Kombinirana pangenomika i transkriptomika otkriva temeljne i suvišne procese virulencije u gljivičnom biljnom patogenu koji se brzo razvija
Dec 05, 2023
Sažetak
Pozadina
Proučavanje genomskih varijacija u patogenima koji se brzo razvijaju potencijalno omogućuje identifikaciju gena koji podupiru njihovu "osnovnu biologiju", koji su prisutni, funkcionalni i izraženi od strane svih sojeva ili "fleksibilne biologije", varirajući između sojeva. Geni koji podupiru fleksibilnu biologiju mogu se smatrati "priborima", dok je "osnovni" set gena vjerojatno važan za zajedničke značajke biologije patogene vrste, uključujući virulentnost na svim genotipovima domaćina. Patogena gljivica Zymoseptoria tritici predstavlja jednu od najbrže evoluirajućih prijetnji globalnoj sigurnosti hrane i bila je fokus ove studije.
koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav
Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda za jačanje imuniteta
【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Rezultati
Konstruirali smo pangenom od 18 europskih terenskih izolata, od kojih je 12 također bilo podvrgnuto profiliranju transkripcije RNAseq tijekom infekcije. Kombinirajući ove podatke, predvidjeli smo "osnovni" set gena koji se sastoji od 9807 sekvenci koje su bile (1) prisutne u svim izolatima, (2) bez inaktivirajućih polimorfizama i (3) eksprimirane u svim izolatima. Također je definiran veliki pomoćni genom koji se sastoji od 45% ukupnih gena. Klasificirali smo genetski i genomski polimorfizam na kromosomskoj i individualnoj genskoj skali. Proteini potrebni za bitne funkcije, uključujući virulentnost, imali su nižu od prosjeka varijabilnost sekvenci među ključnim genima. I središnji i pomoćni genomi kodirali su mnoge male, izlučene efektorske proteine kandidate koji vjerojatno stupaju u interakciju s biljnim imunitetom. Prekomjerna ekspresija u biljkama posredovana virusnim vektorom kod 88 kandidata nije uspjela identificirati nijednu koja je izazvala nekrozu lista karakterističnu za bolest. Međutim, funkcionalna komplementacija nepatogenog delecijskog mutanta kojem nedostaje pet osnovnih gena pokazala je da je puna virulencija obnovljena ponovnim uvođenjem jednog gena koji pokazuje najmanji polimorfizam sekvenci i najveću ekspresiju.
Zaključci
Ovi podaci podupiru kombiniranu upotrebu pangenomike i transkriptomike za definiranje gena koji predstavljaju srž i potencijalno iskoristive slabosti kod brzo evoluirajućih patogena.
Ključne riječi
virus mozaika lisičjeg repa, Septoria tritici, nekrotrofni efektor, esencijalni geni, pomoćni kromosomi, dotideomicete,Nestabilnost kromosoma, Mycosphaerella spp
Pozadina
Održiva kontrola zaraznih bolesti koje pogađaju životinje i biljke dovedena je u pitanje evolucijom uzročnika mikroorganizama [1, 2]. Bolesti koje je najteže kontrolirati su one koje uzrokuju vrste koje se najbrže razvijaju, a koje mogu brzo odgovoriti na selektivne pritiske, uključujući prirodni imunitet domaćina, nepovoljne uvjete okoliša i/ili lijekove protiv infekcija [1, 3]. Mogućnost brzog razvoja mikrobnih patogena određena je nekoliko značajki, uključujući među ostalim; (1) brz životni ciklus i (2) mehanizmi koji potiču spolnu reprodukciju [4]. Potonje može dovesti do velikih razina stalnih genetskih varijacija koje postoje unutar populacija patogena koje se mogu održati i pojačati usprkos vanjskim selektivnim pritiscima. Dok određeni geni mogu pokazivati prirodnu genetsku varijaciju sekvence, pokrećući njihovu evoluciju, drugi se ne mogu izgubiti (ili inaktivirati mutacijom) bez utjecaja na sposobnost patogena. Za eukariotske i prokariotske biljne patogene, ova razlika u razinama polimorfizama između gena dovela je do spoznaje "genoma s dvije brzine" [5], koji se sastoji od nekih komponenti koje se brzo razvijaju i za koje se smatra da reagiraju na vanjske pokretače (raspon domaćina i imunitet, itd.), dok skup koji se sporije razvija sadrži gene s glavnim kućanskim i drugim bitnim funkcijama. Pomoćni i središnji dijelovi genoma patogena mogu se sastaviti u "pangenom" koji bi trebao predstavljati gotovo kompletan skup gena prisutnih u vrsti [6]. Veličina jezgre i pomoćnih dijelova pangenoma varira unutar vrste bakterija, gljivica i oomiceta [7-13] i može dati naznaku potencijala da mikrobne populacije brzo evoluiraju do selektivnih pritisaka. Zamislivo je da što je veći pomoćni pangenom u odnosu na jezgru, to su te populacije sposobnije brzo se razvijati. Askomicetni gljivični patogen pšenice, Zymoseptoria tritici, uzročnik je pjegavosti Septoria tritici (STB), globalno važne bolesti koja ugrožava sigurnost hrane [14]. Patogen se također dugo smatrao modelnim sustavom za studije populacijske biologije i evolucije [15-18]. To je zato što Z. tritici ima visoku stopu spolne rekombinacije koja održava velike količine postojane genetske raznolikosti unutar svojih populacija i omogućuje brzu prilagodbu na globalnoj i lokalnoj razini [17, 19-24]. Kao posljedica toga, glavni geni pšenice koji daju otpornost na Z. tritici su brzo prevladani [25]. Osim toga, većina široko korištenih komercijalnih fungicida s vremenom gubi svoju učinkovitost [3]. Kombinacija ova dva čimbenika predstavlja prijetnju globalnoj proizvodnji pšenice koju je potrebno hitno riješiti. Z. tritici također se nedavno pojavio kao novi model za genomiku patogena s mnogim visokokvalitetnim referencama genoma koje su sada dostupne [26] uz pangenome konstruirane od velikog broja pojedinačnih genoma izolata [27, 28]. Možda je jedna od najzanimljivijih značajki genoma Z. tritici prisutnost 13 jezgrenih kromosoma (1-13) koji se nalaze u svim izolatima, ali zatim do daljnjih 8 manjih pomoćnih kromosoma (14-21) koji pokazuju prisutnost/odsutnost i strukturni polimorfizam između izolata [26, 29]. Srećom, jedan od referentnih izolata zajednice, i prvi koji je potpuno sekvenciran, nizozemski terenski izolat IPO323 prikupljen 1980-ih, nosi 21 kromosom, najveći broj uočen do danas. Stoga IPO323 služi kao izvrsno mjerilo za proučavanje varijacija u drugim izolatima i kao skela za izgradnju pangenoma.
cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav
Aseksualni ciklus infekcije Z. tritici tipičan je za mnoge srodne biljne patogene koji pogađaju mnoge prehrambene usjeve [30]. Ove gljive, koje pripadaju obitelji Mycosphaerellaceae iz reda Dothideomycetes, obično napadaju biljna tkiva kroz puči [30, 31]. Zatim slijedi razdoblje dugog asimptomatskog rasta među biljnim stanicama, koje traje najmanje 8 dana, koje naglo završava stvaranjem nekrotičnih lezija lišća, što je situacija koja se za Z. tritici pojavljuje kao rezultat "hiperaktivacije" biljke imunitet [32-34]. Smrt biljne stanice naknadno je povezana s stvaranjem novih sporulacijskih struktura, piknida, u substomatalnim šupljinama i naknadnim istiskivanjem i širenjem novonastalih piknidiospora tijekom razdoblja kišnih padalina. Pokazalo se da druge gljive Dothideomycetes izazivaju hiperaktivaciju biljnog imuniteta lučenjem proteinskih "efektora" koji su prepoznati u osjetljivim biljkama, što dovodi do smrti stanica i tkiva (nekroza ili programirana stanična smrt). Ove nekrotrofne gljive imaju koristi od ovog odgovora, a uključeni efektorski proteini sada se nazivaju nekrotrofni efektori [35, 36]. Iako postoje neki preliminarni dokazi da bi Z. tritici također mogao aktivirati nekrotrofne efektore pri prijelazu na simptomatski rast [37], izazivajući lezije lišća, ova hipoteza do danas nije robusno ispitana. Dva međusobno neisključiva puta za zaštitu buduće proizvodnje pšenice od utjecaja STB-a su (1) jačanje prirodne otpornosti biljaka na bolesti i (2) identificiranje novih molekularnih ciljeva koji bi se mogli iskoristiti za kontrolu bolesti. U idealnom slučaju, oni bi omogućili selektivnu kontrolu patogena, dok bi druge utjecaje na okoliš i okoliš sveli na minimum. Genomika patogena, a posebno pangenomika, nudi potencijal za proširenje obje strategije. Dok proteini kodirani pomoćnim, brzo evoluirajućim dijelom pangenoma mogu sadržavati mnoge gene koji stupaju u interakciju s biljnim imunitetom (npr. efektori), jezgra genoma može predstavljati mete koje mutiraju manje spremno zbog davanja negativne kazne prikladnosti (i virulencije). Iz tog razloga, poljoprivredni fungicidi obično ciljaju temeljne procese, koji se vjerojatno smatraju manje promjenjivima. Međutim, kao što je prethodno spomenuto, čak se i te mete mogu donekle razviti kako bi izbjegle kemijsku inhibiciju, kao što je opisano za mnoge trenutne ciljne proteine fungicida [3, 14]. Većina fungicida koji su se do danas koristili ciljano je djelovala na vrlo uzak skup molekularnih procesa (npr. biosinteza sterola, disanje, itd.) [3]. Postoji potencijalno mnogo drugih ciljeva koji bi se mogli koristiti za selektivnu kontrolu gljivičnih patogena koji bi trebali proizaći iz kombiniranja i analize više skupova podataka omics. Visoki potencijal za otkriće naglašava činjenica da tipično do 40% svih gena identificiranih u sekvencama genoma patogenih gljiva (i gljiva općenito) još uvijek ima nepoznatu funkciju. One koje su prisutne i možda sačuvane u jezgri genoma patogenih gljiva mogu biti od posebne važnosti.
