Koordinirana regulacija sistemskog i bubrežnog metabolizma triptofana putem prijenosnika lijekova OAT1 i OAT3

Jeffry C. Granados¹, Anne Richelle², Jahir M. Gutierrez¹, Patrick Zhang³, Xinlian Zhang⁴, Vibha Bhatnagar⁵, Nathan E. Lewis^1,2,6, i Sanjay K. Nigam^2,7,*

^{Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com}

cistanche iskustvo

Ključno je pitanje kako organi osjećaju cirkulirajuće metabolite. Ovdje pokazujemo da multispecifični transporteri organskih aniona lijekova, OAT1 (SLC22A6 ili NKT) i OAT3 (SLC22A8), igraju ulogu u osjetilu organa. Metabolomske analize seruma Oat1 i Oat3 nokaut miševa otkrile su promjene u derivatima triptofana koji su uključeni u metabolizam i signalizaciju. Nekoliko ovih metabolita potječe iz mikrobioma crijeva i uključeni su kao uremički toksini ukroničnibubregbolest. Izravna interakcija s prijenosnicima podržana je analizama prijenosa na bazi stanica. Kako bi se procijenio utjecaj gubitka funkcije OAT1 ili OAT3 na bubreg, organ u kojem su ovi prijenosnici unosa visoko izraženi, knockout transkriptomski podaci mapirani su na računalni model temeljen na "metaboličkom zadatku" koji procjenjuje više od 150 staničnih funkcija. Unatoč promjenama metabolita triptofana u oba nokauta, samo u Oat1 nokautu povećane su višestruke stanične funkcije povezane s triptofanom. Stoga, lišen sposobnosti uzimanja kinurenina, kinurenata, antranilata i N-for-milantranilata kroz OAT1, bubreg reagira aktiviranjem vlastitih biosintetskih putova povezanih s triptofanom. Rezultati podupiru teoriju daljinskog očitavanja i signaliziranja, koja opisuje kako prijenosnici "lijeka" pomažu optimizirati razine metabolita i signalnih molekula omogućavanjem unakrsnog razgovora organa. Budući da OAT1 i OAT3 inhibiraju mnogi lijekovi, podaci upućuju na mogućnost interakcija lijek-metabolit. Doista, liječenje ljudi probenecidom, inhibitorom OAT-a koji se koristi za liječenje gihta, povećalo je cirkulirajuće metabolite triptofana. Nadalje, s obzirom na to da su regulatorne agencije preporučile da se lijekovi testiraju na vezivanje ili transport OAT1 i OAT3, slijedi da se ovi metaboliti mogu koristiti kao endogeni biomarkeri za utvrđivanje interakcije kandidata za lijekove s OAT1 i/ili OAT3.

Transporteri organskih aniona OAT1 (SLC22A6, izvorno NKT (1)) i OAT3 (SLC22A8, izvorno ROCT (2)) nalaze se u proksimalnom tubulububregi horoidni pleksus mozga te kontroliraju fiziološku distribuciju i eliminaciju brojnih lijekova i toksina iz okoliša kao i endogenih metabolita kao što su -ketoglutarat, prostaglandini i urati (3, 4). Uz to, OAT pomažu regulirati razine unesenih prirodnih proizvoda i spojeva koji potiču iz crijevnog mikrobioma (npr. epikatehin, 3-indoksil sulfat, p-krezol sulfat) (5, 6).

OAT1 i OAT3, članovi obitelji SLC22, među najpoznatijim su multispecifičnim prijenosnicima lijekova. Ova skupina prijenosnika lijekova uključuje druge članove superporodice SLC (nosač otopine) i ABC (ATP-vezujuća kaseta) (7, 8). Postoji opsežna literatura o farmaceutskim i toksikološkim ulogama ovih prijenosnika, no endogene funkcije ovih evolucijski očuvanih proteina, kao i regulatorna mreža u kojoj sudjeluju, tek se počinju karakterizirati (9). Ovi multispecifični transporteri utječu na mnoge aspekte fiziologije i patofiziologije, vjerojatno funkcionirajući u kombinaciji s mono- ili oligo-specifičnim transporterima. Tri dobro karakterizirana patofiziološka primjera su uloge OAT1, OAT3, URAT1 i ABCG2 u gihtu (10), uloga OAT1 i OAT3 u nakupljanju uremičkih toksina povezanih s kroničnimbubregbolesti (CKD) (11, 12), a obitelj SLC22 u akutnojbubregozljeda (13).

Zbog golemog niza malih organskih anionskih spojeva koje prenose OAT1 i OAT3, širok raspon ksenobiotika i endogenih molekula može se zamislivo natjecati za pristup i bubrežni klirens pomoću ovih OAT transportera (14, 15). To ima važne implikacije jer mnogi metaboliti, uključujući one koji nastaju iz mikrobioma crijeva i transportiraju se pomoću OAT1 i OAT3, reguliraju endogenu fiziologiju i povezani su s razvojem kliničkih poremećaja, kao što su KBB, metabolički sindrom i dijabetes (14, 16, 17). Na primjer, količina CMPF (3-karboksi-4-metil-5-propil-2- furan propanoične kiseline), supstrata OAT3, u cirkulaciji povezana je s dijabetesom. CMPF je metabolit masne kiseline furana koji se nalazi u ribljim uljima, biljnim uljima, maslacu i drugoj hrani te remeti rad stanica gušterače, što dovodi do nepodnošenja glukoze (18, 19). Potencijalne posljedice kompeticije na razini transportera između lijeka i transportiranog endogenog metabolita uključuju (a) promijenjene intracelularne koncentracije metabolita jer transportirani lijek blokira ulazak metabolita u stanicu; (b) promijenjene serumske koncentracije lijeka, metabolita ili oboje, što dovodi do povećanog poluživota i/ili razina metabolita; i (c) promijenjen sistemski metabolizam koji proizlazi iz distalnih kaskadnih učinaka na višestruke metaboličke putove koji ovise o OAT1 ili OAT3 ili oboje.

Primijenili smo pristup sistemske biologije koji je koristio metabolomske i transkriptomske podatke iz Oat1 i Oat3knockout (KO) miševa za analizu glavnih metaboličkih funkcija na koje utječu OAT1 i OAT3. Podaci o metabolizmu seruma iz Oat1 i Oat3 KO miševa predstavljaju utjecaj ovih transportera na endogeni sistemski metabolizam. Koristili smo transkriptomske podatke izbubreg, koji je mjesto ekspresije kodirajućih gena transportera, za procjenu aktivnosti stotina metaboličkih funkcija pomoću analize metaboličkih zadataka. Čineći to, uspjeli smo nadopuniti razumijevanje promjena izvanstaničnog metabolita zbog gubitka transportera OAT1 ili OAT3 analizom zahvaćenih unutarstaničnih metaboličkih putova.

