija organa. 2016;21(3):301–307.
12. Fisher A, Andreasson A, Chrysos A, et al. Promatračka studija o perfuziji pluća donora ex vivo u transplantaciji pluća u Velikoj Britaniji: DEVELOP-UK. Health Technol Assess. 2016;20(85):1–276.
13. Slama A, Schillab L, Barta M, et al. Standardno dobivanje pluća donora s normotermnom ex vivo perfuzijom pluća: prospektivna randomizirana klinička studija. J Transplantacija srca i pluća. 2017;36(7):744–753.
14. Nasralla D, Coussios CC, Mergental H, et al. Randomizirano ispitivanje normotermne prezervacije u transplantaciji jetre. Priroda. 2018;557(7703):50–56.
15. Barlow AD, Hamed MO, Mallon DH, et al. Upotreba ex vivo normotermne perfuzije za procjenu kvalitete odbačenih gušterača humanih donora. Am J Transplant. 2015;15(9):2475–2482.

16. Hosgood SA, Saeb-Party K, Hamed MO, Nicholson ML. Uspješna transplantacija ljudskih bubrega koji se smatraju nepresadivim, ali su oživljeni Ex vivo normotermnom strojnom perfuzijom. Am J Transplant. 2016;16(11):3282–3285.
17. Hosgood SA, Saeb-Party K, Wilson C, Callaghan C, Collett D, Nicholson ML. Protokol randomiziranog kontroliranog, otvorenog ispitivanja ex vivo normotermne perfuzije naspram statičkog hladnog skladištenja u donaciji nakon transplantacije bubrega s cirkulacijskom smrću. BMJ Open. 2017;7(1):e012237.
18. Hosgood SA, Moore T, Kleverlaan T, Adams T, Nicholson ML. Hemoadsorpcija smanjuje upalni odgovor i poboljšava protok krvi tijekom ex vivo bubrežne perfuzije u eksperimentalnom modelu. J Transl Med. 2017;15(1):216.
19. Krebs HA. Povijest ciklusa trikarboksilnih kiselina. Perspect Biol Med. 1970;14(1):154–170.
20. Hoogland ER, de Vries EE, Christiaans MH, Winkens B, Snoeijs MG, van Heurn LW. Vrijednost koncentracije biomarkera strojne perfuzije u DCDbubregtransplantacije. Transplantacija. 2013;95(4):603–610.
21. van Balkom BWM, Gremmels H, Ooms LSS, et al. Proteini u tekućini za očuvanje kao prediktori odgođene funkcije presatka u bubrezima donora nakon cirkulatorne smrti. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12(5):817–824.
22. Kogelmann K, Jurczak D, Scheller M, Druner M. Hemoadsorption by CytoSorb in septični pacijenti: serija slučajeva. Crit Care. 2017;21(1):74.
23. David S, Thamm K, Schmidt BMW, Falk CS, Kielstein JT. Učinak ekstrakorporalnog uklanjanja citokina na funkciju vaskularne barijere u bolesnika sa septičkim šokom. J Intenzivna njega. 2017;5:12.
24. Li L, Huang L, Vergis AL, et al. IL-17 koji proizvode neutrofili regulira migraciju neutrofila u miša posredovanu IFN-gamabubregishemijsko-reperfuzijska ozljeda. J Clin Invest. 2010;120(1):331–342.
25. Hayama T, Matsuyama M, Funao K, et al. Povoljan učinak inhibitora neutrofilne elastaze na bubrežnu toplu ishemiju-reperfuzijsku ozljedu u štakora. Transplant Proc. 2006;38(7):2201-2202.
26. Saat TC, Susa D, Roest HP, et al. Usporedba profila ekspresije upalnih, citoprotektivnih i ozljeđenih gena u bubrezima od davatelja moždane smrti i srčane smrti. Transplantacija. 2014;98(1):15–21.
27. Ravaioli M, Baldassare M, Vasari F, et al. Strategije za vraćanje razine adenozin trifosfata (ATP) nakon više od 20 sati hladne ishemije u ljudskim rubnim dijelovimaBubregGraftovi. Ann Transplant. 2018;23:34–44.
28. Hameed AM, Lu DB, Patrick E, et al. Kratka normotermna strojna perfuzija pomlađuje odbačene ljudske bubrege. Transplant Direct. 2019;5(11):e502.