Pangenomics of rapidly evolving pathogens could be used to identify core, potentially specific gene sets, which could be exploited in future disease control [11]. The premise is that genes which are not evolving, in an otherwise rapidly evolving species, are most likely to be essential for either life or important for key virulence processes of the pathogen. Pangenomes themselves have, to date, largely been defined by sequencing genomic DNA from multiple members of a species. Whilst this is a critical and indispensable step in ascertaining the full potential of a species' genomics, gene expression support is perhaps overlooked for refinement of core and accessory gene calls, particularly in relation to biological processes such as pathogenicity/virulence. For example, if a core gene, predicted through genomic DNA sequence analysis, is not expressed by a successful pathogenic strain/ isolate during infection, it might be more appropriately considered accessory. Pangenome analyses on fungi and yeasts have recently emerged and have highlighted some major differences in the size of core and accessory gene components. For example, one recent study which analyzed the animal pathogenic yeasts, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, the free-living yeast, Saccharomyces cerevisiae, and the animal filamentous fungal pathogen Aspergillus fumigatus, predicted each to have >80% gena označeno kao jezgra [10]. Međutim, druge analize plamenjačkih gljiva povezanih s biljkama predvidjele su veće pomoćne komponente gena uključujući ~38% za patogene Claviceps purpurea [38] i ~44% za Pyrenophora tritici-repentis [39]. Prethodne sveobuhvatne pangenomske studije o Z. tritici koristile su globalne i povijesne populacije koje su uključivale veliki broj izolata, koji su sekvencionirani na skalama fragmentiranog i potpunog genoma [27, 28]. Ove studije identificirale su veliki set pomoćnih gena (~40% svih gena) za ovu vrstu. Osim toga, to je bilo u korelaciji s opsežnom prisutnošću/odsutnošću i kromosomskim strukturnim polimorfizmima, također implicirajući dinamičke ponavljajuće elemente (uključujući elemente koji se mogu prenositi). Daljnja analiza je također pokazala da su mnogi pomoćni geni također niže izraženi (u prosjeku) od osnovnih gena. Ove studije predstavljaju "zlatni standard" za strukturu pangenoma vrste Z. tritici i najopsežnije do sada za bilo koju nitastu gljivu. Međutim, ostaje pitanje za ovu i druge vrste, u kojoj se mjeri pangenomika može koristiti za identifikaciju osnovnih gena i procesa virulencije. I unutar osnovnih skupova gena, odaju li razine polimorfizama u cijeloj populaciji koji utječu na promjene aminokiselina, kao i razine ekspresije gena, identitet ključnih gena za virulentnost patogena?
U ovoj studiji kombinirali smo sekvenciranje genoma i transkriptomske pristupe temeljene na RNAsequ kako bismo proizveli pangenom iz nedavne europske zbirke izolata Z. tritici. Naš glavni cilj bio je testirati imaju li geni prisutni unutar jezgre genoma koji kodiraju proteine s niskim stopama polimorfizma aminokiselina (tj. u kodirajućim sekvencama) između izolata, važne funkcije, uključujući glavne uloge u procesima infekcije jezgre na pšenici. U skladu s prethodnim studijama [27, 28], demonstrirali smo da Z. tritici ima iznimno velik pomoćni genom (~45% svih gena) koji podržava njegov status koji se brzo razvija. Nadalje, pružamo biološke podatke koji jasno podržavaju korisnost kombinirane upotrebe obje omics metode za identifikaciju novih osnovnih gena virulencije. Suprotno tome, probiri funkcionalne prekomjerne ekspresije proteina posredovani virusima nisu uspjeli identificirati nijednog kandidata za nekrotrofne efektore koji su odgovorni za izazivanje lezija bolesti u listovima pšenice, bilo iz jezgre ili akcesornog pangenoma.
biljka cistanche koja jača imunološki sustav
Rezultati
Ispitivanja virulencije na europskoj kolekciji Z. tritici identificiraju slične agresivne sojeve s geografski nepovezanih lokacija
Testirali smo 43 izolata Z. tritici na virulentnost na 21 široko osjetljivoj europskoj sorti krušne pšenice da bismo dobili ukupno 2709 podatkovnih točaka (uključujući tri ponavljanja). Podaci o izolatima (šifra i zemlja podrijetla) prikazani su u Dodatnoj datoteci 1: Tablica S1. Svaka interakcija procijenjena je kvantitativno za sljedeće parametre: (1) duljinu razdoblja inkubacije, (2) vrijeme potrebno da se postigne potpuna nekroza (kada se dogodila) i (3) razine nespolne sporulacije (slika 1A). Na temelju računalnog i vizualnog bodovanja bolesti (vidi Metode i Dodatnu datoteku 2: Slika S1), svi izolati su zatim grupirani na temelju njihovih profila virulencije na testiranoj ploči kultivara (Slika 1B). Izolat pozitivne kontrole IPO323, koji služi kao globalna referenca [26] s potpuno sekvenciranim genomom, bio je manje agresivan od većine testiranih izolata protiv gotovo svih kultivara. Ovaj je izolat sakupljen ~1984. i od tada je čuvan u skladištu, uz povremeni prelazak kroz listove pšenice; stoga je trenutačno nejasno može li ovo opažanje (barem djelomično) proizaći iz pohranjivanja uzoraka tijekom vremena. Identificirali smo sedam izolata koji nisu mogli proizvesti simptome bolesti ni na jednom kultivaru pšenice (slika 1B). Budući da svi ovi izolati potječu iz Španjolske ili Italije, gdje se tetraploidna (durum/tjestenina) pšenica (Triticum durum L.) češće uzgaja, vjerojatno je da su ovi izolati bili specifični za tvrdu pšenicu [40, 41]. Značajno je da se izolati sa sličnim profilima virulencije nisu grupirali na mjestu sakupljanja, s izolatima koji potječu od dalekog istoka kao što je Slovačka do krajnjeg zapada kao Irska i svi su se grupirali zajedno (slika 1B). Ovo se zapažanje dobro slaže s visokim razinama genetske varijacije koja postoji između izolata i prethodnim studijama koje su pokazale da je to jednako visoko na ljestvici pojedinačne lezije lista pšenice, kao i na svim kontinentima [42]. Mnogi od agresivnijih izolata s različitim profilima virulencije naknadno su odabrani za genomsko sekvenciranje (označeno s "#" na slici 1B) i RNAseq analizu (označeno s "+" na slici 1B).
Slika 1. Procjena virulencije europske kolekcije izolata protiv niza heksaploidnih (krušnih) kultivara pšenice. Tipični vremenski tijek napredovanja bolesti koji prikazuje parametre procijenjene na ekranu, uključujući vrijeme potrebno do pojave prvih vidljivih simptoma i do pojave potpune nekroze lista u inokuliranom području. Na slici je prikazana infekcija pšenice sorte Riband izolatom Z. tritici IPO323. B Profil virulencije izolata u odnosu na panel kultivara na temelju razina nekroze i kloroze lista. Mjerenja su obavljena vizualnim procjenama i korištenjem softvera za analizu slike LemnaTec i LemnaGrid s usporedivim konačnim rezultatima. Izolati su rangirani i grupirani na temelju podataka o virulenciji. Izolati Z. tritici označeni s # sekvencirani su genomom da bi se konstruirao pangenom. Izolati označeni + također su analizirani RNAseq transkriptomikom. Utvrđeno je da je sorta pšenice Panorama (istaknuta X) jednako i potpuno osjetljiva na većinu izolata te je odabrana kao genotip domaćina za RNAseq infekcije lista. Imajte na umu da podaci o niskoj virulenciji za izvanskupinu od sedam izolata protiv svih kultivara vjerojatno proizlaze iz toga što su ti izolati prilagođeni za izazivanje bolesti na tetraploidnoj pšenici (durum ili tjestenina). Svi su podaci reprezentativni za tri zaražena lista analizirana/s kojima je došlo do interakcije iz dva biološka ponovljena pokusa (ukupno 6 listova). C SplitsTree analiza molekularne filogenije izolata odabranih za genomsko sekvenciranje. Zemlja podrijetla izolata prikazana je kraticom (Pl=Poljska; GB=Velika Britanija; Be=Belgija; Cz=Češka; Ge {{8 }} Njemačka; Sw=Švedska; Fr=Francuska; Sl=Slovačka; Ir=Irska). Referentni izolat, IPO323 prikupljen ~1984. iz Nizozemske (Ne) također je predstavljen
Sekvenca genoma i filogenetska analiza na sedamnaest europskih izolata otkrivaju visoku razinu genetske raznolikosti
We used Illumina HiSeq 250 bp paired-end read technology to assemble the gene space of seventeen new isolates (indicated by # in Fig. 1B). BUSCO analysis (core dataset Pezizomycotina) was then performed to assess the completeness of each genome assembly (Table 1). Scores >97% u svim slučajevima pokazalo je dobru sklop genskog prostora (kodirajuće regije) za sve izolate. Nekoliko odabranih BUSCO gena nedostajalo je u svim sklopovima što sugerira da Z. tritici možda nema ortologe ovih gena. Kako bismo odredili količinu genetske varijacije koja utječe na predviđena kodirajuća područja, zatim smo proveli SNPEf analizu za svaki soj u odnosu na pangenom izgrađen na cijelom genomu referentnog izolata IPO323 (Tablica 2). Ova analiza je pokazala da svaki novi soj ima više od 160000 SNP-ova u odnosu na izvedeni pangenom. Među njima je bilo više od 65, 000 koji su ili uzrokovali potencijalni gubitak funkcije proteina (jaki učinak, pomak okvira, izgubljeni početak, preuranjeni stop kodoni) ili su izazvali promjenu aminokiselina u predviđenim proteinima (umjereno). Ovi podaci pokazali su postojanje genetske raznolikosti između izolata Z. tritici.