Zajedno, multi-omički pristup i sistemska biološka analiza koji se ovdje koriste daju portret lokalnih i sistemskih metaboličkih i signalnih putova moduliranih odvojeno i zajednički pomoću OAT1 i OAT3. Pokazali smo da OAT1 ne samo da sustavno regulira metabolizam triptofana, već također igra ključnu ulogu u metaboličkim putovima triptofana unutar tkiva u kojem se nalazi. Stoga naši rezultati pokazuju da studije novih entiteta lijeka ne bi trebale samo uzeti u obzir učinke interakcije lijek-metabolit (DMI) u serumu, već i procijeniti potencijalne pomake u staničnom metabolizmu zbog gubitka priljeva metabolita kroz kompeticiju na razini prijenosnika. U prilog važnosti našeg rada za ljude, pokazujemo da su mnoge promjene u serumskim razinama metabolita triptofana uočene kod nokautiranih miševa također uočene kod ljudi nakon primjene probenecida, lijeka koji se koristi za liječenje gihta koji inhibira OAT1 i OAT3.

\

cistanche muške koristi

Rezultati

Sažetak cjelokupnog pristupa

Obitelj gena SLC22 (OATs, OCTs, OCTNs) kodira prijenosnike koji sudjeluju u unosu mnogih jedinstvenih spojeva kroz nekoliko tkiva, iako je veliki dio istraživanja usmjeren na nekolicinu članova (SLC22A1, SLC22A2, SLC22A6, SLC22A8) koji upravljaju mnoge uobičajene droge (20, 21). Međutim, ti su geni visoko očuvani, s ortolozima u mušici, crvu, ribi i morskom ježu (22); to implicira da imaju važne fiziološke uloge izvan rukovanja lijekovima. Kako bismo odredili endogene uloge OAT1 i OAT3 u kontroli metabolizma na razini tkiva i organizma, neovisno o njihovim dobro poznatim ulogama prijenosnika lijekova i toksina, analizirali smo transkriptomske podatke specifične za tkivo i metabolomske podatke u serumu (slika 1). Usporedili smo podatke dobivene miševima s genetski nedostatkom Oat1 ili Oat3 i njihovih kontrola divljeg tipa. Ovi skupovi podataka prethodno su ispitani iz kemoinformatičke perspektive (23) i kako bi se pružio široki pregled zahvaćenih putova (24), ali ovdje stavljamo naglasak na njihovu specifičnu ulogu u dispoziciji metabolita triptofana. Budući da se ova dva transportera nalaze ububreg, analizirali smobubregtranskriptomski podaci pomoću analize metaboličkog zadatka, metode sistemske biologije koja grupira gene prema njihovim koordiniranim ulogama u biosintezi ograničenog skupa ključnih metabolitskih međuprodukata iz unosa različitih metabolita (pogledajte odjeljak Metode za više detalja). Podržali smo ove studije unutar testova transporta vitro; također podupiremo kliničku relevantnost naših nalaza podacima o metabolomiji ljudi.

Poznate karakteristike Oat1 KO i Oat3 KO miševa Gotovo sve karakteristike miševa s nedostatkom Oat1 ili Oat3 slične su onima divljeg tipa miševa (25-27) (Tablica 1). Nokautirani miševi su održivi s preživljavanjem usporedivim s onim miševa divljeg tipa. Štoviše, oni ne pokazuju nikakve vidljive abnormalnosti u razvoju ili rastu, a histološki i fiziološki pregled ovih različitih nokauta (u dobi od ~2-8 mjeseci) otkrio je male ili nikakve razlike u odnosu na divlji tip, osim što Oat3 KO miševi imaju nešto niži krvni tlak ( 28). Također je primijećen trend prema taloženju lipida u jetri u Oat1 KO, ali samo za vrlo stare miševe (29).

Ovi miševi s nokautom transportera također su karakterizirani s farmakološkog i toksikološkog stajališta (Tablica 2). OAT1 i OAT3 igraju važnu ulogu u rukovanju raznim lijekovima i toksinima, kako iz okoliša tako i iz endogeno proizvedenih (30-38). Oba nokaut miša imaju promijenjene odgovore na diuretike Henlje i tiazide zbog nemogućnosti ovih lijekova da pristupe lumenu nefrona—proces koji ovisi o OAT1-ili OAT3-posredovanom unosu u stanicu proksimalnih tubula . Oat1 KO životinje su zaštićene od nefrotoksičnosti izazvane živom zbog nedostatkabubregunos konjugata žive. Oba miša nakupila su uremičke toksine u serumu i pokazala su smanjeno izlučivanje mokraćne kiseline. Ex vivo analiza tkiva Oat1 KO ili Oat3 KO miševa pokazuje smanjeni unos nekoliko antivirusnih lijekova.

Izvijestili smo da životinje s nedostatkom zobi mogu imati smanjenu ekspresiju OAT3 (39). Međutim, brojne su studije pokazale da je funkcionalni učinak toga skroman u najboljem slučaju u bazalnom stanju. Na primjer, Oat1 nokautbubregaimaju izrazito smanjen transport PAH-a, ali nema vidljivog gubitka transporta supstrata OAT3, estron sulfata (26). Kemoinformatička analiza identificirala je niz molekularnih svojstava koja razlikuju metabolite promijenjene u Oat1 u usporedbi s miševima s nedostatkom Oat3 (23). Nadalje, embrionalnibubregkulture organa iz obje linije miševa prenosile su različite skupine antivirusnih lijekova (36-38). Također postoje razlike u vrstama uremičkih toksina pronađenih u Oat1 u odnosu na Oat3 KO (34).

Metabolizam triptofana je sustavno promijenjen u Oat1 i Oat3 KO miševa

Objavljene metabolomičke analize Oat1 KO i Oat3 KO miševa sugeriraju fiziološki važne promjene u rukovanju endogenim metabolitima i proizvodima crijevnog mikrobioma, uključujući neke uremičke toksine (34, 35). Ovdje smo analizirali 731 metabolit poznatog identiteta u serumu prikupljenom od kontrolnih i Oat1 KO miševa. Isto tako, 611 metabolita poznatog identiteta otkriveno je u serumu kontrolnih i Oat3 KO miševa.

