ACKR4a inducira autofagiju da blokira NF-kB signalizaciju i apoptozu da olakša infekciju Vibrio Harveyi

SAŽETAK

Autofagija i apoptoza dva su priznata mehanizma otpornosti na bakterijsku invaziju. Međutim, bakterije su također razvile sposobnost izbjegavanja imuniteta. U ovoj studiji identificirali smo ACKR4a, člana obitelji atipičnih kemokinskih receptora, kao supresor puta NF-kB, koji surađuje s Beclinom-1 kako bi inducirao autofagiju za inhibiciju signalizacije NF-kB i blokirao apoptozu, olakšavajući Vibrio harveyi infekcija. Mehanički gledano, Ap-1 izazvan V. harveyi aktivira transkripciju i ekspresiju ACKR4a. ACKR4a tvori kompleks s Beclin-1, odnosno MyD88, inducirajući autofagiju i transportirajući MyD88 u lizosom na razgradnju radi suzbijanja upalne proizvodnje citokina. U međuvremenu, ACKR4a-inducirana autofagija blokira apoptozu inhibicijom kaspaze8. Ova studija po prvi put dokazuje da V. harveyi koristi i autofagiju i apoptozu kako bi izbjegla urođeni imunitet, sugerirajući da je V. harveyi razvio sposobnost protiv imuniteta riba. 

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

UVOD

Imunološki sustav općenito se dijeli na urođeni i stečeni imunitet, pri čemu se većina organizama prvenstveno oslanja na urođeni imunitet za preživljavanje.1 Urođeni imunitet je obrambeni mehanizam formiran u organizmima. Prepoznaje molekularni uzorak povezan s patogenom (PAMP) putem receptora za prepoznavanje uzorka (PRR), daje brz odgovor na patogenu infekciju i štiti domaćina od infekcije.2,3 Kao važan PRR, toll-like receptori (TLR) mogu pokrenuti širok raspon odgovora od fagocitoze do proizvodnje citokina, čime dodatno pojačavaju upalne i urođene imunološke odgovore.4 U većini slučajeva, TLR primarno signaliziraju kroz MyD88-ovisan put, koji prenosi signale kroz kaskadne reakcije za aktiviranje nuklearne faktor kapa B (NF-kB).5 NF-kB jedan je od ključnih čimbenika u pokretanju urođene imunosti i bitan je za koordinaciju upalnog odgovora, urođene imunosti, diferencijacije stanica, proliferacije i preživljavanja, te je smatra se glavnim inicijatorom upalnog odgovora.6 Kada bakterije inficiraju domaćina, sintetiziraju se nizvodni efektori urođenog imunološkog odgovora, kao što su citokini i kemokini, i u konačnici dovode do upalnog odgovora koji blokira rast bakterija. Međutim, u koevoluciji sa svojim domaćinima, bakterije su također razvile različite regulatorne strategije kako bi izbjegle i potkopale obranu svog domaćina.

Smatra se da su autofagija i apoptoza dva važna puta protiv bakterijske invazije.7 Autofagija je konzervativni proces koji prenosi abnormalne proteine ​​u lizosome na razgradnju i igra važnu ulogu u urođenom imunitetu eukariota protiv bakterijske invazije.8,9 Međutim, neki bakterije izbjegavaju imunitet korištenjem autofagije kod sisavaca. Normalno, stanice imaju za cilj ukloniti invaziju izvanstaničnih bakterija i kolonizirajuće bakterije u citoplazmi kroz autofagiju,10 ali neke bakterije mogu 'preoteti' autofagiju kako bi dovršile vlastiti rast i reprodukciju.11-13 Na primjer, Unc-51-kao kinaza 1 (ULK1), Beclin1, laki lanac 3 proteina povezan s mikrotubulama (LC3) i proteini povezani s autofagijom (ATG) surađuju kako bi formirali autofagosome, koji inkapsuliraju invazivne mikroorganizme i transportiraju ih u lizosome na razgradnju.14–16 Međutim, Mycobacterium tuberculosis dolje -regulira Beclin-1 kako bi spriječio stvaranje autofagosoma, u konačnici inhibirajući autofagiju i potičući infekciju.17 Za razliku od inhibicije stvaranja autofagosoma, neke bakterije koriste autofagosome za dovršavanje samoreplicirajućih mjesta za promicanje proliferacije.11,18 Osim autofagije, apoptoza je također sredstvo obrane domaćina od invazije patogena.7 Apoptoza je obrazac stanične smrti koji se koristi za uklanjanje oštećenih stanica radi održavanja stabilnosti sistemskog okoliša.19 Nakon što primi signal o bakterijskoj invaziji, domaćin inducira apoptozu zaraženih stanice za inhibiciju bakterijske infekcije.20 Stoga uspješna bakterijska kolonizacija ovisi o njegovoj sposobnosti da spriječi apoptozu i zaštiti bakterijsku replikaciju. Na primjer, Edwardsiella tarda osigurava svoje preživljavanje inhibicijom apoptoze nakon infekcije ZF4 stanica zebrice,21 Shigella postiže uspješnu kolonizaciju inhibicijom apoptoze,22 a S protein koji proizvodi streptokok skupine A (GAS) veže se za membranu eritrocita kako bi izbjegao otkrivanje imunološkog sustava domaćina. sustav.23 Iako je dokazano da su mnoge bakterije razvile sposobnost izbjegavanja imuniteta, postoji nekoliko izvješća o morskim patogenima. Vibrio harveyi pripada obitelji Vibrionaceae, koja je prepoznata kao visoko patogeni uzročnik morskih riba; uzrokuje gastroenteritis, nekrozu mišića i kožne čireve te je jedan od glavnih uzroka smrtnosti morske ribe.24

biljka cistanche koja jača imunološki sustav

Osim za autofagiju i apoptozu, neke bakterije (npr. Staphylococcus aureus) čak mogu koristiti kemokinske receptore svog domaćina da izbjegnu imunitet.25 Kemokinski receptori su G protein-spregnuti receptori (GPCR) koji se nalaze uglavnom na površini leukocita. Sadrže sedam transmembranskih struktura koje su uključene u vezanje i signalizaciju liganda i igraju ključnu ulogu u pokretanju i održavanju imunoloških i upalnih odgovora.26 Kako su istraživanja kemokina napredovala, otkriveni su atipični kemokinski receptori (ACKR).27 Iako su ACKR-ovi strukturno slični drugim kemokinskim receptorima i mogu internalizirati ligande, oni ne mogu aktivirati put prijenosa signala zbog nedostatka domene DRYLAIV, koja se također naziva "tihi receptor".28 Funkcija ACKR-a može se odražavati na sljedeće načine: : 1. Oni se mogu natjecati s tipičnim receptorima za vezanje kemokina, i time regulirati prijenos signala stanične kemotaksije; 2. Internalizacijom kemokina u stanice, koncentracija kemokina u okolini se smanjuje kako bi utjecala na regrutiranje stanica i djelovala kao čistač kemokina. 3. Pomažu kemokinima da dovrše međustanični transport kroz barijeru stromalnih stanica.29 Obitelj ACKR-ova koja uglavnom uključuje DARC,30 D6 31,32, CXCR7,33 i CCRL1,34 CCRL1 također je poznat kao atipični kemokinski receptor 4 (ACKR4). Trenutačno su neke studije pokazale da se čini da ACKR4 ostvaruje transdukciju signala kroz put neovisan o G proteinu,35-37 i ima nesuvišne uloge u kontroli upale i imunološkog odgovora.38 Njegova uloga u adaptivnom imunitetu dobro je poznata, ali funkcija urođenog imuniteta rijetko se proučava.