Analiza podijeljenog stabla provedena je na 17 novosekvenciranih sojeva i IPO323 kako bi se utvrdilo jesu li izolati sa sličnim obrascima infekcije kultivara imali bilo kakav filogenetski odnos i je li to povezano sa zemljom podrijetla. Filogenija je određena ulančavanjem šest kodirajućih i nekodirajućih sekvenci (vidi Metode i Dodatnu datoteku 3: Podaci S1). Stablo (Sl. 1C) još jednom pokazuje da nije bilo jasne veze između profila virulencije i mjesta uzorkovanja za sekvencirane izolate, s blisko povezanim profilima virulencije (u usporedbi sa Slikom 1B) viđenim za izolate prikupljene iz različitih europskih zemalja koji su ipak bili filogenetski blisko povezani.
Konstrukcija i analiza pangenoma predviđa 9807 "jezgrenih" i 8083 "dodatnih" gena
Osim sekvenci genoma, odabrali smo 12 izolata za profiliranje transkripcije temeljeno na RNAseq (označeno + na slici 1B). Svaki izolat je profiliran u tri primjerka tijekom aksenskog rasta u YPD bujonu i također u dva neovisna stadija infekcije lišća; 6 dana nakon inokulacije (dpi) predstavlja srednju fazu bez simptoma i 9 dpi, u prijelaznoj fazi ranog razvoja simptoma. Za testove infekcije korištena je univerzalno osjetljiva sorta pšenice Panorama, koju su svi izolati uspjeli u potpunosti zaraziti nerazlučivom kinetikom. Koristeći podatke o transkriptomu u kombinaciji s novim sklopovima genoma i izvornom referentnom sekvencom IPO323 kao skelom, odredili smo pangenom za europske izolate koji također uključuje sekvence prisutne u drugim izolatima koji nisu otkriveni u IPO323. Koraci u konstrukciji pangenoma i naši kriteriji za kategorizaciju gena kao "jezgre" ili "pomoćnih" prikazani su na slici 2. Važno je, polimorfizam sekvence inaktivacije (visoki učinak, gubitak funkcije-LoF), te prisutnost i odsutnost, razmatranja također su potkrijepljeni dokazima o ekspresiji gena. Stoga bi gen trebao biti prisutan u funkcionalnom obliku i eksprimiran u svim izolatima, kako bi se svrstao u kategoriju "core". Naš cjelokupni pristup (slika 2) definirao je ukupni pangenom od 17 890 gena, uključujući 2017, koji nisu bili prisutni u IPO323. Naknadni koraci filtriranja kategorizirali su 9807 da se nalazi u jezgri genoma, sa samo nešto manjim brojem, 8083, u dodatnom setu. Potonji predstavlja ~45% ukupnog pangenoma, blago povećanje u odnosu na prethodno opisano [28]. Dok se ovi brojevi općenito dobro slažu, procjene pomoćnih gena su subjektivnije u pogledu pristranosti zbog korištenih metoda (Panseq, itd.) i ne možemo pretpostaviti da dodatna buduća analiza možda neće smanjiti broj pomoćnih gena koristeći, na primjer, ortološki temeljene pristupa. Svi pangeni su analizirani na više značajki (predviđanja sekrecije, povezanosti s membranom, lokalizacija i sadržaj cisteina) i predviđenih funkcija (oznake BLAST, GO i Interpro). Prikazana je tablica sa svim dostupnim informacijama o svim genima (Dodatna datoteka 4: Tablica S2). Tablica također prikazuje relativne srednje razine genske ekspresije izvedene iz RNAseq određene za sve gene za svih 12 izolata u tri testirana uvjeta. Zajedno, u usporedbi s prethodnim pangenomskim studijama o ovom organizmu [27, 28], jasno je da Z. tritici ima jedan od najvećih brojeva pomoćnih genetskih komponenti gljiva proučavanih do danas, što vjerojatno odražava njegov brzi razvoj priroda.
Tablica 1 BUSCO analiza novih genoma
Tablica 2. Sažetak učinaka SNP-a za svaki novi genom u odnosu na modele referentnih gena IPO323
Slika 2 Sažetak koraka korištenih za generiranje "jezgrenih" i "pomoćnih" genskih naziva i brojeva za novokonstruirani europski pangenom Z. tritici. Brojevi predstavljaju broj gena identificiranih u svakoj fazi procesa
Strukturne značajke varijacije u europskom pangenomu Z. tritici
Cilj ove studije bio je testirati hipotezu da se pangenomika može iskoristiti za identifikaciju važnih novih gena, bilo bitnih za život ili za virulentnost u patogenim organizmima. Pretpostavili smo da bi to bili geni prisutni i funkcionalni u svakom soju patogena i izraženi od strane svakog soja patogena. Nadalje smo nagađali da bi ti geni imali niže razine SNP mutacija s visokim i umjerenim učinkom koje utječu na kodirajuće sekvence (manje polimorfne) i da bi se mogli grupirati u regijama na određenim kromosomima.
Koristili smo podatke o varijacijama SNP-a (visoke, umjerene i modifikatorske - vidi Dodatnu datoteku 4: Tablica S2), kao i podatke o srednjoj ekspresiji za sve gene, kako bismo istražili prosječne razine polimorfizma kodiranja i ekspresije na kromosomskoj osnovi, koristeći 21 kromosom od IPO323 kao skela. Modifikatorski SNP-ovi predstavljaju promjene nukleotida koje ne dovode do promjene aminokiselina. Slika 3A pokazuje da nije postojala posebna pristranost za učestalost mutacije kada su kumulativni visoki, umjereni i modifikatorski SNP-ovi izraženi kao značajka prosječne duljine proteina po cijelom kromosomu. Međutim, kada su izostavljene modifikatorske mutacije, tj. one koje ne uzrokuju promjenu aminokiselina, postalo je jasno da najmanjih 8 kromosoma posjeduje gene s većim brojem visokih i umjerenih SNP mutacija (slika 3B). Ovaj je učinak dodatno naglašen kada su analizirani samo SNP-ovi visokog učinka (Slika 3C). Za razliku od razina vidljivih na jezgri kromosoma 1-13 (~20%), do 90% gena koji se nalaze na osam najmanjih kromosoma 14-21 bilo je podložno visokom učinku, vjerojatno mutacijama gubitka funkcije u barem jednoj izolirati (slika 3C). Podaci o kumulativnoj transkripciji svih 12 novih izolata također su pokazali relativno nisku prosječnu ekspresiju gena prisutnih na kromosomima 14-21 (Sl. 3D), kao što je prethodno primijećeno za IPO323 [32, 43, 44]. Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju na jasnu genomsku kompartmentalizaciju, s najmanjih osam akcesornih kromosoma koji sadrže nizove koji su visoko polimorfni, akcesorni i općenito slabo izraženi.
Usporedbom svih gena bilo u jezgri genoma bilo u pomoćnom genomu otkriveno je da je ~60% svih gena u potonjem pronađeno u barem jednom soju s mutacijom visokog učinka (gubitak funkcije (LoF)) i da 47% također nije bilo u najmanje jedan soj (Dodatna datoteka 4: Tablica S2). Slično analizi pomoćnih kromosoma, pojedinačni pomoćni geni također su bili vrlo slabo izraženi općenito u testiranim izolatima (dodatna datoteka 4: tablica S2) i imali su daleko veći broj sekvenci s nepoznatim funkcijama (približno 80%). Ova opažanja dobro se mogu usporediti s prethodnim pangenomskim studijama provedenim na globalnim zbirkama Z. tritici prikupljenim u razmaku od nekoliko desetljeća [27, 28].
Također smo izvršili analizu varijacije prisutnosti i odsutnosti gena po genu (PAV) za sve gene predviđene u referentnom izolatu IPO323, za ostalih 17 sekvenciranih izolata. Podaci o prisutnosti/odsutnosti ucrtani su poziciono za svaki gen preko svakog od 21 kromosoma prisutnog u IPO323. Slike 3E i F prikazuju podatke za reprezentativne jezgrene kromosome (1 i 7), dok slike 3G i H prikazuju podatke za reprezentativne pomoćne kromosome (13 i 14). Podaci za preostale kromosome prikazani su u Dodatnoj datoteci 2: Slika S2. Ova analiza je identificirala mnoge gene prisutne u IPO323 koji nedostaju u brojnim ponovno sekvenciranim izolatima i jasno pokazuje razliku u ukupnoj prisutnosti/odsutnosti gena između "jezgrenih" kromosoma IPO323 (koji se nalaze u svakom soju Z. tritici) u usporedbi s 8 najmanjih "pomoćnih" kromosoma. Podaci također naglašavaju regiju na kromosomu 7, između 1,7 Mb i 2,5 Mb, koja pokazuje visoku učestalost odsutnosti gena u novim izolatima (slika 3F). Zanimljivo je da ova regija točno odgovara lokaciji genoma za koju je ranije viđeno da ima minimalnu ili nikakvu ekspresiju gena u IPO323 bilo tijekom rasta u kulturi ili tijekom bilo koje faze infekcije biljke [32, 43]. Ova regija također odgovara kromosomskoj deleciji, koja je primijećena u jemenskom izolatu u prethodnoj studiji pangenoma [28]. Zajedno, ovi podaci potvrđuju ideju da Z. tritici predstavlja organizam koji se brzo razvija s visokim razinama i različitim tipovima genetske i genomske raznolikosti unutar svoje populacije.