Za Oat1 KO miševe otkrili smo da su 63 metabolita u superputu aminokiselina (dodatna tablica S1) značajno povećana (p Manje od ili jednako 0.05, 54 metabolita, među kojima je 12 metabolita imale su promjene nabora veće od 3) ili su imale tendenciju prema značajnom povećanju (0.05 Manje ili jednako p Manje ili jednako 0,10, devet metabolita), što sugerira da su ili supstrati OAT1 ili da njihove koncentracije u serumu ovise na OAT1. Za Oat3 KO miševe otkrili smo da je deset metabolita u superputu aminokiselina značajno povećano, dok je 11 imalo tendenciju prema značajnom povećanju (dodatna tablica S2). Kao dodatak p-vrijednostima, također smo izračunali Cohenov d, koji je pokazao velike veličine učinka (u rasponu od 1,76 do 4,17) za metabolite triptofana. U skladu s drugim farmakološkim i fiziološkim podacima dobivenim od OAT1 i OAT3 knockout miševa ili njihovih tkiva koji ukazuju na važne funkcionalne razlike (23, 36, 38), usporedba promjena u serumskim metabolitima na način Superpath aminokiselina između Oat1 KO (63 metabolita) i Oat3 KO (21 metabolit) miševi otkrili su samo deset preklapajućih metabolita u tim podskupovima (dodatna tablica S3).

Svaki je metabolit razvrstan pomoću Metabolonova softvera u jedan od osam superputeva (aminokiseline, ugljikohidrati, kofaktori i vitamini, energija, lipidi, nukleotidi, peptidi, ksenobiotici) i jedan od 90 podputeva. Od 17 metabolita koji su se značajno nakupili u serumu životinja Oat1 KO i Oat3 KO, četiri su pripadala podputu metabolizma triptofana, što ukazuje da ova dva prijenosnika imaju važnu zajedničku ulogu u regulaciji sistemskog metabolizma triptofana (Slika 2) . Neovisno, metabolizam triptofana bio je među najobogaćenijim subputovima za oba nokaut modela (slika 3). Šesnaest Slika 3. Metabolizam triptofana jedan je od najizmijenjenijih putova u oba nokaut miša. Grafikon vulkana za Oat1 KO (n=5) ​​pokazuje metabolite triptofana u odnosu na sve druge izmjerene metabolite. B, metabolizam triptofana drugi je najobogaćeniji put za značajno povišene metabolite. C, grafikon vulkana za Oat3 KO (n=3) koji prikazuje metabolite triptofana u odnosu na sve druge izmjerene metabolite. D, metabolizam triptofana je najobogaćeniji put za značajno povišene metabolite na temelju analize podputa metabolizma. Uloga OAT1 i OAT3 u metabolizmu triptofana 4 J. Biol. Chem. (2021) 296 100575metaboliti triptofana izmjereni su u serumu oba miša, a 12 ih je značajno promijenjeno u najmanje jednoj skupini. Miševi Oat1 KO imali su povišenih 11 metabolita, uključujući jedan (N-formilant hranilat) koji nije izmjeren u serumu Oat3 KO (Tablica 3). Analiza Oat3 KO otkrila je da je šest od 16 metabolita značajno promijenjeno ili ima tendenciju prema tome. Za neke od tih metabolita, uključujući one koji nastaju iz bakterija u crijevnoj mikroflori, poznato je da imaju distalne učinke na nekoliko drugih organa. Na primjer, 3-indoksil sulfat je povezan s progresijombubregbolest i uremijski sindrom (12, 40). Podaci pokazuju da OAT1 i OAT3 rade zajedno na regulaciji sistemskog metabolizma triptofana, a opet imaju i specifične funkcije unutar metabolizma triptofana rukovanjem različitim skupovima metabolita koji utječu na različite biokemijske reakcije.

Procjena interakcija lijek-metabolit kod ljudi uključujući lijek koji inhibira OAT i metabolite triptofana

Probenecid, lijek koji se koristi za liječenje gihta, davan je ljudima kako bi se odredio kratkoročni učinak lijeka visokog afiniteta koji veže OAT na razine cirkulirajućih metabolita. Probenecid ima tri dobro utvrđene mete: SLC22A12 (URAT1, Rst), OAT1 i OAT3, a svi su blisko povezani geni u skupini prijenosnika organskih aniona iz obitelji SLC22 nositelja otopine. URAT1 je prijenosnik mokraćne kiseline smješten na apikalnoj membrani (strana okrenuta prema urinu) proksimalnog tubula, tako da se očekuje da će OAT1 i OAT3, koji su multispecifični i eksprimirani na strani proksimalnog tubula okrenutoj prema krvi, izvršiti dublji učinak na serumski metabolom. Usporedbe metaboličkih mjerenja u krvi prije i 5 sati nakon doziranja pokazuju velike promjene u podputu metabolizma triptofana (Tablica 4). Zbog različitih platformi, u ovom su podputu bila 22 metabolita, od kojih je 16 bilo značajno promijenjeno. Četrnaest metabolita izmjereno je na sve tri platforme i otkrilo je nekoliko zajedničkih karakteristika između nokautiranih miševa i ljudi liječenih probenecidom (slika 4). Na primjer, povećanje 3-indoksil sulfata, kinurenina, N-acetilkinurenina i indol laktata primijećeno je u obje skupine nokautiranih miševa i ljudi. Međutim, bilo je više preklapanja između Oat1 KO miša i ljudi liječenih probenecidom. Svih osam metabolita koji su bili značajno povišeni u Oat1 KO također su bili značajno povišeni u ljudi liječenih lijekovima. Samo serotonin, koji je bio povišen kod Oat3 KO miša, nije bio promijenjen kod ljudi.

Miševi liječeni lijekom koji inhibira OAT pokazuju promjene u metabolizmu triptofana

Kao posrednik između naših nokautiranih mišjih modela i ljudi, liječili smo miševe divljeg tipa probenecidom, dobro poznatim lijekom za inhibiciju OAT-a. Ovo liječenje lijekom dovelo je do povećanja šest metabolita triptofana, uključujući kinurenin, kinurenat i indolelaktat (slika 5). Ti su metaboliti bili povišeni u jednom ili oba nokaut pokusa i kod ljudi liječenih probenecidom.