Kod urođenog imuniteta, prijenos signala TLR puta je visoko očuvan od beskralježnjaka do sisavaca. Kao temeljni protein TLR signalizacije, MyD88 je naširoko proučavan na kralježnjacima. Osim toga, zbog visoko očuvane strukture MyD88, njegovi homolozi u ribama mogu imati slične funkcije kao i oni u sisavaca.39,40 Kod zebrica, MyD88 je uključen u uklanjanje bakterijskih infekcija.41 Prethodne studije također su potvrdile da V. harveyi izbjegava imunitet uništavajući transdukciju signala MyD88.42 Međutim, mehanizmi kako V. harveyi izbjegava imunitet i dalje su nedovoljno poznati kod teleosta. U ovoj studiji, ACKR4a je brzo pojačan u Miichthys muy stimuliranom V. harveyi. Naviše regulirani ACKR4a potisnuo je urođeni imunitet induciranjem autofagije za blokiranje MyD88-posredovanog NF-kB puta i induciranjem autofagije za blokiranje apoptoze, kako bi se pojačala infekcija V. harveyi. Koliko nam je poznato, ovo je izvješće prvo koje razjašnjava da je otkriveno da V. harveyi koristi i autofagiju i apoptozu kako bi izbjegla urođeni imunitet.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

REZULTATI

Infekcija V. harveyi inducira ekspresiju ACKR4a za promicanje samoproliferacije

Kako bismo identificirali gene koji su potencijalno uključeni u regulaciju infekcije V. harveyi, miiuy croaker smo tretirali s V. harveyi tijekom 48 sati, a zatim smo upotrijebili RNA-seq analizu kako bismo pregledali različite ekspresijske gene (DEG) između V. harveyi tretirane i netretirane uzorci slezene. Iz podataka o dubinskom sekvenciranju identificirali smo 145 gena s regulacijom na gore i 280 gena s nižom regulacijom (Slika 1A). Na temelju toga odabrali smo 10 najvećih i 10 najmanjih DEG (log2 promjene nabora bio je 1,0) za grupiranje toplinske karte, a rezultat je pokazao da su odgovarajući uzorci u uzorcima tretiranim i netretiranim V. harveyi bili dobro replicirani (Slika 1B) . ACKR4a mRNA je ispitana i utvrđeno je da je visoko izražena u M music mozgu nakon infekcije V. harveyi (Slika S1A). Tako je linija moždanih stanica M. muiiy (MBrC) korištena za naknadne eksperimente. Učinkovitost obaranja ACKR4a-si1 je 46,1%, a ACKR4a-si2 je 63,7% u MBrC (Slika S1B), pa je ACKR4a-si2 (nazvan ACKR4a-si) korišten za sljedeće eksperimente. Naknadno smo se usredotočili na gen ACKR4a, koji bi mogao imati imunološku funkciju, a rezultati analize jedinica koje stvaraju kolonije (CFU) otkrili su da ACKR4a potiče proliferaciju V. harveyi (slike 1C, 1D i S1C). Kako bi se dalje istražio mehanizam kojim ACKR4a potiče proliferaciju V. harveyi, analiziran je obrazac ekspresije ACKR4a. ACKR4a u MBrC stanicama regulirao je V. harveyi. Rezultati su pokazali vremenski ovisan način infekcije V. harveyi na razini mRNA i proteina (slike 1E i 1F). Osim toga, utišavanje ACKR4a učinkovito je potisnulo ekspresiju ACKR4a na razini mRNA i proteina (slike 1E i 1G). Gore navedeni rezultati pokazuju da pojačana regulacija ACKR4a može olakšati infekciju V. harveyi.

Slika 1. V. harveyi induciran ACKR4a olakšava njegovu samoproliferaciju

ACKR4a inhibira NF-kB signalizaciju koju pokreće V. harveyi 

Otkrili smo da je stopa proliferacije stanica bila pod utjecajem kada je MBrC zaražen V. harveyi, a kako bismo potvrdili ovo otkriće, proveli smo testove stanične proliferacije. Rezultati su pokazali da je infekcija V. harveyi smanjila proliferaciju MBrC (Slika S1D). Naknadni eksperimenti su potvrdili da je prekomjerna ekspresija ACKR4a smanjila staničnu proliferaciju, dok je utišavanje ACKR4a pojačalo staničnu proliferaciju (Slika 2A i S1E). Nekoliko je studija pokazalo da aktivacija NF-kB potiče proliferaciju stanica. Utvrđeno je da BAY 11–7082, inhibitor NF-kB, također može smanjiti proliferaciju MBrC (Slika 2A i S1E). Slično prethodnim izvješćima,43 porast NF-kB-luc bio je povezan s infekcijom V. harveyi na vremenski ovisan način (Slika S1F).

Slika 2. ACKR4a inhibira NF-kB signalizaciju koju pokreće V. harveyi

Kako bi se dalje odredio učinak ACKR4a na NF-kB signalizaciju koju pokreće V. harveyi, proveden je test reportera luciferaze. ACKR4a je značajno inhibirao aktivnost luciferaze NF-kB koju izaziva V. harveyi i LPS; Aktivnost luciferaze IL-1b i TNFa koju pokreće V. harveyi također je inhibirala ACKR4a (slike 2B–2D). Endogeni ACKR4a je ušutkan kako bi se potvrdila njegova uloga u urođenom imunitetu. Zatim su obrasci ekspresije p65 i proupalnih citokina (IL-1b i TNFa) dodatno detektirani, ACKR4a utišavanje drastično je povećalo p65 mRNA, IL-1b mRNA i TNFa mRNA (slike 2E-2G ). Rezultati u MLC i MKC također su pokazali da ACKR4a može inhibirati NF-kB signalizaciju (slike S1G-S1J). Rezultati ELISA također su bili slični; Utišavanje ACKR4a značajno je povećalo TNFa, a prekomjerna ekspresija ACKR4a inhibirala je TNFa (Slika 2H). Za procjenu aktivacije NF-kB potrebno je analizirati transliterirani oblik, odnosno fosforilirani NF-kB, a on je mjera aktivnosti NF-kB na ciljnim genima. Nakon stimulacije NF-kB, p65 se fosforilira i ulazi u jezgru kako bi regulirao transkripciju proupalnih citokina. Kako bismo istražili regulaciju fosforilacije p65 pomoću ACKR4a, izmjerili smo razinu fosforilacije p65 nakon utišavanja ACKR4a i prekomjerne ekspresije ACKR4a pomoću imunoblota. Infekcija V. harveyi pojačala je fosforilaciju p65, što je dokazalo da V. harveyi učinkovito aktivira NF-kB. Na temelju toga, utišavanje ACKR4a pojačalo je fosforilaciju p65, dok je prekomjerna ekspresija ACKR4a smanjila fosforilaciju p65, što ukazuje da je ACKR4a inhibitor NF-kB signalizacije (slike 2I i 2J). Kod zebrica, obaranje ACKR4a povećalo je fosforilaciju p65. Osim toga, CFU test je pokazao da BAY 11-7082 značajno povećava proliferaciju MBrC (Slika 2K). Sve u svemu, ovi podaci sugeriraju da ACKR4a djeluje kao negativni regulator NF-kB signalizacije za inhibiciju urođenog imuniteta tijekom infekcije V. harveyi.

