Ekstrakt Cistanche Deserticola povećava stvaranje kostiju u osteoblastima--I dio

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Te-Mao Li^aet a

Sažetak
Ciljevi Istražili smo učinakCistanchedeserticolamama (CD) uključenkostformiranjeuzgojenim osteoblastima. Metode Test formiranja mineraliziranih nodula korišten je za ispitivanje in vitro učinaka CD-a(Cistanchedeserticola)nakostformiranje. Ekspresija mRNA alkalne fosfataze (ALP), koštanih morfogenetskih proteina (BMP)-2 i osteopontina (OPN) analizirana je kvantitativnom lančanom reakcijom polimeraze u stvarnom vremenu. Mehanizam djelovanja CD-a(Cistanchedeserticola)Ekstrakt je ispitan pomoću Western blottinga. In vivo antiosteoporotski učinak CD-a(Cistanchedeserticola)Ekstrakt je procijenjen u miševa s ovariektomijom.
Ključni pronalasci

CD(Cistanchedeserticola)Ekstrakt nije imao učinka na proliferaciju, migraciju ili zacjeljivanje rana uzgojenih osteoblasta, ali je povećao ALP, BMP-2 i OPN mRNA i mineralizaciju kostiju. Mitogen-aktivirana protein kinaza (MAPK) ili inhibitori nuklearnog faktora (NF)-kB smanjuju CD(Cistanchedeserticola)izazvan ekstraktomformiranje kostijui ALP, BMP-2 i OPN izraz. Međutim, CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt nije utjecao na osteoklastogenezu. Osim toga, CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt spriječio je gubitak koštane mase izazvan ovariektomijom in vivo.
Zaključci

CD(Cistanchedeserticola)može biti romanformiranje kostijusredstvo za liječenje osteoporoze.

Ključne riječiformiranje kostiju; Cistanchedeserticola; kineska biljka; osteoblasti

Cistanche deserticolaje dobar zaformiranje kostiju

Uvod

Kost je složeno tkivo sastavljeno od nekoliko tipova stanica koje prolaze kontinuirani proces obnove i popravka koji se naziva 'pregradnja kostiju'. Dvije glavne vrste stanica odgovorne za remodeliranje kosti su osteoklasti, koji resorbiraju kost, i osteoblasti, koji tvore novu kost. Pregradnju kostiju regulira nekoliko sistemskih hormona (npr. paratiroidni hormon, 1, 25-dihidroksi vitamin D3, spolni hormoni i kalcitonin) i lokalni čimbenici (npr. dušikov oksid, prostaglandini, faktori rasta i citokini).[1] Osteoporoza nastaje kada su resorpcija i stvaranje kosti nekoordinirani, a prekomjerna razgradnja kosti nadmašuje izgradnju kosti.[2] Trenutačni tretmani za osteoporozu uključuju bisfosfonate, kalcitonin i estrogen, koji su inhibitori resorpcije kostiju koji održavaju koštanu masu inhibicijom aktivnosti osteoklasta.[3] Međutim, učinak ovih lijekova u povećanju ili oporavku koštane mase je relativno mali, sigurno ne više od 2 posto godišnje.[3] Stoga postoji potreba za sredstvima za izgradnju kostiju, kao što je teriparatid, koja stimuliraju novekostformiranjei ispraviti promjenu trabekularne mikroarhitekture koja je karakteristična za utvrđenu osteoporozu.[4,5] Budući da je novakostformiranjeje primarno funkcija osteoblasta, agensi koji djeluju ili povećanjem proliferacije stanica osteoblastične loze ili induciranjem diferencijacije osteoblasta mogu poboljšati stvaranje kosti.[5,6]
Iako mehanizmi osteoporoze ostaju nejasni, vjerojatno su povezani sa smanjenom dostupnošću ili učincima čimbenika rasta kostiju, kao što su koštani morfogenetski proteini (BMP).[7] BMP, koji su strukturno povezani s superporodicom transformirajućeg faktora rasta-b, izvorno su identificirani po svojoj sposobnosti da induciraju ektopičnekost formiranjekod glodavaca.[8] BMP igraju važnu ulogu ukostformiranjei diferencijaciju koštanih stanica stimulacijom aktivnosti alkalne fosfataze (ALP), kao i sintezu proteoglikana, kolagena i osteopontina (OPN).[9] Nedavna studija pronašla je vezu između osteoporoze i specifičnih polimorfizama u BMP-2, ALP i OPN genima, što sugerira da su povezani s razvojem osteoporoze.[10]