Prema tome, ukupni rezultati kod ljudi i miševa liječenih probenecidom, kao i nokautiranih miševa, podupiru ulogu OAT1 i OAT3 u regulaciji cirkulirajućih razina metabolita triptofana.

Metaboliti triptofana stupaju u interakciju s ljudskim OAT1 i OAT3 in vitro testovima transporta Kako bismo potvrdili naše nalaze, proveli smo in vitro testove transporta koristeći stanice koje prekomjerno izražavaju ljudske OAT1 i OAT3. Mnogi od metabolita u ovom podputu testirani su protiv ovih prijenosnika (Tablica 3), ali drugi metaboliti ostaju neistraženi. Testovi transporta indooctene kiseline (ILA) otkrili su da ILA stupa u interakciju s OAT1 i OAT3 (IC50=229.1 ± 74,56 μM, odnosno 74,49 ± 23,29 μM) (Slika 6). Nadalje, serotonin, koji je bio jedinstveno povišen u Oat3 KO, bio je u interakciji samo s OAT3 in vitro (IC50=288.2 ± 167.0 μM) (podaci nisu prikazani). IC50 vrijednosti su zatim integrirane s poznatim Km vrijednostima da se izračunaju inhibitorne konstante. Inhibicijska konstanta (Ki) za ILA s OAT1 bila je 119,3 μM.

Analiza metabolomičkog zadatka izbačenog bubrega ukazuje na središnju ulogu OAT1 u otkrivanju metabolita triptofana u proksimalnim tubulima

Koristili smo mikromrežne podatke izbubregaOat1 KO, Oat3 KO i njihove kontrole divljeg tipa kako bi se utvrdilo kako promjene transportera utječu nabubregmetaboličke funkcije. U tu smo svrhu upotrijebili metodu sistemske biologije (analiza metaboličkih zadataka (41) iz alata CellFie) koja predviđa kako promjene u ekspresiji gena utječu na unaprijed definirani popis od 175 metaboličkih zadataka (dodatna tablica S4), koji pokrivaju općenite metaboličke sustave stanica (energija, nukleotidi, ugljikohidrati, aminokiseline, lipidi, vitamini i kofaktori te metabolizam glikana). Kao što je opisano u Metodama, izračun "rezultata metaboličkog zadatka" uzima transkriptomske podatke i pripisuje rezultat aktivnosti gena za svaki gen. Model metabolizma na razini genoma koristi se za sastavljanje popisa reakcija potrebnih za postizanje svakog od 175 metaboličkih zadataka. Stoga se transkriptomska analiza može izravno koristiti za kvantitativnu usporedbu relativne aktivnosti svake metaboličke funkcije pod različitim uvjetima (npr. divlji tip naspram Oat1 KO, divlji tip naspram Oat3 KO).

Otkrili smo da su metabolički zadaci povezani s triptofanom uobičajeni među onima s velikom razlikom između Oat KO i miševa divljeg tipa. Međutim, ono što je bilo neočekivano je da jebubregmetabolički zadaci povezani s triptofanom ovise o OAT1, ali ne i o OAT3. Kod Oat1 KO miševa, sinteza kinurenina, kinurenata, antranilata i N-for-milantranilata iz triptofana povećala je rezultate metaboličkih zadataka, dok je svaki od tih zadataka imao smanjeni rezultat metaboličkih zadataka u Oat3 KO. To je u skladu s analizama metabolomike seruma, koje pokazuju značajna povećanja razina kinurenina, kinurenata, antranilata i N-za-milantranilata u Oat1 KO.

Rasprava

OAT1 i OAT3 prepoznati su po svojoj ulozi u eliminaciji stotina lijekova (42). Međutim, in vivo i in vitro studije OAT1 i OAT3 pokazale su da su ti proteini uključeni u transport brojnih endogenih metabolita i metabolita koji potiču iz crijevnih mikroba, uremičkih toksina, signalnih molekula, unesenih hranjivih tvari, industrijskih toksina i prirodnih proizvoda (9, 24, 26, 34, 35, 43). Čini se da je to slučaj i s drugim multispecifičnim prijenosnicima lijekova, što sugerira da je njihov doprinos endogenom metabolizmu uvelike podcijenjen (44).

Ovi multispecifični prijenosnici lijekova snažno su izraženi u gotovo svim tkivima i igraju posebno kritičnu ulogu na slici 4. Metaboliti triptofana bili su povišeni kod miševa koji su izbacili Oat i kod ljudi liječenih probenecidom. Vennov dijagram značajno promijenjenih metabolita triptofana u nokautiranih miševa i ljudi liječenih probenecidom. Od 14 metabolita zajedničkih za sve tri platforme, 12 je bilo značajno povišeno u barem jednom od eksperimenata. Četiri metabolita bila su značajno povišena u svakom eksperimentu. B, kemijske strukture metabolita povišene u svakom eksperimentu: 3-indoksil sulfat, indolelaktat, kinurenin i N-acetilkinurenin. C, kutije za svaki metabolit kod ljudi liječenih probenecidom (n=20), Oat1 KO miševa (n=5) i Oat3 KO miševa (n=3). Linije u okvirima označavaju medijan. Uloga OAT1 i OAT3 u metabolizmu triptofana. Biol. Chem. (2021) 296 100575 7epitelne i endotelne barijere između krvi i drugih tjelesnih tekućina/odjeljaka (npr. krvno-moždana barijera, krvno-retinalna barijera, krvno-likvorska barijera, nosno-moždana barijera, krvno-urinska barijera). Kao regulatori sistemskog metabolizma, kao i lokalnog metabolizma unutar njihovog tkiva ekspresije, vrsta studija i analiza koje smo ovdje opisali, ako se provedu za sve prijenosnike "lijekova", mogu radikalno promijeniti naše fiziološke poglede na ove evolucijski očuvane proteine.

Klinička farmaceutska važnost ovih prijenosnika je golema, a regulatorne agencije preporučile su probir novih entiteta lijekova protiv najmanje sedam multispecifičnih prijenosnika lijekova (OAT1, OAT3, OATP1B1, OATP1B3, OCT2, P-GP, BCRP) kako bi se ograničila mogućnost interakcije lijekova (DDI)—slučajevi u kojima se dva ili više lijekova natječu za pristup istom prijenosniku. DDI-ji posredovani transporterima mogu promijeniti koncentraciju lijekova u krvi, potencijalno dovodeći do štetnih kliničkih učinaka (45). S obzirom na broj supstrata za OAT1 i OAT3, sličan fenomen može se dogoditi između lijekova i metabolita u cirkulaciji. Ti DMI također imaju potencijal utjecati na funkciju tkiva, budući da metaboliti i signalne molekule možda neće moći ući u stanicu i izvršiti svoje učinke na normalnu staničnu fiziologiju. Ova studija podržava ovu mogućnost.