Slika 3. ACKR4a komunicira s MyD88 i promotorima degradacije MyD88 u autofagiji

ACKR4a stupa u interakciju s MyD88 i potiče MyD88 za autofagnu razgradnju

Zatim smo pokušali odrediti koji cilj u NF-kB signalizaciji posreduje u supresivnoj funkciji ACKR4a0. Test reportera NF-kB-luciferaze otkrio je da je prekomjerna ekspresija ACKR4a uzrokovala smanjenje aktivnosti luciferaze, koju je inducirao MyD88 na način ovisan o dozi (Slika 3A). Međutim, prekomjerna ekspresija ACKR4a nije pokazala učinak na aktivnost luciferaze koju pokreću TRAF6 ili TAK1 (slike 3B i 3C). Rezultat imunoblota bio je sličan testu luciferaze reportera; prekomjerna ekspresija ACKR4a inhibirala je MyD88 na način ovisan o dozi, ali nije bilo učinka na TRAF6 i TAK1 (Slika 3D). Ovi rezultati sugeriraju da ACKR4a funkcionira na razini MyD88.

Svi TLR-ovi sisavaca, osim TLR3, barem djelomično ovise o adapteru MyD88 za prijenos signala, što izravnu regulaciju MyD88 čini učinkovitijom.44 Zatim smo ispitali ekspresiju MyD88 u različitim vremenima infekcije V. harveyi i otkrili da ACKR4a utišava pojačao ekspresiju MyD88 (Slika 3E), a prekomjerna ekspresija ACKR4a inhibirala je ekspresiju MyD88 na način ovisan o vremenu (Slika 3F). Nađen je zanimljiv rezultat da iako je utišavanje ACKR4a pojačalo ekspresiju MyD88 koju je pokrenuo V. harveyi, to pojačanje nije bilo prisutno kada su stanice mirovale (slike 3G i 3H). Kako bismo bolje razumjeli molekularni mehanizam koji je u osnovi djelovanja ACKR4a u MyD88-posredovanoj NF-kB signalizaciji, proveli smo testove ko-imunoprecipitacije (Co-IP) kako bismo utvrdili stupa li ACKR4a u interakciju s MyD88. Flag-ACKR4a mogao bi imunoprecipitirati s Myc-MyD88 (slike 3I i S1K). U skladu s tim, otkrili smo da Flag-MyD88 može komunicirati s endogenim ACKR4a (Slika 3J). Naknadni eksperimenti subcelularne lokalizacije pokazali su da ACKR4a nije imao značajnu ko-lokalizaciju s MyD88 (Slika S1L). Dakle, ovi nalazi podupiru koncept da ACKR4a fizički stupa u interakciju s MyD88, a njihova se interakcija vjerojatno događa u citoplazmi. Zatim smo istražili mehanizam kojim je ACKR4a potisnuo ekspresiju MyD88. NH4Cl ili 3-metiladenin (3-MA), inhibitori puta razgradnje ovisnog o autofagiji i lizosomu, rezultirali su značajnom akumulacijom MyD88 u prisutnosti ACKR4a, a MG132 nije utjecao na razgradnju MyD88 (slika 3K). Štoviše, slični rezultati pokazali su da 3-MA i NH4Cl značajno blokiraju razgradnju MyD88 na način ovisan o dozi (slike 3L i 3M). Ovi nalazi sugeriraju da blokiranje autofagije učinkovito sprječava degradaciju MyD88 usmjerenu na ACKR4a. Autofagijski tok označava dinamički proces autofagije, što je pouzdan pokazatelj autofagijske aktivnosti. Budući da se fluorescencija GFP-a gasi u lizosomu, stupanj autofagije može se odrediti iz fluorescencije GFP-a i RFP-a.42 Promatranje žute fluorescencije na ploči spajanja pokazalo je više crvene fluorescencije u prisutnosti ACKR4a, što ukazuje da ACKR4a potiče fuziju autofagosomi i lizosomi; dok je inhibitor autofagije klorokin (CQ) spriječio fuziju autofagosoma i lizosoma, pokazujući više žute fluorescencije (Slika 3N). Kako bi se dodatno potvrdilo da ACKR4a cilja MyD88 za autofagnu razgradnju, proveden je test lokalizacije lizosoma, MyD88 (zeleno) i lizosomi (crveno) su lokalizirani u MBrC stanici (Slika 3O), što sugerira da je MyD88 transportiran u lizosome. Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da ACKR4a stupa u interakciju s MyD88 i cilja MyD88 za autofagnu razgradnju.

Slika 4. ACKR4a sudjeluje u regulaciji autofagije preko Beclina-1

ACKR4a sudjeluje u regulaciji autofagije putem Beclina-1

Neke bakterije koriste autofagiju za poticanje svog rasta i infekcije, njihova će se replikacija smanjiti ako autofagije nema.13 Kako bi se testiralo sudjeluje li V. harveyi u regulaciji autofagije u stanicama MBrC, stanice su zaražene s V. harveyi, a zatim je obrazac ekspresije ispitan je LC3. U stanicama MBrC, izloženost V. harveyi povećala je autofagiju kao što je naznačeno nakupljanjem GFP-LC3 puncta, što je bilo popraćeno vremenski ovisnim povećanjem infekcije V. harveyi (Slika 4A). Prekomjerna ekspresija ACKR4a pojačala je autofagiju izazvanu V. harveyi kao što je prikazano značajnim povećanjem puncta nakupljanja RFP-LC3, za razliku od utišavanja ACKR4a koje je značajno smanjilo autofagiju izazvanu V. harveyi (slike 4B i 4C). Osim toga, utišavanje ACKR4a rezultiralo je smanjenjem ekspresije LC3-II izazvane V. harveyi (Slika 4D).