Predviđanja lokalizacije proteina otkrivaju gene u pomoćnom pangenomu koji mogu funkcionirati u prilagodbi promjenjivim okruženjima
WolfPsort predviđanja lokalizacije proteina provedena su na svim proteinima kodiranim pangenomom. Zatim smo izračunali relativni postotak proteina za koje se predviđa da će se lokalizirati u svakoj podstaničnoj regiji kao obilježje ukupnog broja proteina za jezgru ili pomoćni pangenom (slika 4). Nekoliko lokalizacijskih kategorija obogaćeno je u jezgri genoma, uključujući "citoplazmu", "izvanstaničnu" i "plazma membranu", od kojih potonja sadrži mnoge ključne transportne funkcije (slika 4). Naprotiv, lokacije "nukleus" i "mitohondriji" bile su povezane s većim postotkom gena u akcesornom genomu (slika 4). Dodatni genom je obogaćen za određene domene vezanja cinka koje mogu osigurati fleksibilnost transkripcije. Obogaćivanje ove kategorije također je zabilježeno u prethodnoj studiji pangenoma koja je istaknula da je naš cjelokupni niz generirao usporedive rezultate [27, 28]. "Mitohondrijsko" obogaćivanje je zanimljivo jer postoje pseudogeni i paralozi vjerodostojnih mitohondrijskih proteina koji su ciljani kemijskim spojevima protiv gljivica. Jedan jasan primjer u akcesornom pangenomu je paralog sukcinat dehidrogenaze podjedinice C (SDHC3) za koju se pokazalo da posreduje u stalnoj otpornosti prema podklasi SDHI (inhibitor sukcinat dehidrogenaze) fungicida u Z. tritici [45]. Identificirali smo potpune sekvence ovog gena u samo tri od sedamnaest sekvenciranih izolata, a otkrili smo visoku razinu ekspresije gena u samo jednom od 12 koje je naknadno proučavao RNAseq (slika 5B). Unatoč tome, prethodna studija i naša trenutna analiza naglašavaju da doista postoje važne funkcije u pomoćnom genomu, ali da su one vjerojatno važnije za prilagodbu promjenjivim okruženjima nego za osnovni način života.
Slika 3. Strukturne značajke pangenoma i polimorfizmi prisutnosti/odsutnosti na 21 kromosomu referentnog izolata IPO323. Ukupan broj kumulativnih SNP mutacija koje daju modifikatorske, umjerene (M) i visoke (H-gubitak funkcije-LoF) promjene utjecaja izražene kao značajka prosječne duljine proteina (aa) po kromosomu. B Ukupan broj kumulativnih SNP mutacija koje daju umjerene i jake promjene utjecaja izražene kao značajka prosječne duljine proteina po kromosomu. C Ukupan broj kumulativnih SNP mutacija koje uzrokuju promjene velikog utjecaja izražene kao značajka prosječne duljine proteina po kromosomu. D Prosječna prosječna ekspresija svih gena prisutnih na svakom od 21 kromosoma u svim izolatima. E Polimorfizam prisutnosti i odsutnosti (PaV) gena predviđen na jezgri kromosoma 1 izolata IPO323 u 17 novosekvenciranih izolata. F PaV za gene na jezgrenom kromosomu 7. G PaV za gene na akcesornom kromosomu 15. G–F PaV za gene na akcesornom kromosomu 15. Podaci ističu opsežne regionalne varijacije i označavaju jasnu razliku između razina ukupnih polimorfizama sekvenci i prisutnosti/ odsutnost evidentna na jezgri i pomoćnim kromosomima
Slika 4 Predviđena lokalizacija proteina kodiranih core i pomoćnim genima. Sažetak postotka predviđenih lokalizacija proteina koje je odredio WolfPsort za kategorije naznačene u odnosu na ukupne proteine prisutne u jezgri i pomoćnom pangenomu
Efektorski proteini u pomoćnom genomu pokazuju veću varijabilnost među sojevima u ekspresiji od onih u jezgri
Više od osam posto gena u jezgri genoma kodiralo je navodne izlučene proteine, broj veći od onog za pomoćni genom (~5%). Međutim, geni u pomoćnom genomu koji kodiraju izlučeni protein češće su bili nepoznate funkcije, bez prepoznatljivih domena ili katalitičkih regija. Ovi proteini nepoznate funkcije činili su ~75% ukupnog pomoćnog sekretoma u odnosu na 42% za središnji sekretom. Mnogi kandidati (i u nekim slučajevima potvrđeni) efektori prisutni u jezgri genoma bili su izraženi u sličnim obrascima i do usporedivih razina, u svih dvanaest izolata koje je analizirao RNASeq. Na primjer, tri efektora koji sadrže domenu LysM (Lysin), 3LysM, 1LysM i xLysM, eksprimirani su do vrlo sličnih razina i u identičnim obrascima kod svakog soja (Slika 5C–E). 3LysM efektor ostaje jedina glavna izlučena determinanta virulencije Z. tritici, gdje ovaj protein služi za suzbijanje biljne imunosti izazvane hitinom tijekom rane infekcije [46, 47]. Međutim, poznato je da sva tri LysM efektora rade zajedno u tu svrhu [48]. Stoga je vrijedno spomena da je postojala vrlo mala varijacija ekspresije ovih gena među izolatima, što potvrđuje sugestije da je ova obrambena supresija ključna komponenta infekcije. Nasuprot tome, efektori kandidati pronađeni u pomoćnom genomu pokazuju varijacije prisutnosti i odsutnosti i vrlo varijabilnu ekspresiju između izolata (Slika 5F-H). Na primjer, AvrStb6, prvi efektor avirulencije identificiran u Z. tritici, [49, 50] pokazuje značajne varijacije ekspresije (Sl. 5F), unatoč tome što je prisutan u svim izolatima. Ovu varijablu sekvence, mali, izlučeni protein, prepoznaju kultivari pšenice koji sadrže funkcionalne alele receptorske kinaze Stb6 [25, 51]. Ovo prepoznavanje osigurava otpornost na bolesti protiv svih izolata koji sadrže određeni alel ovog efektora. Postojala je značajna varijacija ekspresije AvrStb6 između izolata i identificirali smo jedan izolat (Zt118) kod kojeg nismo uspjeli otkriti nikakvu ekspresiju, ni u jednom od tri testirana stanja. Iz tog razloga, u našem nizu predviđanja, AvrStb6 je klasificiran u pomoćni genom. Mnogi drugi kandidati za efektore trenutno nepoznatih funkcija pokazali su značajnu prisutnost/odsutnost i/ili varijaciju ekspresije u pomoćnom genomu (Sl. 5G i H).
Slika 5 Varijacija ekspresije gena u jezgri i akcesornom pangenomu i uspostavljanje prolaznog sustava prekomjerne ekspresije virusa koji se koristi za ekrane nekrotrofnih efektora. Ključ za tumačenje podataka prikazan je na slikama. B Prisutnost/odsutnost i varijacija ekspresije gena za paralog C podjedinice sukcinat dehidrogenaze koji je prisutan u pomoćnom genomu. C–E profili ekspresije ZtLysM efektora, 3LysM, 1LysM i xLysM, svi prisutni u jezgri pangenoma. F Ekspresijski profil efektora avirulencije AvrStb6. Nedostatak bilo kakve ekspresije u izolatu 118 svrstava efektor u akcesorni pangenom. G i H predstavljaju primjere dodatnih kandidata za efektore u akcesornom pangenomu.
Funkcionalni ekrani ne pružaju dokaze o nekrotrofnoj efektorskoj aktivnosti bilo u jezgri ili dodatnom pangenomu
Usvojili smo nedavno razvijen sustav prolazne ekspresije proteina posredovan virusnim vektorom za pšenicu (i druge žitarice i usjeve bez žitarica), koristeći virus mozaika lisičjeg repa (FoMV), kako bismo izvršili skrining srednje do visoke propusnosti kandidata za efektore Z. tritici iz pangenoma. Posebno smo željeli ispitati ima li itko sposobnost induciranja nekroze na malom panelu kultivara pšenice, što bi moglo implicirati njihovu funkciju pri prijelazu na simptome bolesti kao "nekrotrofni efektori" [36, 52]. Za ovu smo studiju napravili neke izmjene u prethodno objavljenom sustavu [53]. Kako bismo potaknuli ekstracelularno izlučivanje proteina u pšenici, upotrijebili smo signalni peptidni slijed proteina 1 (TaPR1) povezan s patogenezom pšenice, optimiziran kodonom za Arabidopsis thaliana, koji je zatim fuzioniran unutar okvira sa svakim kandidatskim efektorskim slijedom gljivica sintezom gena (Sl. 5I). Učinkovitost signalnog peptida TaPR1 u lučenju funkcionalnih izvanstaničnih proteina Z. tritici utvrđena je njegovom sposobnošću da inducira nekrozu lista u duhanu kada se postavi ispred nekroze Z. tritici i proteina sličnog induciranju etilena (ZtNLP), koji je funkcionalan samo kada su ciljani za izvanstaničnu sekreciju (slika 5 Jl) [54]. Zatim smo potvrdili da vektor može prekomjerno eksprimirati proteine jednako dobro u nizu kultivara pšenice vizualizirajući lokalnu i sustavnu ekspresiju zelenog fluorescentnog proteina (GFP) kroz listove različitih kultivara pšenice (dodatna datoteka 2: slika S3). Konačno, zatim smo testirali sposobnost dobro karakteriziranog nekrotrofnog efektora SnToxA, iz srodnog patogena pšenice Parastagonospora nodorum, da inducira nekrozu u listovima pšenice genotipova koji posjeduju gen osjetljivosti Tsn1 [55]. Kao što se očekivalo, prekomjerna ekspresija SnToxA posredovana FoMV-om, sa signalnim peptidom TaPR1, izazvala je nekrozu samo na kultivaru pšenice koji posjeduje Tsn1 (cv Halberd na slici 5K) bez simptoma uočenih na kultivarima kojima nedostaje ovaj gen za osjetljivost (cv Riband na slici 5K ). Ovi su podaci potvrdili da je sustav prekomjerne ekspresije posredovan virusnim vektorom bio prikladan za probir većih razmjera kandidata za efektore Z. tritici kako bi se identificirali svi s nekrotrofnom efektorskom aktivnošću. Odabrano je ukupno 88 kandidata koji su pregledani u odnosu na pet kultivara pšenice (Dodatna datoteka 5: Tablica S3). Oni su obuhvaćali 66 proteina koji se nalaze u jezgri pangenoma i 22 iz pomoćnog. Odabrani geni (Dodatna datoteka 5: Tablica S3) bili su u rasponu od osnovnih gena bez polimorfizama specifičnih za soj (monomorfni) i s visokom ekspresijom planta, do onih u pomoćnom genomu koji pokazuju prisutnost/odsutnost i/ili značajan polimorfizam ekspresije. U svim pokusima, izvodile su se paralelne tehničke kontrole ToxA protiv cv Halberd i cv Riband, koje su uvijek davale očekivane rezultate. Nasuprot tome, niti jedan od 88 testiranih prekomjerno izraženih proteina Z. tritici nije izazvao nekrozu lista ni na jednoj sorti pšenice. Ukratko, ovi rezultati nisu pružili nikakve dokaze za nekrotrofne efektore, pa prema tome, ni za jednog od testiranih kandidata u induciranju prijelaza na nekrotrofni rast tijekom infekcije.
cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav
Glavni geni koji kodiraju proteine s dokazanim ili predviđenim funkcijama bitnim za život ili ključnim funkcijama virulencije imaju niže ukupne razine polimorfizma aminokiselina
Izvršili smo pretragu literature kako bismo identificirali sve gene Z. tritici koji su bili podvrgnuti funkcionalnoj karakterizaciji, bilo u virulenciji ili kao esencijalni geni koji datiraju do 2018. Time je generiran popis od 28 proteinskih sekvenci (Dodatna datoteka 6: Tablica S4). Slično tome, identificirali smo popis od 26 proteina koji su također bili funkcionalno karakterizirani, ali se pokazalo da ne igraju glavnu ulogu u virulenciji ili da su esencijalni (Dodatna datoteka 6: Tablica S4). Zatim smo istražili razine kumulativnih redundantnih visokih i umjerenih mutacija u tim genima i izrazili njihove vrijednosti kao značajku svake duljine proteina, a zatim odredili prosječne vrijednosti za skup. Slika 6 naglašava da su objavljeni geni koji utječu na virulentnost imali statistički značajno manju učestalost (p=0.007) mutacija (polimorfizam) od onih za koje se pokazalo da su funkcionalno redundantni.
Studije usmjerene na definiranje esencijalnih gena za život (esencijalnih) u filamentoznim gljivama (isključujući kvasce) su malobrojne, a do danas postoji samo jedan predstavnik u bazi podataka esencijalnih gena (DEG), koji dolazi od oportunističkog ljudskog patogena Aspergillus fumigatus [56–58]. Identificirali smo ortolog Z. tritici svih 28 gena za koje se eksperimentalno pokazalo da su bitni za život u A. fumigatus i ponovno izračunali relativne stope mutacije svakog u odnosu na duljine sekvenci (dodatna datoteka 7, tablica S5). Još jednom smo pronašli jasno statistički značajno smanjenje (p=0.0148) u učestalosti visokih i umjerenih mutacija SNP-a u tim esencijalnim genima kandidatima, zatim promatrano za gene za koje se pokazalo da nisu bitni ni za virulentnost ni za život ( Slika 6). Nasuprot tome, nije bilo značajne razlike (p=0.2128) između stopa mutacije za eksperimentalno potvrđene gene virulentnosti i predviđenih esencijalnih gena (slika 6). Ovi podaci zajedno podupiru koncept da se razine polimorfizama aminokiselina u populacijama mogu koristiti za predviđanje relativne važnosti gena za osnovni životni stil organizma.
Slika 6. Analiza ključnih setova gena eksperimentalno potvrđene patogenosti i/ili predviđenih gena bitnih za život otkriva niže stope mutacije nego što se vidi u neesencijalnim genima. Prosječna visoka i umjerena (H/M) stopa mutacije izražena kao značajka duljina proteina (aa) za popise gena koji kodiraju proteine koji su bili; 1- eksperimentalno utvrđeno da nema (ili ima vrlo malu) ulogu u virulenciji gljivica; 2-eksperimentalno utvrđeno da igra važnu ulogu u virulenciji i; 3-predviđeno da kodira navodne gene neophodne za život kroz ortologiju u proteine eksperimentalno karakterizirane u Aspergillus fumigatus. Simbol zvjezdice (*) označava statistički značajnu razliku između stopa mutacije između naznačenih skupova gena. Popisi gena i povezani podaci o polimorfizmu prikazani su u Dodatnoj datoteci 6: Tablica S4
Korisnost kombiniranog prediktivnog pristupa za otkrivanje slabosti patogena podržana je studijama genetske komplementacije na mutantu s brisanjem gena s pet "jezgri"
Z. tritici podložna je prosljeđivanju genetskih pregleda temeljenih na nasumičnim integracijama T-DNA putem gljivične transformacije posredovane Agrobacterium (AMT). Naš prethodni rad generirao je posebno jedan T-DNA mutant Z. tritici koji nije bio u stanju uzrokovati potpunu bolest na zaraženom lišću pšenice (slika 7A). Ovaj mutant, nazvan 23-21 (23. runda transformacije i 21. odabrana kolonija), mogao je normalno rasti kao divlji tip na agarnoj podlozi bogatoj hranjivim tvarima (YPD), ali nije uspio proširiti usporedive razine gljivičnih hifa kada se uzgajao na hranjivi medij, uključujući vodeni agar (slika 7A). Koristili smo ponovno sekvenciranje 23-21 temeljeno na Illumini cijelog genoma kako bismo otkrili položaj potencijalno uzročne insercije T-DNA. Ova analiza otkrila je jednu integraciju T-DNA između položaja 899878 i 912699 na kromosomu 8, uzrokujući brisanje/prekid pet predviđenih sekvenci kodiranja (Slika 7B). SNP i indel analiza nisu otkrile dodatne neoznačene mutacije u soju 23-21 u odnosu na sekvencu divljeg tipa genoma IPO323. 23-21 T-DNA delecijom učinkovito je uklonjeno pet gena, od kojih se svi nalaze u jezgri genoma, i sa sljedećim funkcionalnim (Interpro) predviđanjima; gen 1=Citokrom P450; gen 2=S-adenozil metionin metiltransferaza; gen 3=Cink (2) C6 tip DNA veznog proteina; gen 4=nukleozid difosfat kinaze (NDK) i gen 5=glikozil hidrolaze 31 (slika 7B). Istraživali smo relativne brojeve visokih i umjerenih mutacija u svakom proteinu kao značajku duljine proteina, što je otkrilo da protein 4 (NDK) ima daleko manje mutacija koje utječu na promjene sekvence aminokiselina nego ostale četiri analizirane sekvence u izoliranom skupu (Sl. 7C i Dodatna datoteka 2: Slika S4). Zatim smo istražili prosječnu relativnu ekspresiju svih pet gena u svim testiranim izolatima. Također je otkriveno da je gen 4 (koji kodira NDK) bio značajno izraženiji od svih ostalih kandidata (Slika 7D i Dodatna datoteka 2: Slika S5). Stoga smo pretpostavili da je gubitak najmanje polimorfnog i najviše eksprimiranog gena, gena 4, NDK, odgovoran za gubitak virulencije i s njim povezan defekt u produljivanju hifalnih flamenata. Kako bismo to testirali, transformirali smo svaki od pet gena kandidata natrag pojedinačno u 23-21 mutantnu soju Z. tritici, a svaki je pokretao vlastiti endogeni promotor. Višestruki transformanti dobiveni su od svakog i ponovno testirani na virulentnost na listovima pšenice i sposobnost produljenja filamentoznih hifa na vodenom agaru. Ovo je pokazalo da je ponovno uvođenje samog gena NDK (gen 4) u potpunosti obnovilo virulenciju i rast hifa na razine divljeg tipa (Slika 7E i Dodatna datoteka 2: Slika S6). Ponovno uvođenje svakog od ostala četiri kandidata nije uzrokovalo nikakvu promjenu u fenotipu u odnosu na izvorni mutant soja 23-21 (Slika 7E). Kako bi se osiguralo da su svi ponovno uvedeni geni eksprimirani u svom odgovarajućem komplementiranom soju, RT-PCR je učinjen na svakom od transformanata i izvornom 23-21 mutantu. Ovo je potvrdilo očekivani nedostatak svakog transkripta u 23-21 mutantu i pokazalo ispravnu ekspresiju svakog ciljnog gena u komplementiranim izolatima (Slika 7F). Dakle, ponovno uvođenje jednog gena s najmanje polimorfizama na populacijskoj razini od pet kandidata i najvećom relativnom ekspresijom, obnovilo je defektne fenotipove u ovom patogenu pšenice. Ovo eksperimentalno opažanje podržava korisnost kombiniranja pangenomike i transkriptomike za predviđanje gena koji su potencijalno važni za ključne funkcionalne životne osobine.