U našim metabolomičkim analizama seruma Oat1 i Oat3 nokaut miševa, došlo je do značajnih promjena u metabolitima povezanim s triptofanom. Povećanje sistemskih razina metabolita, zbog odsutnosti ovih prijenosnika na sučelju krvi sbubreg, povećao je mogućnost smanjene intracelularne koncentracije ububregstanice proksimalnih tubula. Kako bi te stanice zauzvrat mogle odgovoriti? Za rješavanje ovog pitanja upotrijebili smo analizu metaboličkih zadataka temeljenu na transkriptomiji. Identificirali smo višestruke lokalne (bubrežne) metaboličke zadatke povezane s triptofanom na koje utječe odsutnost prijenosnika. Ove promjene u rezultatima metaboličkih zadataka uzrokovane su kompenzacijskim povećanjem ekspresije gena povezanih s metaboličkim zadacima u kontekstu nedostatka OAT1. Dok su mnogi metabolički putovi ispitani i metabolomikom i analizom metaboličkih zadataka temeljenom na transkriptomici, upotreba oba pristupa pružila nam je jedinstvene uvide u to kako određeni prijenosnici lijekova sudjeluju u komunikaciji između tkiva i izvanstaničnog okoliša. Dakle, dok su metabolite triptofana regulirala oba transportera na sistemskoj razini, metabolički zadaci povezani s triptofanom unutar bubrega primarno su ovisili o OAT1.

Rezultati pokazuju da je proksimalni tubul odbubreg, gdje se nalaze OAT, nije samo kanal za bubrežnu eliminaciju metabolita triptofana; osjeća metabolite triptofana i reagira na promjene u njihovoj intracelularnoj zastupljenosti. Zajedno, podaci podupiru mišljenje da OAT1 igra ključnu ulogu ne samo u uklanjanju metabolita povezanih s triptofanom iz cirkulacije promicanjem njihovog unosa od stranebubregali također da ovaj prijenosnik regulira unutarstanični metabolizam, posebice metabolizam triptofana.

To podupire gledište da je OAT1-posredovani transport kinurenina, kinurenata, antranilata i N-za-milantranilata važan zabubregfunkciju (slika 8). Ova četiri metabolita pripadaju kinureninskom podputu razgradnje triptofana, a osim kinurenata, uključeni su u proizvodnju stanične energije kroz sintezu NAD plus (46). Stoga je moguće da nedostatak OAT1 dovodi do poremećenog staničnog metabolizma koji se može, barem djelomično, nadoknaditi proizvodnjom ovih metabolita.

Gotovo sav uneseni triptofan se metabolizira u tri glavna podputa: kinurenin, serotonin i indol (47, 48). Osim svoje uloge u proizvodnji NAD plus, kinureninski podput proizvodi metabolite koji imaju različite funkcije u zdravim i bolesnim stanjima (46, 49). Put serotonina proizvodi neurotransmiter, serotonin, koji ima ulogu u brojnim fiziološkim procesima, ponajviše kao regulator funkcije središnjeg živčanog sustava (50). Podput indola, koji je posredovan crijevnim mikrobiomom, proizvodi signalne molekule koje sudjeluju u komunikaciji između domaćina i mikroba (51). Sustavno, OAT1 i OAT3 moduliraju bioraspoloživost metabolita triptofana iz svakog od tri podputa, iako većina metabolita dolazi iz podputa kinurenina i indola.

Uzimajući u obzir mnoštvo signalnih uloga koje imaju povišeni metaboliti, postoji mogućnost da OAT1 i OAT3 utječu na mnoge aspekte fiziologije. Na primjer, kinurenat aktivira GPR35, cilj lijeka, i GPCR uključen u upalne reakcije i kardiovaskularne bolesti (52). Mnogi od značajno promijenjenih metabolita triptofana također su utvrđeni ili pretpostavljeni ligandi arilnog ugljikovodičnog receptora (AhR) (tablica 3), regulatora transkripcije izraženog u gotovo svim tkivima koja reagiraju na ksenobiotike (53).

Metabolomske studije dvaju nokautiranih miševa pokazale su da je ključna endogena funkcija OAT1 i OAT3 reguliranje sistemskih razina metabolita triptofana. Stoga se očekuje da lijek koji cilja na OAT1 i OAT3 ima sličan učinak na metabolom. Kao što je predviđeno, translacijski potencijal naših nokautiranih miševa kao modela DMI-ja bio je snažno podržan rezultatima kod ljudi liječenih probenecidom, lijekom koji inhibira OAT koji se koristi u cijelom svijetu za liječenje gihta. Nekoliko metabolita triptofana bilo je povišeno u serumu ljudi i nokautiranih miševa.

Prema tome, postoji mogućnost da se spojevi povišeni u studijama na ljudima i glodavcima koriste kao biomarkeri za nove lijekove koji mogu inhibirati OAT1 i OAT3. Iako su nokautirani mišji modeli (koji imaju normalan očekivani životni vijek) i ljudi liječeni probenecidom bili zdravi, neki od povišenih metabolita su poznati uremički toksini koji su povećani u serumu ljudi koji pate od kroničnog zatajenja bubrega i povezani su s negativnim ishodima (54 , 55). Preklapanje metabolita koji su uključeni u aspekte CKD-a i naše studije sugeriraju da bi OATs mogli igrati ključnu ulogu u manifestacijama CKD-a ili njegovom napredovanju, iako je također moguće da koncentracije metabolita mogu biti povećane zbog gubitka sekrecije kao rezultat tkiva štete (56, 57). CKD također može dovesti do multiorganskog zatajenja, dijelom zbog nakupljanja uremijskih toksina, a to može biti dijelom zbog unosa u druga tkiva putem SLC i ABC transportera lijeka (12, 58).