ULK1, Beclin-1 i ATG5 bili su ključni regulatorni proteini autofagije. Rezultati qPCR-a pokazali su da ACKR4a značajno pojačava ekspresiju Beclin-1, ali ne i ULK1 i ATG5 (Slika 4E). Analiza luciferaze reportera ULK1, ATG5 i Beclin-1 otkrila je da prekomjerna ekspresija ACKR4a uzrokuje samo povećanje aktivnosti Beclin-1luciferaze (Slika 4F). Zatim smo otkrili da prekomjerna ekspresija ACKR4a pojačava ekspresiju Beclin-1, ali ne i ULK1 i ATG5 (Slika 4G). Također, autofagiju izazvanu ACKR4a inhibirao je Beclin-1-si, dok je ATG5-si imao samo djelomičnu inhibiciju (Slika 4H). Gore navedeni rezultati pokazuju da je ACKR4a bio usmjeren na Beclin-1. Stoga su istraživani funkcija i mehanizam Beclin-1 u autofagnoj razgradnji MyD88 posredovanoj ACKR4a. Kod zebrica zaraženih s V. harveyi, nokdaun ACKR4a nije rezultirao značajnim promjenama u ULK1 dok je značajno smanjio Beclin-1 i ATG5 (slike S2B-S2D). Beclin-1 je dodatno pojačao ACKR4a-inducirani autofagijski tok tretiranim Baf1A i CQ (Slika 4I), a Beclin-1 je pojačao razgradnju MyD88 pomoću ACKR4a (Slika 4J). Zatim smo proveli Co-IP testove kako bismo utvrdili stupa li ACKR4a u interakciju s Beclinom-1 i otkrili da ACKR4a stupa u interakciju s Beclinom-1, a infekcija V. harveyi pojačala je interakciju između ACKR4a i Beclina{{51 }} (Slika 4K). Test lizosomske lokalizacije pokazao je da ACKR4a pojačava spajanje autofagosoma s lizosomom (Slika 4L). Nakon toga, ACKR4a povećava endogenu ekspresiju Beclin-1 (Slika 4M), a utišavanje ACKR4a prigušuje ekspresiju Beclin-1 izazvanu V. harveyi (Slika 4N). Osim toga, utišavanje Beclin-1 pojačalo je fosforilaciju p65 koju je pokrenuo V. harveyi, što dalje sugerira da V. harveyi inducira autofagiju za negativnu regulaciju NF-kB signalizacije (Slika 4O). Zatim smo pokušali odrediti biološku važnost Beclina-1 u infekciji V. harveyi, posebno u kontroli proliferacije V. harveyi. Proveden je CFU test i utvrđeno je da i Beclin-1 utišavanje i CQ-blokirana autofagija smanjuju proliferaciju V. harveyi, što dokazuje da V. harveyi koristi autofagiju za promicanje svoje proliferacije (Slika 4P). Gornji rezultati zajedno otkrivaju da ACKR4a inducira i stvara komplekse s Beclinom-1 za promicanje autofagije, a zatim olakšava infekciju V. harveyi.

koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav

Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda za jačanje imuniteta

【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

ACKR4a je inducirao autofagiju do blokirane apoptoze

Autofagna stanična smrt smatra se razumnom alternativom apoptozi, a apoptoza je također priznati antibakterijski mehanizam; uspješne bakterijske infekcije dovršavaju samoreplikaciju inhibicijom apoptoze.22 Kako bi se odredio odnos između autofagije i apoptoze izazvane V. harveyi, određena je apoptoza stanica MBrC s različitim tretmanima prije i nakon infekcije V. harveyi, a utišavanje ACKR4a povećalo je V. apoptoza izazvana harveyi (slike 5A i 5B, lijevi panel). Budući da su kaspaza3 i kaspaza7 važne u inicijaciji apoptoze, široko su prihvaćene kao pouzdani pokazatelji apoptoze. Test kaspaze Glo 3/7 pokazao je da prekomjerna ekspresija ACKR4a inhibira aktivnost kaspaze 3/7 izazvanu V. harveyi, dok je utišavanje ACKR4a pojačalo aktivnost kaspaze 3/7 izazvanu V. harveyi (Slika 5B, desna ploča). V. harveyi i egzogeno dodana rekombinantna aktivna kaspaza8 inducirana aktivnost kaspaze3/7 bila je inhibirana ACKR4a (Slika 5C), što sugerira da je ACKR4a sposoban učinkovito blokirati signaliziranje apoptoze. Iako je dokazana autofagija izazvana ACKR4a, potrebna su daljnja istraživanja kako bi se istražila uloga autofagije u blokiranju apoptoze. Kao što je prikazano na slici 5D, utišavanje ACKR4a značajno je povećalo efektorske kaspaze (kaspaza7) i inicijatorske kaspaze (kaspaza8). Osim toga, prekomjerna ekspresija ACKR4a inhibirala je mRNA kaspaze7 i kaspaze8 (Slika 5E), a nokdaun ACKR4a značajno je povećao kaspazu7 i kaspazu8 u zebricama (slike S2E i S2F). Prethodne studije pokazale su da je Beclin-1 molekularni prekidač koji posreduje u procesima apoptoze i autofagije,45 pa je istražena uključenost Beclina-1 u regulaciju apoptoze. U našoj studiji, Beclin-1 prekomjerna ekspresija smanjila je kaspazu8 izazvanu V. harveyi, dok je Beclin-1 utišala pojačano reguliranu kaspazu8 izazvanu V. harveyi (Slika 5F). Nađen je zanimljiv rezultat da je kaspaza8 značajno pojačana u 3 sata od infekcije V. harveyi; opet je bio inhibiran s povećanjem trajanja infekcije, a LC3-II je bio u negativnoj korelaciji s kaspazom8 (Slika 5G). Prema gornjim rezultatima, ACKR4a je inducirao autofagiju da blokira apoptotsko signaliziranje i olakša infekciju V. harveyi, a Beclin-1 bi mogao biti potencijalna meta u kaskadi autofagije i apoptoze.