Slika 7 Testovi funkcionalne komplementacije na nepatogenom mutantu Z. tritici s brisanjem pet gena podržavaju kombiniranu upotrebu stope mutacije izvedene iz pangenoma i analize razine ekspresije kao prediktora za važne ključne gene za životni stil. Karakteristike rasta i infekcije mutanta Z. tritici nasumičnim umetanjem T-DNA "23-21". Soj normalno raste na agaru bogatom hranjivim tvarima, ali je defektan u filamentoznom rastu na agaru sa siromašnim hranjivim tvarima i ozbiljno je ugrožen u aktivnosti koja uzrokuje bolesti lišća pšenice. Mjerne trake predstavljaju 1 cm. B Resekvenciranje cijelog genoma soja 23-21 otkriva T-DNA posredovanu deleciju genomske regije od 13 kb koja prekida ili briše pet predviđenih gena iz jezgre pangenoma. C Prikazuje prosječne događaje visoke i umjerene mutacije za svaki gen (označen 1-5) iz pangenoma u odnosu na duljinu kodiranog proteina (aa)
Rasprava
Kombinirana pangenomika i transkriptomika mogu se koristiti kao oružje protiv patogena koji se brzo razvijaju
Pangenomics analyses have been performed on other fungi and yeasts including Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans var. grubii, and Aspergillus fumigatus [10]. All four species are model organisms in eukaryotic genomics and the latter three can also cause human diseases. Recent pangenome analyses on each of these species revealed that > 80% of all genes detected were core and thus found in every strain [10]. Our current study, and those previously [27, 28], clearly highlight that Z. tritici has a larger (>40% ukupnih gena) pomoćni genom od ovih vrsta. Nije jasno zašto i kako Z. tritici i potencijalno druge biljnopatogene gljive održavaju tako veliku pomoćnu komponentu. Na primjer, najmanjih osam kromosoma identificiranih u IPO323 nemaju jasan veliki utjecaj na virulentnost ili bilo koje druge procese, a samo jedna studija trenutno sugerira da kromosomi 14, 16, 18, 19 i 21 igraju suptilnu ulogu u virulenciji na odabrane sorte pšenice [59]. Ipak, kombinacije ovih malih kromosoma održavaju se u populacijama. Predloženo je da oni osiguravaju događaje rekombinacije koji mogu biti temelj sposobnosti gljivice da brzo evoluira kako bi se prilagodila okolišnim stresovima, potencijalno u kombinaciji s visokim stopama aktivnosti prijenosnih elemenata [60-62]. Sličan slučaj može se tvrditi za veliki pomoćni genom. Podršku za to pruža funkcionalna važnost dviju pomoćnih komponenti genoma spomenutih u ovoj studiji, SDH podjedinice C paralogue i AvrStb6, od kojih obje imaju ključne uloge u interakciji s varijabilnim elementima vanjskog okoliša (primjena fungicida i sorte s podudaranjem geni otpornosti na bolesti) [25, 45]. Opisani su i drugi biološki procesi koji se također mogu izgubiti u pojedinačnim izolatima Z. tritici bez jasnih nedostataka prikladnosti, uključujući kontrolu melanizacije (pigmentacije) [63]. Naša je studija istaknula da bi se pomoćni, brzo evoluirajući genom Z. tritici potencijalno mogao upotrijebiti protiv njega kada se fokus umjesto toga stavi na ono što se ne može izgubiti ili ima ograničeni polimorfizam. Ovo je istraživanje nastojalo to učiniti, uzimajući u obzir temeljne gene ne samo kao prisutne i funkcionalne u svim izolatima, već i izražene u svim izolatima. Također smo pristupili pokušaju rangiranja skupova gena u jezgri genoma, na temelju razina varijabilnosti sekvenci aminokiselina. Naravno, postoje neka upozorenja u vezi s metodama koje smo koristili, posebice u tome što se redundantne (identične vrste i položaja) mutacije ne mogu lako odvojiti od sličnog broja mutacija koje se mogu pojaviti na jedinstvenim pozicijama u svakom izolatu (ne-redundantne mutacije). Stoga naša metoda nije prikladna za rangiranje gena koji se brzo razvijaju. Unatoč tome, metoda omogućuje lako identificiranje gena bez varijabilnosti i niske varijabilnosti na temelju niskih stopa polimorfizama koji utječu na promjene aminokiselina. Pristup je pokazao da eksperimentalno verificirani i predviđeni geni bitni za život ili geni virulencije sadrže značajno manji polimorfizam ovog tipa između izolata od onih čije su funkcije nezamjenjive za te procese. Konačno, proširili smo ovaj pristup kako bismo identificirali novu funkciju virulencije nukleozid difosfat kinaze (NDK), koja je pokazala najmanju varijaciju od svih gena u 5-genskoj deleciji T-DNA. Na temelju ovih nalaza, predlažemo da se razine polimorfizma u osnovnim genima identificiranim u pangenomici mogu koristiti za zaključivanje važnih funkcija za kodirane proteine i time dati prioritet genima za funkcionalnu analizu kako bi se identificirali novi ciljevi za zaštitu usjeva i potencijalno zdravlje životinja.
Pojavljujuća slabost u biologiji infekcije Z. tritici i srodnih patogena?
Ova je studija također pružila dodatne specifične uvide u biologiju infekcije ovog važnog patogena pšenice. Prvo, nisu dobiveni nikakvi dokazi koji podupiru prisutnost glavnih nekrotrofnih efektorskih aktivnosti za 88 izlučenih proteina odabranih iz jezgrenog i pomoćnog genoma. Ne možemo odbaciti mogućnost da nismo odabrali ispravne proteine ili da višestruki efektori mogu raditi zajedno kako bi izazvali smrt biljne stanice (što također sugeriraju slični profili ekspresije). Ako je potonji slučaj, to bi se razlikovalo od jasne važnosti pojedinačnih nekrotrofnih efektora u srodnim gljivama koje zaraze pšenicu, posebno vrstama Parastagonospora nodorum i Pyrenophora [35]. Također je moguće da su razine ekspresije koje izvodimo iz prolaznog FoMV sustava niže od onih potrebnih za efektore čije je prepoznavanje manje izraženo od onog kod SnToxA. Unatoč tome, ovdje prikazani podaci ne podupiru ideju da je prijelaz na simptomatski rast i smrt biljnih stanica izazvan prepoznavanjem glavnih (pojedinačnih) nekrotrofnih efektora Z. tritici. Stoga je moguće da masovna proizvodnja ovih proteina na početku simptoma umjesto toga služi za zaštitu gljivičnih hifa od očite hiperaktivacije stanične smrti i odgovora biljke. Sukladno tome, pokazalo se da izlučeni efektori iz ove i drugih gljiva imaju sposobnost inhibicije proteaza, hitinaza i drugih enzima koji napadaju stanične stijenke i koje induciraju biljke tijekom obrambenih odgovora [46, 48, 64, 65]. ]. Nedavno se također pokazalo da gljivični efektori manipuliraju i preoblikuju mikro i mikrobiome [66, 67].
koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav
Identifikacija ključne uloge u virulenciji za NDK je međutim značajna. Ovim se proteinima pripisuje više funkcija različitih prokariotskih i eukariotskih organizama. Kod gljiva, postoji jedno izvješće koje pripisuje ulogu modulaciji biljnog imuniteta [68], dok je kod druge vrste (A. fumigatus) dokazana funkcija bitna za život [69]. Međutim, primarna i očuvana funkcija ovih proteina je fosforilacija nukleozid difosfata, obično koristeći ATP kao supstrat, za stvaranje drugih nukleozid trifosfata (NTP) potrebnih za poticanje raznih staničnih procesa [70, 71]. Ovo je osobito važno kada ograničeni resursi otežavaju stvaranje određenih NTP-ova drugim sredstvima. Dakle, NDK predstavljaju ključnu aktivnost puta spašavanja za regeneraciju NTP-a koja je najvjerojatnije važna kada su izvanstanični resursi ograničeni. Važne uloge za nekoliko drugih putova spašavanja, a posebno biosintetskih putova, nedavno su se pojavile iz drugih studija funkcije gena na Z. tritici. Na primjer, biosinteza lizina ključna je za infekciju i rast hifa na siromašnim hranjivim tvarima [72], kao i biosinteza purina [73]. Ove su funkcije suvišne za rast na cijelom mediju. Prethodni podaci transkriptoma o vrlo ranom stadiju kolonizacije površine lista ukazali su na to da se gljiva nalazi u okruženju osiromašenom hranjivim tvarima i da se oslanja na korištenje unutarstaničnih zaliha [33]. Uzevši zajedno s prethodnim funkcionalnim studijama i ključnom ulogom pokazanom za NDK, jasno je da je Z. tritici iznimno osjetljiva na inhibiciju ključnih biosintetskih putova i putova spašavanja kada je na površini lista tijekom rane kolonizacije, a potencijalno i do indukcije smrt biljnih stanica 7-10 dana kasnije. Stoga bi novi proizvodi ili strategije za zaštitu usjeva mogli biti usmjereni na inhibiciju ovih procesa, što može predstavljati slabost Z. tritici, a potencijalno i širokog spektra drugih srodnih gljiva sa sličnim načinima infekcije.
Zaključci
Ova studija pruža početnu potporu za kombiniranu upotrebu pangenomike i transkriptomike za definiranje gena koji predstavljaju temeljne i potencijalno iskoristive slabosti kod brzo evoluirajućih patogena. Međutim, u načelu, pristupi bi se mogli koristiti za određivanje prioriteta gena u bilo kojem biološkom sustavu gdje su dostupni višestruki genomi i transkriptomi. Predviđamo da bi ovi pristupi mogli unaprijediti otkrivanje temeljnih bioloških procesa u mnogim različitim biološkim sustavima.
Reference
1. Fisher MC, Hawkins NJ, Sanglard D, Gurr SJ. Pojava rezistencije na antifungalne lijekove diljem svijeta predstavlja izazov za ljudsko zdravlje i sigurnost hrane. Znanost. 2018;360. https://doi.org/10.1126/science.aap7999.
2. Fisher MC, Henk DA, Briggs CJ, Brownstein JS, Madoff LC, McCraw SL, et al. Nove gljivične prijetnje zdravlju životinja, biljaka i ekosustava. Priroda. 2012;484. https://doi.org/10.1038/nature10947.