Put metabolizma triptofana zahtijeva usklađenu funkciju nekoliko organa. Triptofan se apsorbira u crijevima, modificira ga jetra ili drugi organi, a metaboliti se na kraju transportiraju putembubreg, dijelom kroz funkciju OAT1 i OAT3. Konvencionalno, ovo se jednostavno promatra kao put eliminacije. Naši rezultati, koji pokazuju da stanice odbubregodgovoriti na odsutnost tih metabolita i signalnih molekula pripremajući se za njihovu proizvodnju, sugeriraju drugačije. Iako je njihova specifična uloga ububregproksimalni tubul slabo definiran, jasno je da su mnogi od proizvedenih međuprodukata neurotransmiteri i imaju važnu ulogu u funkciji CNS-a (46, 49, 59, 60). Osim međuorganske komunikacije, metabolizam triptofana također odražava međuorgansku komunikaciju između domaćina i crijevnog mikrobioma. Doista, serum miševa bez klica ima smanjene razine 3-indoksil sulfata, indolepropionata i serotonina (61). Nadalje, prethodne studije su pokazale da unutar bubrežnih OAT1-pozitivnih stanica, 3-indoksil sulfat funkcionira u staničnoj signalizaciji aktiviranjem AhR i reguliranjem vlastitog izlučivanja putem OAT1 (62). Naša otkrića da su metaboliti dobiveni iz crijeva bili povećani u serumu i Oat1 KO i Oat3 KO miševa—zajedno s našom demonstracijom da su neki ligandi in vitro, pružaju dodatnu podršku važnosti ovih transportera u reguliranju komunikacije između domaćina i komenzala organizmi. Sve u svemu, naši su rezultati usklađeni s teorijom daljinskog očitavanja i signaliziranja, koja predlaže da prijenosnici lijekova i enzimi koji metaboliziraju lijekove sudjeluju u međuorganskoj i međuorganizamskoj komunikaciji putem prijenosa i modifikacije malih molekula za održavanje homeostaze (63, 64). Stoga je ključno razumjeti raspon endogenih fizioloških funkcija prijenosnika lijekova sustavno i lokalno.

Uz poboljšane podatke o metabolomiji, identificirali smo metabolite na koje utječe odsutnost OAT1 i OAT3 u modelima glodavaca i metabolite na koje utječe inhibicija OAT1 i OAT3 kod ljudi liječenih lijekovima koji inhibiraju OAT. Naša je skupina prethodno koristila mreže metaboličke rekonstrukcije za predviđanje metaboličke funkcije i izvijestila o nekoliko zajedničkih i jedinstvenih putova koje reguliraju OAT1 i OAT3 (43, 65). Međutim, te su studije bile ograničene ranim verzijama alata za rekonstrukciju i vrlo malo podataka o metabolomici. Ovdje, koristeći drugačiji pristup, analiza metaboličkog zadatka stavila je mnogo veći naglasak na ulogu OAT1 u intracelularnom metabolizmu triptofanabubreg. Naš se pristup može primijeniti za istraživanje endogenih funkcija drugih članova obitelji SLC i ABC i izgradnju odvojenih, ali preklapajućih mreža za sve te prijenosnike lijekova, koji se nalaze ne samo kod miševa, već i kod crva (20, 66). Takvi će prikazi također olakšati razumijevanje punog opsega DMI-ja za lijekove koji su u interakciji s OAT1, OAT3 ili oboje, što vjerojatno nadilazi jednostavnu konkurenciju na razini prijenosnika.

Eksperimentalne procedure

Životinje

Sve eksperimentalne protokole koji uključuju korištenje životinja odobrio je UCSD Institucionalni odbor za skrb i korištenje životinja (IACUC). Sa svim životinjama postupano je u skladu s Institucionalnim smjernicama o korištenju živih životinja za istraživanje. Odrasli mužjaci WT, Oat1 KO i Oat3 KO držani su odvojeno u ciklusu 12-h svjetlo-tama i omogućen im je ad libitum pristup hrani i vodi. Te su životinje opisane u prethodnim publikacijama (26, 27). Miševima tretiranim probenecidom davana je dnevna intraperitonealna injekcija od 200 mg/kg probenecida ili PBS-a 3 dana prije žrtvovanja. Posljednja injekcija primijenjena je 2 h prije žrtvovanja. Skupovi podataka korišteni za ovu analizu također su djelomično opisani (23, 24). Skup podataka Oat1 KO djelomično je proučavan iz kemoinformatičke perspektive, ali detaljna analiza puta nije provedena (23). Skup podataka Oat3 KO ponovno je analiziran i uspoređene su samo dvije skupine (24).

Studije s probenecidom na ljudima

Sve eksperimentalne protokole pregledao je i odobrio Institucionalni revizijski odbor i pridržavaju se Helsinške deklaracije o etičkim načelima. Uzorci pune krvi prikupljeni su od 20 osoba (14 žena, šest muškaraca). Prosječna dob bila je 30,85 ± 10,98, a prosječni BMI 24,18 ± 3,52. Sudionici koji nisu uzimali nikakve lijekove i bili su na vegetarijanskoj prehrani tijekom trajanja studije. Primijenjena je oralna doza od 1 grama probenecida, a nakon 5 sati ponovno je sakupljena puna krv. Svaki uzorak držan je zamrznut na –80 stupnjeva do metabolomičke analize.

Metabolomika Uzorci ljudskog seruma odmah su pohranjeni na –80 stupnjeva i otpremljeni na suhom ledu u Metabolon Inc. Uzorci mišjeg seruma su prikupljeni i analizirani, kao što je prethodno opisano (23, 24). Da ukratko rekapituliramo, za svaki je uzorak Metabolon Inc. izvršio ciljano metabolomičko profiliranje. Sustav MicroLab STAR tvrtke Hamilton Company korišten je za pripremu svakog uzorka, a za kontrolu kvalitete dodano je nekoliko standarda oporavka. Serum je istaložen s metanolom i miješan s Glen Mills GenoGrinder 2000 kako bi se uklonili proteini iz seruma i oslobodile molekule vezane na te proteine. Dobivena otopina je razdvojena u četiri manja uzorka. Dva su analizirana reverzno-faznom (RP) tekućinskom kromatografijom ultraučinkovitosti (UPLC) masenom spektrometrijom (MS) s ionizacijom elektrosprejom (ESI) s pozitivnim ionskim načinom rada. Jedan uzorak analiziran je pomoću RP/UPLC-MS/MS s negativnim ionskim modom ESI. Jedan uzorak je analiziran pomoću HILIC/UPLC-MS/MS. Organsko otapalo je uklonjeno stavljanjem svakog uzorka na TurboVap (Zymark).