Slika 5. ACKR4a inducira autofagiju da blokira apoptozu

Ap-1 pojačava ACKR4a-induciranu autofagiju kod infekcije V. harveyi

Nakon toga je istražen mehanizam ekspresije ACKR4a izazvane infekcijom V. harveyi. Prvo su konstruirana četiri različita promotorska plazmida ACKR4a prema sekvencama predviđanja promotora (Slika 6A). Analiza luciferaze pokazala je da je aktivnost ACKR4a-p-3 najveća (Slika 6B). Kako bi se identificirao uzvodni aktivator ekspresije ACKR4a tijekom infekcije V. harveyi, analizirana je promotorska regija ACKR4a i otkriveno je da ACKR4a ima potencijalna mjesta vezivanja Sp-1 i Ap-1 (Slika 6C). Analiza ACKR4a-luc pokazala je da Sp-1 ne može pojačati aktivnost luciferaze, a Ap-1 pojačati aktivnost luciferaze (slike 6D i 6E), što povećava mogućnost da ACKR4a može biti izravna meta Ap -1. Kako bi se to ispitalo, konstruirana su dva vektora luciferaze koji se sastoje od mutantnog ACKR4a (Slika 6F). Test luciferaze pokazao je da mutanti kojima nedostaju mjesta vezanja Ap-1 inhibiraju aktivnost luciferaze za razliku od divljeg tipa (Slika 6G). Kako bismo potvrdili da Ap-1 potiče ekspresiju ACKR4a, utišali smo ili pojačali ekspresiju Ap-1 prekomjernom ekspresijom ili nokdaunom, a ekspresija ACKR4a procijenjena je u transficiranim MBrC stanicama. Utišavanje Ap-1 značajno je smanjilo ekspresiju ACKR4a izazvanu V. harveyi (Slika 6H), dok je prekomjerna ekspresija Ap-1 značajno pojačala ekspresiju ACKR4a (Slika 6I). Rezultati imunoblota bili su u skladu s rezultatima qPCR-a, prekomjerna ekspresija Ap-1 povećala je ekspresiju ACKR4a, dok je utišavanje Ap-1 smanjilo ekspresiju ACKR4a (Slika 6J). ChIP analiza je pokazala da se Ap-1 veže za promotor ACKR4a u stanicama MBrC u normalnim fiziološkim uvjetima, a stimulacija V. harveyi pojačala je vezanje Ap-1 za promotor ACKR4a (Slika 6K). Gore navedeni rezultati potvrdili su da je ACKR4a potencijalni transkripcijski cilj Ap-1. Zatim je istražena funkcija Ap-1 u autofagiji; Prigušivanje Ap-1 učinkovito je smanjilo nakupljanje GFP-LC3 izazvano infekcijom V. harveyi (Slika 6L), a također je oslabilo pojačanu regulaciju LC3-II izazvanu infekcijom V. harveyi (Slika 6M) ). Proveden je CFU test kako bi se istražila uloga Ap-1 u infekciji V. harveyi i utvrđeno je da AP-1 olakšava proliferaciju V. harveyi (Slika 6N). Uzeti zajedno, gornji rezultati pokazuju da Ap-1 aktivira transkripciju i ekspresiju ACKR4a i doprinosi infekciji V. harveyi.

Slika 6. Ap-1 pojačana autofagija izazvana ACKR4a kod infekcije V. harveyi

Slika 7. Radni model kako ACKR4a olakšava infekciju V. harveyi

RASPRAVA

Pokazalo se da su ACKR uključeni u nekoliko bioloških procesa kao što su regulacija kemokinskog sustava, internalizacija kemokinskog liganda, unutarstanična razgradnja i upalni odgovor,4,26 što je važno ne samo za adaptivni imunitet, već i kao važna komponenta urođenog imunološkog sustava .33,34 Međutim, uloga ACKR-a u upalnom odgovoru na bakterijsku infekciju u riba nije istražena. Ova studija po prvi put pokazuje da ACKR4a, član obitelji ACKR, potiče infekciju V. harveyi na kostne ribe autofagijom i apoptozom. Mehanički gledano, transkripcija ACKR4a bila je regulirana na gore pomoću faktora transkripcije AP-1. Zatim je pojačano regulirani ACKR4a sinergiziran s Beclinom-1 kako bi se inducirala autofagija i transportirao MyD88 u lizosome na razgradnju. U međuvremenu, ACKR4a inducira autofagiju za blokiranje apoptoze i zatim olakšava infekciju V. harveyi (Slika 7). Urođeni imunitet igra ključnu ulogu u zaštiti eukariota od endogene i egzogene patogene invazije.46 Kao rezultat dugotrajne izloženosti mikroorganizmima, ribe su razvile optimiziraniji urođeni imunitet kako bi ih zaštitile od infekcija.47 TLR su prepoznali PAMP kada dođe do bakterijske infekcije, i pokrenuo urođeni imunološki odgovor preko MyD88-ovisnih i neovisnih puteva, koji su inducirali proizvodnju proupalnih citokina za uklanjanje bakterijske infekcije. MyD88 je bitan adapter u TLR signalizaciji, s izuzetkom TLR3, svi TLR-ovi sisavaca koriste MyD88 za aktiviranje NF-kB signalizacije.48 Stoga bi moglo biti najučinkovitije izravno regulirati MyD88. Na primjer, S-1-acetilcistein inhibira proizvodnju IL-6 potičući razgradnju MyD88. Slično tome, u riba je prijavljeno da IRF3 i eIF3k inhibiraju NF-kB signaliziranje ciljanjem na MyD88.42,49 Prikupljeni dokazi također sugeriraju da je MyD88 bio važan za uklanjanje bakterijskih infekcija. Na primjer, miševi s nedostatkom MyD88-nisu mogli prepoznati bakterijske komponente i bili su vrlo osjetljivi na S. aureus. 50 Osim toga, također se pokazalo da je MyD88 uključen u eliminaciju bakterijskih infekcija kod zebrica. 41 Aktivacija urođenog imunološkog sustava potiče čišćenje bakterija, što predstavlja veliki selektivni pritisak, potičući ih da razviju sposobnost suzbijanja urođenog imuniteta .51,52 Dokazano je da salmonela može regulirati imunološke odgovore i manipulirati upalnim odgovorima nakon inficiranja stanica domaćina. SpvC virulencije salmonele ireverzibilno defosforilira ERK, p38 i MAPK, čime inhibira transkripciju proupalnih citokina.53 U ovoj studiji, pojačano regulirani ACKR4a u M. miiuy inficiranom s V. harveyi kombiniran je s MyD88 za inhibiciju fosforilacije p65 i blokirati NF-kB signalizaciju. Ovo sugerira da bakterije također mogu potisnuti urođeni imunitet riba ometanjem stabilnosti adaptera u TLR signalizaciji u svrhu izbjegavanja imunološkog sustava.