Cistanchedeserticolamama (Orobanchaceae; skraćeno CD)(Cistanchedeserticola)je izvorna biljka u Kini i naširoko se koristi u tradicionalnoj medicini kao terapeutsko sredstvo zbog svojih sedativnih, analgetskih i imunostimulirajućih svojstava.[11] Moderne farmakološke studije pokazale su da CD(Cistanchedeserticola)ekstrakti mogu stimulirati imunitet [12], hvatati slobodne radikale [13] i povećati aktivnost superoksid dismutaze.[14] Protuupalni i antioksidativni agensi imaju potencijal za liječenje osteoporoze povećanjemkost formiranjei/ili suzbijanje resorpcije kosti.[15,16] Međutim, učinak CD-a(Cistanchedeserticola)na funkciju koštanih stanica još nije utvrđeno. Evo, prijavljujemo taj CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt nije utjecao na proliferaciju, migraciju ili aktivnost zacjeljivanja rana uzgojenih osteoblasta, ali je povećao ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN i mineralizaciju kostiju. Osim toga, pokazujemo da signalni putovi mitogen-aktivirane protein kinaze (MAPK) i nuklearnog faktora (NF)-kB mogu biti uključeni u CD-posredovano povećanje ekspresije gena i mineralizacije kostiju. Nasuprot tome, CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt nije potisnuo osteoklastogenezu in vitro. Posebno, liječenje miševa s CD-om(Cistanchedeserticola)ekstrakt je spriječio gubitak koštane mase izazvan ovariektomijom in vivo. Naši podaci, dakle, sugeriraju da je CD(Cistanchedeserticola)može se koristiti za stimulacijukostformiranjeza liječenje osteoporoze.

Cistanche deserticolaojačati imunitet

Materijali i metode

Ekstrakt i materijali Cistanche deserticola

CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt je kupljen od Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Tajvan). Ekstrakcija i izolacija CD-a(Cistanchedeserticola)pratili su kako je prethodno opisano (na temelju spektralnih podataka identificirali su kemijski sastav uključujući beta-sitosterol, daukosterol, jantarnu kiselinu, triakontanol, akteozid, betain i polisaharid).[17] Zečja poliklonska protutijela specifična za p-ekstracelularne kinaze regulirane signalom (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminalne kinaze (JNK), JNK, p-p65 i p65 kupljene su od Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, SAD). Komplet osteokalcin ELISA kupljen je od Biosource Technology (Nivelles, Belgija). C-terminalni telopeptidi ELISA kompleta kolagena tipa I dobiveni su od Cross Laps (Herlev, Danska). P38 dominantno-negativni mutant osigurao je dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, SAD). JNK dominantno-negativni mutant osigurao je dr. M. Karin (Sveučilište Kalifornije, San Diego, SAD). ERK2 dominantno negativni mutant osigurao je dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Svi ostali reagensi nabavljeni su od Sigma-Aldrich (St Louis, SAD).

Kultura stanica

Stanična linija mišjih osteoblasta MC3T3-E1 kupljena je od American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, SAD). Stanice su uzgajane u 95 posto zraka, 5 posto CO2 s a-MEM-om koji je nadopunjen s 20 mm HEPES i 10 posto toplinski inaktiviranog fetalnog telećeg seruma, 2 mm-glutamina, penicilina (100 U/ml) i streptomicina (100 mg /ml).

Mjerenje formiranja mineraliziranih nodula

Formiranje mineraliziranih nodula procijenjeno je kako je opisano.[18] Ukratko, osteoblasti su uzgajani u mediju koji je sadržavao vitamin C (50 mg/ml) i b-glicerofosfat (10 mm) dva tjedna, a medij je mijenjan svaka tri dana. Nakon inkubacije s CD-om(Cistanchedeserticola)ekstrakta 12 dana, stanice su isprane dva puta s 20 mm Tris-puferiranom fiziološkom otopinom koja je sadržavala 0,15 m NaCl (pH 7,4), fiksirane u ledeno hladnom 75 postotnom (v/v) etanolu 30 minuta i zračno- suho. Taloženje kalcija određeno je bojanjem alizarin crvenim S. Ukratko, stanice i matrica fiksirane etanolom bojane su 1 h s 40 mm alizarin crvenim-S (pH 4,2) i opsežno isprane vodom. Vezana mrlja eluirana je s 10 posto (w/v) cetilpiridinijevim kloridom, a alizarin crveno-S u uzorcima je kvantificirano mjerenjem apsorbancije na 550 nm i uspoređeno sa standardnom krivuljom. Jedan mol alizarin crvenog-S selektivno veže približno dva mola kalcija.

Cistanche deserticolaje dobar zaformiranje kostiju

Kvantitativna lančana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu

Ukupna RNA ekstrahirana je iz osteoblasta pomoću TRIzol kompleta (MDBio Inc., Taipei, Tajvan). Reverzna transkripcija provedena je korištenjem 2 mg ukupne RNA i oligo(dT) početnice.[19,20] Kvantitativna lančana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu (qPCR) provedena je korištenjem TaqMan® jednostupanjske PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, SAD). Dodana je ukupna cDNA (100 ng po 25-ml reakcije) s početnicama specifičnim za sekvencu i Taqman® probama. Svi primeri ciljnih gena i sonde kupljeni su komercijalno, uključujući b-aktin kao internu kontrolu (Applied Biosystems). qPCR testovi su provedeni u triplikatu na StepOnePlus sustavu za otkrivanje sekvenci (Applied Biosystems). Uvjeti ciklusa bili su 10-minutna aktivacija polimeraze na 95 stupnjeva nakon čega je slijedilo 40 ciklusa od 95 stupnjeva tijekom 15 s i 60 stupnjeva tijekom 60 s. Prag je postavljen iznad pozadine kontrole bez uzorka i unutar linearne faze umnožavanja ciljnog gena kako bi se izračunao broj ciklusa u kojem je otkriven transkript (označeno CT).