Statistika

I za ljudske i za mišje uzorke, sirove vrijednosti normalizirane su na volumen, logaritamski transformirane, a vrijednosti koje nedostaju zamijenjene su najnižom promatranom vrijednošću za svaki spoj. U uzorcima ljudskog seruma, statistička značajnost određena je pomoću ANCOVA kontrasta koji uključuju BMI i dob. Za uzorke mišjeg seruma, značajnost je određena pomoću Welchovog t-testa s dva uzorka s metabolitima koji su postigli statističku značajnost (p Manje od ili jednako 0.05), kao i onima koji se približavaju značajnosti ( 0.05 Manje od ili jednako p Manje od ili jednako 0,10) uključeno u naknadne analize. Obogaćivanje je određeno pomoću jednadžbe 1, gdje je k broj značajno promijenjenih metabolita u podputu, m je broj metabolita u podputu, n je broj značajno promijenjenih metabolita u ukupnom skupu podataka, a N je broj izmjerenih metabolita u ukupnom skupu podataka.

Analiza metaboličkog zadatka

Za kvantificiranjebubregametaboličke funkcije i utjecaj promjena transportera OAT iz podataka o ekspresiji gena (41) (tj. podataka mikronizova iz bubrega Oat1 KO, Oat3 KO i njihovih kontrola divljeg tipa). Ova analiza predviđa aktivnost odabrane zbirke stotina zadataka koji pokrivaju sedam glavnih metaboličkih aktivnosti stanice (stvaranje energije, nukleotida, ugljikohidrata, aminokiselina, lipida, vitamina i kofaktora te metabolizam glikana) izravno iz transkriptomskih podataka korištenjem genoma. makete ljudskog metabolizma. Točnije, izračun relativne aktivnosti metaboličkog zadatka (tj. rezultata metaboličkog zadatka) oslanja se prvo na prethodnu obradu dostupnih transkriptomskih podataka i pripisivanje rezultata genske aktivnosti za svaki gen (67). Model ljudskog metabolizma na razini genoma dalje se koristi za identifikaciju popisa reakcija potrebnih za postizanje svakog metaboličkog zadatka i, radeći to, za identificiranje popisa gena koji mogu doprinijeti stjecanju metaboličke funkcije na temelju GPR pravila (tj. , Pravila genske proteinske reakcije). Stoga se rezultat metaboličkog zadatka izračunava kao prosječni rezultat aktivnosti svih gena koji doprinose metaboličkoj funkciji. Na taj način se transkriptomski podaci mogu izravno koristiti za kvantificiranje relativne aktivnosti svake metaboličke funkcije u određenom stanju.

Testovi transporta in vitro

Ljudski embrionbubreg(HEK)-293 stanice koje stabilno prekomjerno izražavaju ljudske OAT1 i OAT3 (Solvo Biotechnology) uzgajane su do konfluencije u Dulbeccovom modificiranom Eagleovom mediju (Invitrogen) dopunjenom s 10 posto fetalnog goveđeg seruma i 1 posto penicilina/streptomicina i održavane u 5 postotak CO2 na 37 C. Stanice s ekspresijom OAT1- odabrane su u prisutnosti blasticidina, a stanice s ekspresijom OAT3- odabrane su u prisutnosti puromicina. Obje stanične linije bile su negativne na kontaminaciju mikoplazmom. Prije funkcionalnih testova, stanice su postavljene na 96-pločice s jažicama, inkubirane 24 sata i dopunjene medijem. Eksperimenti konkurentnog unosa provedeni su inkubiranjem stanica u puferskoj otopini s fiksnom koncentracijom od 10 μM6-karboksifluoresceina i serijski razrijeđenom koncentracijom predloženog supstrata počevši od 2 mM. Pufer je uklonjen nakon 10-min inkubacije na sobnoj temperaturi, a stanice su isprane s DPBS tri puta. Zatim je procijenjena FL fluorescencija pomoću FL čitača fluorescentnih ploča. Vrijednosti IC50 određene su pomoću GraphPad Prism 8.

Vrijednosti fluorescentnog intenziteta normalizirane su tako da je najniža vrijednost postavljena na 0 posto, a najviša vrijednost postavljena je na 100 posto. Nakon normalizacije, podaci su prilagođeni nelinearnom modelu, a IC50 je određen pomoću jednadžbe 2.

Ki je zatim izračunat za svaki metabolit korištenjem Cheng-Prusoffove jednadžbe (jednadžba 3), s Km za hOAT1 HEK293 stanice izvedenim iz prethodnih eksperimenata (68).

Dostupnost podataka

Svi relevantni metabolomički podaci sadržani su u članku i dodatnom materijalu. Transkriptomski podaci dostupni su na zahtjev od snigam@health.ucsd.edu. hipotezu, nadzirao projekt, dizajnirao pokuse te napisao i uredio članak.

Financiranje i dodatne informacije—Ovaj rad je podržan donacijom Nacionalnog instituta za zdravlje (NIH) SKN-u Nacionalnog instituta općih medicinskih znanosti (NIGMS) (R01GM132938). Potpora za JCG dolazi iz potpore za obuku koju dodjeljuje Nacionalni institut za biomedicinsko oslikavanje i bioinženjering (NIBIB) (T32EB009380) i dodatka za R01GM132938. Ovaj je rad djelomično financiran velikodušnim financiranjem NIGMS-a za NEL (R35GM119850), Nacionalnog instituta za alergije i zarazne bolesti (NIAID) za NEL (UH2AI153029), LIFA stipendije za AR i stipendije za JMG od vlade Meksika ( CONACYT) i Institut Kalifornijskog sveučilišta za Meksiko i Sjedinjene Države (UC-MEXUS). Sadržaj je isključivo odgovornost autora i ne predstavlja nužno službena stajališta NIH-a. Neke brojke generirane su pomoću Biorendera. Ovaj je članak posvećen sjećanju na Vibhu Bhatnagar, dr. med., MPH.

Sukob interesa—Autori izjavljuju da nisu u sukobu interesa sa sadržajem ovog članka.

Kratice— Korištene kratice su: AhR, aril ugljikovodični receptor; CKD, kroničnabubregbolest; DMI, interakcija lijek-metabolit; ESI, elektrosprejna ionizacija; HEK, ljudski embrionbubreg; ILA, indol octena kiselina; KO, nokaut; RP/UPLC/MS, tekućinska kromatografija ultraučinkovitosti reverzne faze–spektrometrija mase.