Autofagija i apoptoza su dva priznata mehanizma otpornosti na bakterijsku invaziju, pri čemu je antimikrobna autofagija barijera protiv mikroorganizama koji napadaju. PRR-ovi mogu inducirati autofagiju u različitim fazama kontakta između domaćina i bakterije i inhibirati intracelularni rast bakterija.54 Nasuprot tome, bakterije su također razvile učinkovite mehanizme za sprječavanje, suzbijanje ili zapovijedanje autofagije. Ti mehanizmi često uključuju ciljanje na Beclin-1 za blokiranje autofagije,55 sprječavanje sazrijevanja autofagosoma56 i čak aktiviranje autofagije u nekim slučajevima kako bi se osigurala prehrana za rast bakterija.57 S druge strane, otkrili smo da V. harveyi inducira Beclin{{6} }aktivirao autofagiju putem ACKR4a, koji cilja MyD88 za autofagnu razgradnju, čime blokira NF-kB signalizaciju i promiče samoreplikaciju. Druga obrambena strategija je programirana stanična smrt (apoptoza), koja se aktivira kada patogeni koriste stanice domaćina za preživljavanje i replikaciju. Na primjer, mikobakterijska infekcija makrofaga uzrokuje apoptozu, koja pridonosi eliminaciji bakterija iz stanica.58 Osim toga, apoptoza makrofaga posredovana TNF-a uništava unutarstanični okoliš za replikaciju mikobakterija i smanjuje stopu rasta zaražene mikobakterije.59 Za borbu protiv pritisak apoptoze na preživljavanje, mnogi uspješni patogeni kodiraju gene čiji produkti inhibiraju apoptozu u stanicama domaćina, čime se održava sposobnost preživljavanja za replikaciju patogena.60 Iako su ti mehanizmi dobro proučeni kod sisavaca, malo se zna o bakterijskoj inhibiciji apoptoze kod riba. U našem istraživanju autofagija izazvana V. harveyi igra ulogu u stadijima apoptoze i blokira apoptotičku signalizaciju. Apoptoza i autofagija promiču i suprotstavljaju se jedna drugoj. U pre-apoptotskim stadijima stanice blokiraju apoptotski put i autofagijom smanjuju razinu apoptoze, čime se održava prednost. Autofagija ne pokreće staničnu smrt u ranim fazama apoptoze, ali također potiče stanično preživljavanje.61 Autofagija tijekom kasne faze apoptoze može potaknuti apoptozu, a zatim povećana apoptoza inhibira pojavu autofagije kroz migraciju p53 i BH3 putova.62 Biološki proces je strogo reguliran, uključujući interakciju autofagije i apoptoze. Brojni regulacijski geni uključeni su u mehanizam interaktivnog odgovora apoptoze i autofagije, a Beclin-1 je jedan od njih.63 Osim regulacije inicijacije autofagije, Beclin-1 također je uključen u regulaciju apoptoze.45 ,64 Studije su pokazale da Beclin-1 gubi sposobnost otpornosti na apoptozu nakon što ga aktiviraju kaspaze.65 To sugerira da Beclin-1 igra važnu ulogu kao "molekularni prekidač" u regulaciji autofagije i apoptoze.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

V. harveyi je morska gram-negativna bakterija koja predstavlja ozbiljnu prijetnju zdravlju morskog ribarskog uzgoja. Infekcija V. harveyi uzrokuje meningitis i encefalitis kod riba,66 a infekcija V. harveyi uzrokuje cerebralnu kongestiju kod kirnji.67 Kao odgovor na bakterijsku infekciju, urođeni imunološki i upalni odgovori glavni su obrambeni sustav riba. Međutim, bakterije su također razvile sposobnost izbjegavanja imuniteta u simbiozi sa svojim domaćinima. Ukratko, naši rezultati otkrivaju mehanizam imunološke evazije V. harveyi kod riba. ACKR4a inducira autofagiju kako bi inhibirao signaliziranje NF-kB i blokirao apoptozu, što zauzvrat olakšava infekciju V. harveyi u kostih riba. Ovo je također prvi put da je otkriveno da gram-negativne bakterije izbjegavaju imunitet istovremeno regulirajući urođeni imunitet i apoptozu putem autofagije. Ova studija daje uvid u razumijevanje učinaka autofagije na interakciju između domaćina i bakterije kod kostih riba i daje pogled na otpornost sisavaca na bakterijske infekcije.

REFERENCE

1. Dinarello, CA (2018). Pregled obitelji IL-1 u urođenoj upali i stečenoj imunosti. Immunol. Otkr. 281, 8–27.

2. Gaidt, MM, Ebert, TS, Chauhan, D., Ramshorn, K., Pinci, F., Zuber, S., O'Duill, F., Schmid-Burgk, JL, Hoss, F., Buhmann, R. i sur. (2017). DNK inflamasom u ljudskim mijeloidnim stanicama pokreće STING-stanični program smrti uzvodno od NLRP3. Ćelija 171, 1110–1124.e18.

3. Xiao, TS (2017). Urođeni imunitet i upale. Ćelija. Mol. Immunol. 14, 1–3.

4. Koropatnick, TA, Engle, JT, Apicella, MA, Stabb, EV, Goldman, WE, i McFallNgai, MJ (2004.). Razvoj posredovan mikrobnim čimbenicima u međusobnom odnosu domaćin-bakterija. Znanost 306, 1186–1188.

5. Janeway, CA (1989). Približavanje asimptoti? Evolucija i revolucija u imunologiji. Cold Spring Harb. Symp. Količina Biol. 54, 1–13.

6. Vallabhapurapu, S. i Karin, M. (2009). Regulacija i funkcija transkripcijskih faktora NF-kB u imunološkom sustavu. Annu. Rev. Immunol. 27, 693–733.

7. Krakauer, T. (2019). Upale, autofagija i stanična smrt: trojstvo urođene obrane domaćina od intracelularnih bakterija. Medijatori upale. 2019, 2471215.

8. Hurley, JH, i Young, LN (2017). Mehanizmi inicijacije autofagije. Annu. Rev. Biochem. 86, 225–244.

9. He, X., Zhu, Y., Zhang, Y., Geng, Y., Gong, J., Geng, J., Zhang, P., Zhang, X., Liu, N., Peng, Y ., et al. (2019). RNF34 djeluje u imunitetu i selektivnoj mitofagiji ciljanjem na MAVS za autofagnu razgradnju. EMBO J. 38, 1009788–e101018.

10. Yin, L., Lv, M., Qiu, X., Wang, X., Zhang, A., Yang, K., i Zhou, H. (2021.). IFN-G manipulira interakcijom autofagije i Edwardsiella piscicida posredovanom NOD1- kako bi povećao unutarstanični klirens u riba. J. Immunol. 207, 1087–1098.

11. Mansilla-Pareja, ME, Bongiovanni, A., Lafont, F., i Colombo, MI (2017.). Promjene integriteta membrane replikativne vakuole Coxiella burnetii i međudjelovanje s putem autofagije. Ispred. Ćelija. Zaraziti. Microbiol. 7, 112.

12. Bravo-Santano, N., Ellis, JK, Mateos, LM, Calle, Y., Keun, HC, Behrends, V., i Letek, M. (2018.). Intracelularni Staphylococcus aureus modulira središnji metabolizam ugljika domaćina da aktivira autofagiju. mSphere 3, 003744– 003818.

13. Winchell, CG, Dragan, AL, Brann, KR, Onyilagha, FI, Kurten, RC, i Voth, DE (2018.). Coxiella burnetii potkopava p62/sekvestosom 1 i aktivira Nrf2 signalizaciju u ljudskim makrofagima. Zaraziti. Imun. 86, e00608–e00617.

14. Lee, HK, Lund, JM, Ramanathan, B., Mizushima, N., i Iwasaki, A. (2007.). Prepoznavanje virusa ovisno o autofagiji pomoću plazmacitoidnih dendritičnih stanica. Znanost 315, 1398–1401.

15. Jounai, N., Takeshita, F., Kobiyama, K., Sawano, A., Miyawaki, A., Xin, KQ, Ishii, KJ, Kawai, T., Akira, S., Suzuki, K., i Okuda, K. (2007). Atg5 Atg12 konjugat povezan je s urođenim antivirusnim imunološkim odgovorima. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD. 104, 14050–14055.