3. Lucas JA, Hawkins NJ, Fraaije BA. Evolucija otpornosti na fungicide. Adv Appl Microbiol. 2015;90. https://doi.org/10.1016/bs.aambs.2014.09.001.
4. Heitman J. Spolno razmnožavanje i evolucija mikrobnih patogena. Curr Biol. 2006;16. https://doi.org/10.1016/j.cub.2006.07.064.
5. Dong S, Raffaele S, Kamoun S. Dvobrzinski genomi filamentoznih patogena: valcer s biljkama. Curr Opin Genet Dev. 2015;35:57–65. https://doi.org/10.1016/J.GDE.2015.09.001.
6. Tettelin H, Masignani V, Cieslewicz MJ, Donati C, Medini D, Ward NL, et al. Analiza genoma višestrukih patogenih izolata Streptococcus aga‑lactiae: implikacije za mikrobni "pan-genom". Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102. https://doi.org/10.1073/pnas.0506758102.
7. Lefébure T, Stanhope MJ. Evolucija jezgre i pan-genoma streptokoka do koka: pozitivna selekcija, rekombinacija i sastav genoma. Genome Biol. 2007;8. https://doi.org/10.1186/gb-2007-8-5-r71.
8. Tian CF, Zhou YJ, Zhang YM, Li QQ, Zhang YZ, Li DF, et al. Usporedna genomika rhizobia nodulating soje sugerira opsežno zapošljavanje gena specifičnih za lozu u prilagodbama. Proc Natl Acad Sci US A. 2012;109. https://doi.org/10.1073/pnas.1120436109.
9. Syme RA, Tan KC, Rybak K, Friesen TL, McDonald BA, Oliver RP, et al. Panparastagonospora komparativna analiza genoma-predviđanje efektora i evolucija genoma. Genome Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/gbe/evy192.
10. McCarthy CGP, Fitzpatrick DA. Pangenomske analize modelnih gljivičnih vrsta. Microb. Genomika. 2019;5. https://doi.org/10.1099/mgen.0.000243.
11. Yang X, Li Y, Zang J, Li Y, Bie P, Lu Y, et al. Analiza pan-genoma za identifikaciju osnovnih gena i bitnih gena Brucella spp. Mol Gen Genomics. 2016;291. https://doi.org/10.1007/s00438-015-1154-z.
12. Barber AE, Sae-Ong T, Kang K, Seelbinder B, Li J, Walther G, et al. Pangenomska analiza Aspergillus‑lus fumigatus identificira genetske varijante povezane s ljudskom infekcijom. Nat Microbiol. 2021;6. https://doi.org/10.1038/ s41564-021-00993-x.
13. Zhang X, Liu B, Zou F, Shen D, Yin Z, Wang R, et al. Resekvenciranje cijelog genoma otkriva prirodnu varijaciju i adaptivnu evoluciju Phytophthora sojae. Front Microbiol. 2019;10. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019. 02792.
14. Torriani SFF, Melichar JPE, Mills C, Pain N, Sierotzki H, Courbot M. Zymoseptoria tritici: glavna prijetnja proizvodnji pšenice, integrirani pristupi kontroli. Fungal Genet Biol. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.010.
15. Zhan J, Mundt CC, McDonald BA. Mjerenje imigracije i spolnog razmnožavanja u terenskim populacijama Mycosphaerella graminicola. Fitopatologija. 1998;88. https://doi.org/10.1094/PHYTO.1998.88.12.1330.
16. Zhan J, Kema GHJ, Waalwijk C, McDonald BA. Distribucija alela tipa parenja kod patogena pšenice Mycosphaerella graminicola na prostornim ljestvicama od lezija do kontinenata. Fungal Genet Biol. 2002;36. https://doi. org/10.1016/S1087-1845(02)00013-0.
17. Stukenbrock EH, Banke S, Javan-Nikkhah M, McDonald BA. Podrijetlo i pripitomljavanje gljivičnog patogena pšenice Mycosphaerella gramini‑cola putem simpatrične specijacije. Mol Biol Evol. 2007;24. https://doi.org/10. 1016/S1087-1845(02)00013-0.
18. Linde CC, Zhan J, McDonald BA. Struktura populacije Mycosphaere‑lla graminicola: od lezija do kontinenata. Fitopatologija. 2002;92. https://doi.org/10.1094/PHYTO.2002.92.9.946.
19. Croll D, McDonald BA. Genetska osnova lokalne prilagodbe patogenih gljiva u poljoprivrednim ekosustavima. Mol Ecol. 2017;26. https://doi.org/ 10.1111/mec.13870.
20. Croll D, Lendenmann MH, Stewart E, McDonald BA. Utjecaj žarišta rekombinacije na evoluciju genoma gljivičnog biljnog patogena. Genetika. 2015;201. https://doi.org/10.1534/genetics.115.180968.
21. Dutta A, Croll D, McDonald BA, Barrett LG. Održavanje varijacija u virulenciji i reprodukciji u populacijama patogena poljoprivrednih biljaka. Evol Appl. 2021;14. https://doi.org/10.1111/eva.13117.
22. Feurtey A, Stevens DM, Stephan W, Stukenbrock EH, Stajich J. Interspecifična izmjena gena uvodi visoku genetsku varijabilnost u patogene usjeva. Genome Biol Evol. 2019;11. https://doi.org/10.1093/gbe/evz224.
23. Hartmann FE, Sánchez-Vallet A, McDonald BA, Croll D. Gljivični patogen pšenice razvio je specijalizaciju domaćina opsežnim kromosomskim preraspodjelama. ISME J. 2017;11. https://doi.org/10.1038/ismej.2016.196.
24. Fouché S, Plissonneau C, McDonald BA, Croll D. Mejoza dovodi do sveobuhvatne varijacije broja kopija i iskrivljenog nasljeđivanja pomoćnih kromosoma patogena pšenice Zymoseptoria tritici. Genome Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/gbe/evy100.
25. Stephens C, Ölmez F, Blyth H, McDonald M, Bansal A, Burcu Turgay E, et al. Izvanredne nedavne promjene u genetskoj raznolikosti gena avirulencije AvrStb6 u globalnim populacijama patogena pšenice Zymoseptoria tritici. Mol Plant Pathol. 2021. https://doi.org/10.1111/mpp.13101.
26. Goodwin SB, M'Barek S, Dhillon B, Wittenberg AHJ, Crane CF, Hane JK, et al. Gotov genom gljivičnog patogena pšenice Mycosphaerella graminicola otkriva dispenziranu strukturu, plastičnost kromosoma i skrivenu patogenezu. PLoS Genet. 2011;7. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002070.
27. Badet T, Oggenfuss U, Abraham L, McDonald BA, Croll D. 19-izolat globalnog pangenoma referentne kvalitete za gljivični patogen pšenice Zymoseptoria tritici. BMC Biol. 2020;18. https://doi.org/10.1186/ s12915-020-0744-3.
28. Plissonneau C, Hartmann FE, Croll D. Analize pangenoma patogena pšenice Zymoseptoria tritici otkrivaju strukturnu osnovu vrlo plastičnog eukariotskog genoma. BMC Biol. 2018;16. https://doi.org/10.1186/ s12915-017-0457-4.
29. Wittenberg AHJ, van der Lee TAJ, M'Barek SB, Ware SB, Goodwin SB, Kilian A, et al. Mejoza pokreće izvanrednu plastičnost genoma u haploidnom gljivičnom biljnom patogenu Mycosphaerella graminicola. PLoS jedan. 2009;4. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005863.
30. Steinberg G. Stanična biologija Zymoseptoria tritici: organizacija stanica patogena i infekcija pšenice. Fungal Genet Biol. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.002.
31. Kema GHJ, Yu DZ, Rijkenberg FHJ, Shaw MW, Baayen RP. Histologija patogeneze Mycosphaerella graminicola u pšenici. Fitopatologija. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-777.
32. Rudd JJ, Kanyuka K, Hassani-Pak K, Derbyshire M, Andongabo A, Devon-Shire J, et al. Profiliranje transkriptoma i metabolita ciklusa infekcije Zymoseptoria tritici na pšenici otkriva dvofaznu interakciju s biljnim imunitetom koja uključuje različite kromosomske doprinose patogena i varijacije u definiciji hemibiotrofnog načina života. Plant Physiol. 2015;167. https://doi.org/10.1104/pp.114.255927.
33. Keon J, Antoniw J, Carzaniga R, Deller S, Ward JL, Baker JM, et al. Transkripcijska prilagodba Mycosphaerella graminicola na programiranu staničnu smrt (PCD) njezinog osjetljivog domaćina pšenice. Mol interakcija biljaka i mikroba. 2007;20. https://doi.org/10.1094/MPMI-20-2-0178.
34. Rudd JJ, Keon J, Hammond-Kosack KE. Protein kinaze TaMPK3 i TaMPK6 aktivirane mitogenom pšenice različito su regulirane na više razina tijekom kompatibilnih interakcija bolesti s Mycosphaerella graminicola. Plant Physiol. 2008;147. https://doi.org/10.1104/pp.108. 119511.
35. Friesen TL, Faris JD. Karakterizacija interakcija efektor-cilj u nekrotrofnim patosustavima otkriva trendove i varijacije u manipulaciji domaćina. Annu Rev Phytopathol. 2021;59. https://doi.org/10.1146/annur ev-phyto-120320-012807.
36. Friesen TL, Faris JD, Solomon PS, Oliver RP. Toksini specifični za domaćina: efektori nekrotrofne patogenosti. Cell Microbiol. 2008;10. https://doi.org/10. 1111/j.1462-5822.2008.01153.x.
37. Ben M'Barek S, Cordewener JHG, Tabib Ghafary SM, van der Lee TAJ, Liu Z, Mirzadi Gohari A, et al. FPLC i masena spektrometrija tekućinske kromatografije identificiraju proteine kandidate koji izazivaju nekrozu iz filtrata kulture gljivičnog patogena pšenice Zymoseptoria tritici. Fungal Genet Biol. 2015;79. https://doi.org/10.1016/j.fgb.2015.03.015.