Cistanche tubulosa sprječava bolesti bubrega, kliknite ovdje za uzorak

Od 1Odjela za bioinženjering, 2Odjela za pedijatriju, 3Odjela za biologiju, 4Odjela za biostatistiku i bioinformatiku, Odjela za obiteljsku medicinu i javno zdravstvo, 5Odjela za obiteljsku i preventivnu medicinu, 6Zakladnog centra za bioodrživost NovoNordisk na UC San Diego i 7Odjela za medicinu, Kalifornijsko sveučilište SanDiego, La Jolla, Kalifornija, SADUređeno

autora Mikea Shipstona

Reference

1. LopezNieto, CE, You, GF, Bush, KT, Barros, EJG, Beier, DR, i Nigam, SK (1997.) Molekularno kloniranje i karakterizacija NKT, genskog proizvoda koji se odnosi na obitelj prijenosnika organskih kationa koja je gotovo isključivo izraženo ububreg. J. Biol. Chem. 272, 6471-6478

2. Brady, KP, Dushkin, H., Fornzler, D., Koike, T., Magner, F., Her, H., Gullans, S., Segre, GV, Green, RM, i Beier, DR (1999. ) Novi navodni transporter mapira se na mutaciju osteoskleroze (oc) i nije izražen u OC mutiranom mišu. Genomika 56, 254–261

3. Riedmaier, AE, Nies, AT, Schaeffeler, E. i Schwab, M. (2012.) Organski transporteri aniona i njihove implikacije u farmakoterapiji. Pharmacol. Otkr. 64, 421–449

4. Ahn, SY, i Bhatnagar, V. (2008.) Najnovije informacije o molekularnoj fiziologiji transportera organskih aniona. Curr. Opin. Nefrol. hipertenzije. 17, 499–505

5. Nigam, SK (2018.) Obitelj prijenosnika SLC22: paradigma za utjecaj prijenosnika lijekova na metaboličke putove, signalizaciju i bolest. Annu. Rev. Pharmacol. 58, 663–687

6. Lowenstein, J. i Grantham, JJ (2016.) Ponovno rođenje interesa za funkciju bubrežnih tubula. Am. J. Physiol. Renal 310, F1351–F1355

7. Govindarajan, R., i Sparreboom, A. (2016.) Transporteri droge: napredak i prilike. Clin. Pharmacol. Ther. 100, 398–403

8. Vi, GF, i Morris, ME (2014.) Predgovor. U Molekularna karakterizacija prijenosnika lijekova i njihova uloga u dispoziciji lijekova, 2. izdanje. Wiley Ser Drug Disc, Hoboken, NJ. Xix

9. Nigam, SK, Wu, W., Bush, KT, Hoenig, MP, Blantz, RC, i Bhatnagar, V. (2015.) Rukovanje lijekovima, metabolitima i uremičkim toksinimabubregtransporteri lijekova u proksimalnim tubulima. Clin. J. Am. Soc. Nefrol. 10, 2039–2049

10. Bhatnagar, V., Richard, EL, Wu, W., Nievergelt, CM, Lipkowitz, MS, Jeff, J., Maihofer, AX, i Nigam, SK (2016.) Analiza ABCG2 i drugih prijenosnika urata u mokraćnoj kiselini homeostaze u kroničnombubregbolest: Potencijalna uloga daljinskog očitavanja i signalizacije. Clin.BubregJ. 9, 444–453 Uloga OAT1 i OAT3 u metabolizmu triptofana

12 J. Biol. Chem. (2021.) 296 100575

11. Nigam, SK i Bhatnagar, V. (2018.) Sustavna biologija prijenosnika mokraćne kiseline: uloga daljinskog očitavanja i signalizacije. Curr. Opin. Nefrol. hipertenzije. 27, 305–313

12. Nigam, SK i Bush, KT (2019.) Uremijski sindrom kroničnebubregbolest: Izmijenjeni daljinski senzori i signalizacija. Nat. vlč. Nefrol. 15, 301–316

13. Saito, H. (2010.) Patofiziološka regulacija bubrežnih prijenosnika organizacije SLC22A u akutnojbubregozljeda: farmakološke i toksikološke implikacije. Pharmacol. terapeut. 125, 79–91

14. Lepist, EI, i Ray, AS (2017.) Osim interakcija između lijekova: Učinci inhibicije transportera na antibiotike, hranjive tvari i toksine. Mišljenje stručnjaka. Lijek Metab. Toxicol. 13, 1075–1087

15. Duan, P., Li, SS, Ai, N., Hu, LQ, Welsh, WJ, i You, GF (2012.) Snažni inhibitori humanih organskih anionskih transportera 1 i 3 iz kliničkih biblioteka lijekova: Otkriće i molekularna karakterizacija . Mol. Pharmaceut. 9, 3340–3346

16. Evers, R., Piquette-Miller, M., Polli, JW, Russel, FGM, Sprowl, JA, Tohyama, K., Ware, JA, de Wildt, SN, Xie, W., Brouwer, KLR i Consortium, IT (2018.) Promjene povezane s bolešću u transporterima lijekova mogu utjecati na farmakokinetiku i/ili toksičnost lijekova: bijela knjiga Međunarodnog konzorcija transportera. Clin. Pharmacol. Ther.104, 900–915

17. Masereeuw, R., Mutsaers, HA, Toyohara, T., Abe, T., Jhawar, S., Sweet, DH, i Lowenstein, J. (2014.)bubregi uklanjanje uremičnog toksina: glomerul ili tubul? Semin. Nefrol. 34, 191–208

18. Liu, Y., Prentice, KJ, Eversley, JA, Hu, C., Batchuluun, B., Leavey, K., Hansen, JB, Wei, DW, Cox, B., Dai, FHF, Jia, WP , i Wheeler, MB (2016.) Brzo podizanje CMPF-a može djelovati kao prekretnica u razvoju dijabetesa. Cell Rep. 14, 2889–2900

19. Prentice, KJ, Luu, L., Allister, EM, Liu, Y., Jun, LS, Sloop, KW, Hardy, AB, Wei, L., Jia, WP, Fantus, IG, Sweet, DH, Sweeney , G., Retnakaran, R., Dai, FF i Wheeler, MB (2014.) Metabolit masne kiseline furana CMPF je povišen kod dijabetesa i izaziva disfunkciju beta-stanica. Cell Metab. 19, 653–666

20. Engelhart, DC, Granados, JC, Shi, D., Saier, MH, Jr., Baker, ME, Jr., Abagyan, R., i Nigam, SK (2020.) Analiza sustava biologije otkriva osam podskupina prijenosnika SLC22, uključujući OAT, OCT i OCTN. Int. J. Mol. Sci. 21, 1791