16. Schaaf, MBE, Keulers, TG, Vooijs, MA, i Rouschop, KMA (2016.). Proteini obitelji LC3/GABARAP: autofagija-(ne)povezane funkcije. FASEB J 30, 3961–3978.

17. Chen, Z., Wang, T., Liu, Z., Zhang, G., Wang, J., Feng, S., i Liang, J. (2015.). Inhibicija autofagije pomoću MiR-30A izazvane Mycobacteria tuberculosis kao mogući mehanizam imunološkog bijega u ljudskim makrofagima. Jpn. J. Zaraziti. Dis. 68, 420–424.

18. Kubori, T., Bui, XT, Hubber, A. i Nagai, H. (2017.). Legionella RavZ igra ulogu u sprječavanju regrutiranja ubikvitina u vakuole koje sadrže bakterije. Ispred. Ćelija. Zaraziti. Microbiol. 7, 384.

19. Danial, NN, i Korsmeyer, SJ (2004). Stanična smrt: kritične kontrolne točke. Ćelija 116, 205–219.

20. Salvesen, GS, i Ashkenazi, A. (2011). Snimak: kaspaze. Ćelija 147, 476–476.e1.

21. Zhou, ZJ, i Sun, L. (2016). Edwardsiella tarda inducirana inhibicija apoptoze: strategija za intracelularno preživljavanje. Ispred. Ćelija. Zaraziti. Microbiol. 6, 76.

22. Gu¨nther, SD, Fritsch, M., Seeger, JM, Schiffmann, LM, Snipas, SJ, Coutelle, M., Kufer, TA, Higgins, PG, Hornung, V., Bernardini, ML, et al. (2020). Citosolne Gram-negativne bakterije sprječavaju apoptozu inhibicijom efektorskih kaspaza preko lipopolisaharida. Nat. Microbiol. 5, 354–367.

23. Wierzbicki, IH, Campeau, A., Dehaini, D., Holay, M., Wei, X., Greene, T., Ying, M., Sands, JS, Lamsa, A., Zuniga, E., et al. (2019). Streptokokni S protein skupine A koristi crvene krvne stanice kao imunološku kamuflažu i ključna je determinanta za izbjegavanje imunološkog sustava. Cell Rep. 29, 2979–2989.e15.

24. Chen, J., Lu, Y., Ye, X., Emam, M., Zhang, H., i Wang, H. (2000.). Trenutačni napredak u detekciji kvoruma Vibrio harveyi kao meta otkrivanja lijekova. Eur. J. Med. Chem. 207, 112741.

25. Kimura, T., Jain, A., Choi, SW, Mandell, MA, Schroder, K., Johansen, T., i Deretić, V. (2015.). Precizna autofagija posredovana TRIM-om cilja citoplazmatske regulatore urođenog imuniteta. J. Cell Biol. 210, 973–989.

26. Zlotnik, A. i Yoshie, O. (2012). Ponovno posjećena superobitelj kemokina. Imunitet 36, 705–716.

27. Ulvmar, MH, Hub, E. i Rot, A. (2011.). Atipični kemokinski receptori. Exp. Cell Res. 317, 556–568.

28. Bonecchi, R., Savino, B., Borroni, EM, Mantovani, A., i Locati, M. (2010.). Kemokinski mamac receptori: funkcija strukture i biološka svojstva. Curr. Vrh. Microbiol. Immunol. 341, 15–36.

29. Comerford, I., Litchfield, W., Harata-Lee, Y., Nibbs, RJB, i McColl, SR (2007.). Regulacija kemotaktičkih mreža 'atipičnim' receptorima. Bioeseji 29, 237–247.

30. Horuk, R., Chitnis, CE, Darbonne, WC, Colby, TJ, Rybicki, A., Hadley, TJ, i Miller, LH (1993.). Receptor za malarijski parazit Plasmodium vivax: eritrocitni kemokinski receptor. Znanost 261, 1182–1184.

31. Bonini, JA, Martin, SK, Dralyuk, F., Roe, MW, Philipson, LH, i Steiner, DF (1997.). Kloniranje, ekspresija i kromosomsko mapiranje novog ljudskog CC-kemokinskog receptora (CCR10) koji pokazuje visok afinitet vezanja za MCP-1 i MCP-3. DNA Cell Biol. 16, 1249–1256.

32. Nibbs, RJ, Wylie, SM, Yang, J., Landau, NR, i Graham, GJ (1997.). Kloniranje i karakterizacija novog promiskuitetnog ljudskog beta-kemokinskog receptora D6. J. Biol. Chem. 272, 32078-32083.

33. Burns, JM, Summers, BC, Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, MET, Sunshine, MJ, Littman, DR, Kuo, CJ, et al. (2006). Novi kemokinski receptor za SDF-1 i I-TAC uključen je u preživljavanje stanica, staničnu adheziju i razvoj tumora. J. Exp. Med. 203, 2201–2213.

34. Gosling, J., Dairaghi, DJ, Wang, Y., Hanley, M., Talbot, D., Miao, Z., i Schall, TJ (2000.). Vrhunac: identifikacija novog kemokinskog receptora koji veže dendritične stanice i T-stanice aktivne kemokine uključujući ELC, SLC i TECK. J. Immunol. 164, 2851–2856.

35. Hall, RA, Premont, RT, i Lefkowitz, RJ (1999). Signalizacija heptaheličnih receptora: izvan paradigme G proteina. J. Cell Biol. 145, 927–932.

36. Brzostowski, JA, i Kimmel, AR (2001). Signalizacija pri nultom G: funkcije neovisne o G-proteinu za 7-TM receptore. Trends Biochem. Sci. 26, 291–297.

37. Sun, Y., Huang, J., Xiang, Y., Bastepe, M., Ju¨ppner, H., Kobilka, BK, Zhang, JJ, i Huang, XY (2007.). Prebacivanje ovisno o dozi s G-proteina spregnutog na G-protein-neovisno signaliziranje putem GPCR-a. EMBO J. 26, 53–64.

38. Nibbs, RJB, i Graham, GJ (2013). Imunološka regulacija atipičnim kemokinskim receptorima. Nat. Rev. Immunol. 13, 815–829.

39. Lewis, BP, Burge, CB, i Bartel, DP (2005). Konzervirano uparivanje sjemenki, često okruženo adenozinima, ukazuje na to da su tisuće ljudskih gena meta mikroRNA. Ćelija 120, 15–20.

40. Friedman, RC, Farh, KKH, Burge, CB, i Bartel, DP (2009). Većina mRNA sisavaca su konzervirane mete mikroRNA. Genome Res. 19, 92–105.

41. Denli, AM, Tops, BBJ, Plasterk, RHA, Ketting, RF, i Hannon, GJ (2004.). Obrada primarnih mikroRNA mikroprocesorskim kompleksom. Priroda 432, 231–235.

42. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W., Sun, Y., i Xu, T. (2022.). eIF3k inhibira NF-kB signaliziranje ciljanjem MyD88 za ATG5-posredovanu autofagnu degradaciju u ribama teleostima. J. Biol. Chem. 298, 101730.

43. Chu, Q., Sun, Y., Cui, J., i Xu, T. (2017.). Inducibilna mikroRNA-214 doprinosi suzbijanju upalnog odgovora posredovanog NF-kB putem ciljanja gena myd88 u ribama. J. Biol. Chem. 292, 5282-5290.

44. Gay, NJ, Symmons, MF, Gangloff, M., i Bryant, CE (2014.). Sastavljanje i lokalizacija signalnih kompleksa receptora sličnih Tollu. Nat. Rev. Immunol. 14, 546–558.

45. McKnight, NC, i Zhenyu, Y. (2013). Beclin 1 je bitna komponenta i glavni regulator PI3K-III u zdravlju i bolesti. Curr. Pathobiol. Rep. 1, 231–238.

46. ​​Mutwiri, G., Gerdts, V., Lopez, M., i Babiuk, LA (2007). Urođeni imunitet i novi adjuvansi. Rev. Sci. tehn. 26, 147–156.

47. Buchmann, K. (2014). Evolucija urođenog imuniteta: tragovi od beskralješnjaka preko riba do sisavaca. Ispred. Immunol. 5, 459.

48. Chu, Q., Sun, Y., Cui, J., i Xu, T. (2017b). MicroRNA-3570 modulira put NF-kB u kostih riba ciljajući MyD88. J. Immunol. 198, 3274–3282.

49. Yan, X., Zhao, X., Huo, R., i Xu, T. (2020.). IRF3 i IRF8 reguliraju NF-kB signaliziranje ciljanjem MyD88 u ribama kostima. Ispred. Immunol. 11, 606.

50. Takeuchi, O., Hoshino, K., i Akira, S. (2000.). Vrhunski: miševi s nedostatkom TLR2- i MyD88-deficijentom vrlo su osjetljivi na infekciju Staphylococcus aureus. J. Immunol. 165, 5392–5396.

51. Keszei, AFA, Tang, X., McCormick, C., Zeqiraj, E., Rohde, JR, Tyers, M., i Sicheri, F. (2014.). Struktura kompleksa SspH1-PKN1 otkriva osnovu za prepoznavanje supstrata domaćina i mehanizam aktivacije za bakterijsku E3 ubikvitin ligazu. Mol. Cell Biol. 34, 362–373.

52. Gu¨nster, RA, Matthews, SA, Holden, DW, i Thurston, TLM (2017.). SseK1 i SseK3 tip III sustava izlučivanja efektori inhibiraju NFkB signalizaciju i nekroptotičnu staničnu smrt u makrofagima zaraženim salmonelom. Zaraziti. Imun. 85, e00010-e00017.

53. Mazurkiewicz, P., Thomas, J., Thompson, JA, Liu, M., Arbibe, L., Sansonetti, P., i Holden, DW (2008.). SpvC je efektor Salmonella s aktivnošću fosfotreonin liaze na protein kinaze domaćina aktivirane mitogenom. Mol. Microbiol. 67, 1371–1383.

54. Saitoh, T. i Akira, S. (2010.). Regulacija urođenih imunoloških odgovora proteinima povezanim s autofagijom. J. Cell Biol. 189, 925–935.

55. Orvedahl, A., Alexander, D., Tallo´ czy, Z., Sun, Q., Wei, Y., Zhang, W., Burns, D., Leib, DA, i Levine, B. (2007. ). HSV-1 ICP34.5 daje neurovirulentnost ciljanjem proteina autofagije Beclin 1. Cell Host Microbe 1, 23–35.

56. Kyei, GB, Dinkins, C., Davis, AS, Roberts, E., Singh, SB, Dong, C., Wu, L., Kominami, E., Ueno, T., Yamamoto, A., i dr. al. (2009). Put autofagije križa se s biosintezom HIV-1 i regulira prinose virusa u makrofagima. J. Cell Biol. 186, 255–268.

57. Niu, H., Xiong, Q., Yamamoto, A., Hayashi Nishino, M., i Rikihisa, Y. (2012.). Autofagosomi inducirani bakterijskim veznim proteinom Beclin 1 olakšavaju obveznu intracelularnu infekciju. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD. 109, 20800-20807.

58. Hussain, MA, Datta, D., Singh, R., Kumar, M., Kumar, J., i Mazumder, S. (2019.). TLR-2 posredovan citosolni-Ca2+ val aktivira ER stres-superoksid-NO signalosome povećavajući proizvodnju TNF-a što dovodi do apoptoze ribljih makrofaga zaraženih Mycobacterium smegmatis. Sci. Rep. 9, 12330.

59. Lee, J., Hartman, M., i Kornfeld, H. (2009). Apoptoza makrofaga u tuberkulozi. Yonsei Med. J. 50, 1–11.

60. McCormick, AL (2008). Kontrola apoptoze ljudskim citomegalovirusom. Curr. Vrh. Microbiol. Immunol. 325, 281–295.

61. Kuma, A., Hatano, M., Matsui, M., Yamamoto, A., Nakaya, H., Yoshimori, T., Ohsumi, Y., Tokuhisa, T., i Mizushima, N. (2004.) . Uloga autofagije tijekom ranog neonatalnog razdoblja gladovanja. Priroda 432, 1032–1036.

62. Marin˜o, G., Niso-Santano, M., Baehrecke, EH, i Kroemer, G. (2014.). Samokonzumacija: međudjelovanje autofagije i apoptoze. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 81–94.

63. Furuya, D., Tsuji, N., Yagihashi, A., i Watanabe, N. (2005.). Beclin-1 je pojačao apoptozu izazvanu cis diaminedikloroplatinom pojačavanjem aktivnosti kaspaze 9. Exp. Cell Res. 307, 26–40.

64. Pattingre, S., Tassa, A., Qu, X., Garuti, R., Liang, XH, Mizushima, N., Packer, M., Schneider, MD, i Levine, B. (2005.). Bcl-2 antiapoptotski proteini inhibiraju Beclin 1-ovisnu autofagiju. Ćelija 122, 927–939.

65. Djavaheri-Mergny, M., Maiuri, MC, i Kroemer, G. (2010.). Unakrsni razgovor između apoptoze i autofagije kaspazom posredovanim cijepanjem Beclin 1. Oncogene 29, 1717-1719.

66. Grimes, DJ, Gruber, SH, i May, EB (1985). Eksperimentalna infekcija limunskih morskih pasa, Negaprion brevirostris (Poey), vrstom Vibrio. J. Riba. Dis. 8, 173–180.

67. Mohamad, N., Mohd Roseli, FA, Azmai, MNA, Saad, MZ, Md Yasin, IS, Zulkiply, NA, i Nasruddin, NS (2019.). Prirodna istodobna infekcija Vibrio harveyi i V. alginolyticus u uzgojenih hibridnih kirnji u Maleziji. J. Aquat. Anim. Zdravlje 31, 88–96.