38. Wyka S, Mondo S, Liu M, Nalam V, Broders K. Veliki dodatni genom i visoke stope rekombinacije mogu utjecati na globalnu distribuciju i širok raspon domaćina gljivičnog biljnog patogena Claviceps purpurea. PLoS jedan. 2022;17. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.
39. Moolhuijzen PM, vidi PT, Shi G, Powell HR, Cockram J, Jørgensen LN, et al. Globalni pangenom za gljivični patogen pšenice Pyrenophora triticirepentis i predviđanje strukturne homologije efektorskog proteina. Microb. Genomika. 2022;8. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.
40. Kema GHJ, Sayoud R, Annone JG, Van Silfhout CH. Genetske varijacije za virulentnost i otpornost u sustavu puta pšenice-Mycosphaerella graminicola II. Analiza interakcija između izolata patogena i kultivara domaćina. Fitopatologija. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-213.
41. Kema GHJ, Annone JG, Sayoud R, Van Silfhout CH, Van Ginkel M, De Bree J. Genetska varijacija virulencije i otpornosti u patosustavu pšenice Mycosphaerella graminicola I. interakcije između izolata patogena i kultivara domaćina. Fitopatologija. 1996;86. https://doi.org/ 10.1094/Phyto-86-200.
42. Zhan J, Pettway RE, McDonald BA. Globalnu genetičku strukturu patogena pšenice Mycosphaerella graminicola karakterizira visoka nuklearna raznolikost, niska mitohondrijska raznolikost, redovita rekombinacija i protok gena. Fungal Genet Biol. 2003;38. https://doi.org/10.1016/S1087- 1845(02)00538-8.
43. Palma-Guerrero J, Torriani SFF, Zala M, Carter D, Courbot M, Rudd JJ, et al. Komparativne transkriptomske analize sojeva Zymoseptoria tritici pokazuju složene prijelaze životnog stila i intraspecifičnu varijabilnost u transkripcijskim profilima. Mol. Plant Pathol. 2016;17. https://doi.org/10.1111/mpp.12333.
44. Kellner R, Bhattacharyya A, Poppe S, Hsu TY, Brem RB, Stukenbrock EH. Profiliranje ekspresije patogena pšenice Zymoseptoria tritici otkriva genomske obrasce transkripcije i regulatorne programe specifične za domaćina. Genome Biol Evol. 2014;6. https://doi.org/10.1093/gbe/evu101.
45. Steinhauer D, Salat M, Frey R, Mosbach A, Luksch T, Balmer D, et al. Nepotrebni paralog podjedinice C sukcinat dehidrogenaze posreduje u postojanoj otpornosti prema podklasi SDHI fungicida u Zymoseptoria tritici. PLoS Patog. 2019;15. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 1007780.
46. Marshall R, Kombrink A, Motteram J, Loza-Reyes E, Lucas J, Hammond Kosack KE, et al. Analiza dva homologa LysM efektora eksprimiranih u plantažama iz gljive Mycosphaerella graminicola otkriva nova funkcionalna svojstva i različite doprinose virulenciji u pšenici. Plant Physiol. 2011;156. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.
47. Lee WS, Rudd JJ, Hammond-Kosack KE, Kanyuka K. Mycosphaerella graminicola lista efector-posredovana stealth patogeneza potkopava prepoznavanje kroz homologe cerk1 i cebip u pšenici. Mol interakcija biljaka i mikroba. 2014;27. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.
48. Tian H, MacKenzie CI, Rodriguez-Moreno L, van den Berg GCM, Chen H, Rudd JJ, et al. Tri LysM efektora Zymoseptoria tritici kolektivno razoružavaju biljni imunitet izazvan hitinom. Mol Plant Pathol. 2021;22. https:// doi.org/10.1104/pp.111.176347.
49. Zhong Z, Marcel TC, Hartmann FE, Ma X, Plissonneau C, Zala M, et al. Mali izlučeni protein u Zymoseptoria tritici odgovoran je za avirulentnost na kultivarima pšenice koji nose gen otpornosti Stb6. Novi Phytol. 2017;214. https://doi.org/10.1111/nph.14434.
50. Kema GHJ, Mirzadi Gohari A, Aouini L, Gibriel HAY, Ware SB, Van Den Bosch F, et al. Stres i spolna reprodukcija utječu na dinamiku efektora patogena topline AvrStb6 i otpornost na strobilurin. Nat Genet. 2018;50. https://doi.org/10.1111/nph.14434.
51. Saintenac C, Lee WS, Cambon F, Rudd JJ, King RC, Marande W, et al. Protein Stb6 sličan pšeničnom receptoru kinaze kontrolira otpornost gena za gen na gljivični patogen Zymoseptoria tritici. Nat Genet. 2018;50. https://doi.org/ 10.1038/s41588-018-0051-x.
52. Tan KC, Oliver RP, Solomon PS, Mofat CS. Proteinski nekrotrofni efektori u virulenciji gljivica. Funct Plant Biol. 2010;37. https://doi.org/10. 1071/FP10067.
53. Bouton C, King RC, Chen H, Azhakanandam K, Bieri S, Hammond-Kosack KE, et al. Virus mozaika lisičjeg repa: virusni vektor za ekspresiju proteina u žitaricama. Plant Physiol. 2018;177. https://doi.org/10.1104/pp.17.01679.
54. Motteram J, Küfner I, Deller S, Brunner F, Hammond-Kosack KE, Nürnberger T, et al. Molekularna karakterizacija i funkcionalna analiza MgNLP, jedinog proteina koji sadrži NPP1 domenu, iz gljivičnog patogena lista pšenice mycosphaerella graminicola. Mol interakcija biljaka i mikroba. 2009;22. https://doi.org/10.1094/MPMI-22-7-0790.
55. Faris JD, Zhang Z, Lu H, Lu S, Reddy L, Cloutier S, et al. Jedinstveni gen sličan otpornosti na bolesti pšenice upravlja osjetljivošću izazvanom efektorom na nekrotrofne patogene. Proc Natl Acad Sci US A. 2010;107. https://doi. org/10.1094/MPMI-22-7-0790.
56. Lu Y, Deng J, Rhodes JC, Lu H, Lu LJ. Predviđanje bitnih gena za identificiranje potencijalnih meta lijekova u Aspergillus fumigatus. Comput Biol Chem. 2014;50. https://doi.org/10.1016/j.compbiolchem.2014.01.011.
57. Osmani AH, Oakley BR, Osmani SA. Identifikacija i analiza esencijalnih gena Aspergillus nidulans korištenjem tehnike spašavanja heterokariona. Nat Protoc. 2006;1. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.406.
58. Hu W, Sillaots S, Lemieux S, Davison J, Kaufman S, Breton A, et al. Bitna identifikacija gena i određivanje prioriteta lijeka u Aspergillus fumigatus. PLoS Patog. 2007;3. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 0030024.
59. Habig M, Quade J, Stukenbrock EH. Pristup napredne genetike otkriva važnost pomoćnih kromosoma ovisnu o genotipu domaćina u gljivičnom patogenu pšenice Zymoseptoria tritici. MBio. 2017;8. https://doi. org/10.1128/mBio.01919-17.
60. Fouché S, Badet T, Oggenfuss U, Plissonneau C, Francisco CS, Croll D. Stress-driven transposable element de-repression dynamics and virulence evolution in a fungal pathogen. Mol Biol Evol. 2020;37. https://doi. org/10.1093/molbev/msz216.
61. Möller M, Habig M, Freitag M, Stukenbrock EH. Iznimna nestabilnost genoma i raširene kromosomske promjene tijekom vegetativnog rasta. Genetika. 2018;210. https://doi.org/10.1534/genetics.118.301050.
62. Bertazzoni S, Williams AH, Jones DA, Syme RA, Tan KC, Hane JK. Dodaci čine komplet: pomoćni kromosomi i druge nezamjenjive regije DNK u biljno-patogenim gljivama. Mol interakcija biljaka i mikroba. 2018;31. https://doi.org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.
63. Krishnan P, Meile L, Plissonneau C, Ma X, Hartmann FE, Croll D, et al. Transpozibilni umetci elemenata oblikuju regulaciju gena i proizvodnju melanina u gljivičnom patogenu pšenice. BMC Biol. 2018;16. https://doi. org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.
64. Sánchez-Vallet A, Tian H, Rodriguez-Moreno L, Valkenburg DJ, Saleem Batcha R, Wawra S, et al. Izlučeni LysM efektor štiti gljivične hife polimerizacijom homodimera ovisnom o hitinu. PLoS Patog. 2020;16. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008652.
65. Breen S, Williams SJ, Winterberg B, Kobe B, Solomon PS. Pšenični PR-1 proteini ciljani su na efektorske proteine nekrotrofnih patogena. Plant J. 2016;88. https://doi.org/10.1111/tpj.13228.
66. Snelders NC, Petti GC, van den Berg GCM, Seidl MF, Thomma BPHJ. Drevni antimikrobni protein kojeg je kooptirao gljivični biljni patogen za manipulaciju planta mikobioma. Proc Natl Acad Sci US A. 2021;118. https://doi.org/10.1073/pnas.2110968118.
67. Snelders NC, Rovenich H, Petti GC, Rocafort M, van den Berg GCM, Vorholt JA, et al. Manipulacija mikrobioma gljivičnim biljnim patogenom koji se prenosi iz tla pomoću efektorskih proteina. Nat Biljke. 2020. https://doi.org/10. 1038/s41477-020-00799-5.
68. Rocha RO, Wilson RA. Magnaporthe oryzae nukleozid difosfat kinaza potrebna je za metaboličku homeostazu i redoks-posredovanu supresiju urođenog imuniteta domaćina. Mol Microbiol. 2020;114. https://doi.org/ 10.1111/mmi.14580