Western blot analiza

Stanični lizati su pripremljeni kao što je prethodno opisano.[21,22] Proteini su odvojeni pomoću SDS-PAGE i prebačeni na Immobilon polivinil difluoridne membrane (Millipore, Billerica, SAD). Mrlje su blokirane 4-postotnim goveđim serumskim albuminom 1 sat na sobnoj temperaturi, a zatim testirane zečjim anti-ljudskim protutijelima protiv p-65 ili p-p65 (1:1000) 1 h na sobnoj temperaturi. Nakon tri ispiranja, mrlje su inkubirane s peroksidazom konjugiranim magarećim anti-zečjim sekundarnim protutijelom (1:1000) 1 sat na sobnoj temperaturi. Mrlje su vizualizirane pojačanom kemiluminiscencijom pomoću X-OMAT LS filma (Eastman Kodak, Rochester, SAD).

Osteoporoza izazvana ovarijektomijom

Ženke ICR miševa, stare četiri tjedna, 22~28 g, korištene su za ovu studiju. Miševi su bilateralno ovariektomirani pod anestezijom trikloroacetaldehidom (100 mg/kg), a kontrolni miševi su lažno operirani (Sham) za usporedbu. Mineralna gustoća kostiju i mineralni sadržaj kostiju mjereni su nakon oralne primjene različitih koncentracija CD-a(Cistanchedeserticola)ekstrakt svaka dva dana tijekom četiri tjedna. Ukupna tjelesna mineralna gustoća kostiju i mineralni sadržaj kostiju određeni su dvoenergetskim rendgenskim apsorpciometrom (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, SAD) koristeći način za male subjekte kao što je prethodno opisano.[18, 23] Svi su protokoli bili u skladu s institucionalnim smjernicama i odobreni su od strane Odbora za brigu o životinjama Kineskog medicinskog sveučilišta.

Statistička analiza

Statistička analiza provedena je pomoću softvera Prism 4.01. (GraphPad Software Inc., San Diego, SAD). Dane vrijednosti su srednja vrijednost SEM. Statistička analiza između dva uzorka provedena je Studentovim t-testom. Statističke usporedbe više od dvije skupine provedene su korištenjem jednosmjerne analize varijance s Bonferronijevim posthoc testom. U svim slučajevima P < 0,05="" smatralo="" se="">

Cistanche deserticolaje dobar zaformiranje kostiju

Rezultati

Cistanche deserticolaekstrakt povećava mineralizaciju kostiju osteoblastima Dodatak CD-a(Cistanchedeserticola)ekstrakta tijekom 24 ili 48 h nije utjecao na proliferaciju stanica mišjeg osteoblasta MC3T3-E1 u MTT testu (podaci nisu prikazani). Budući da je diferencijacija osteoblasta složen proces koji uključuje staničnu proliferaciju i migraciju, također smo testirali migracijsku sposobnost stanica MC3T3-E1 nakon tretmana CD-om(Cistanchedeserticola)ekstrakt. Koristeći Transwell i testove zacjeljivanja rana, pronašli smo taj CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt nije utjecao na migraciju osteoblasta (podaci nisu prikazani). Stvaranje mineraliziranih nodula jedan je od markera sazrijevanja osteoblasta. Bojanje alizarin crvenim S pokazalo je da su mineralizirani noduli nastali kada su osteoblasti kultivirani dva tjedna u mediju koji sadrži vitamin C (50 ug/ml) i -glicerofosfat (10 mm), na način ovisan o koncentraciji dodatkom CD-a(Cistanchedeserticola)(Slika 1a). Stoga, CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt inducira stvaranje koštanih nodula kultiviranim osteoblastima, ali ne i njihovu proliferaciju ili migraciju. Također smo ispitali ulogu CD-a(Cistanchedeserticola)ekstrakta u osteoklastogenezi izazvanoj RANKL-om, ali nije pronađen učinak (podaci nisu prikazani).

Ekstrakt Cistanche deserticola povećava ekspresiju alkalne fosfataze, koštanog morfogenetskog proteina-2 i osteopontina u kultiviranim osteoblastima

Diferencirani osteoblasti pokazuju povećanu aktivnost ALP, što je u korelaciji s visokim razinama ekspresije enzima.[18] Našli smo taj tretman s CD-om(Cistanchedeserticola)ekstrakta tijekom 72 sata značajno je povećao aktivnost ALP osteoblasta (Slika 1b). S obzirom na ključnu ulogu BMP-2, ALP i OPN u diferencijaciji osteoblasta, testirali smo je li CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt djeluje na diferencijaciju osteoblasta reguliranjem ekspresije BMP-2, ALP i OPN. Liječenje stanica CD-om(Cistanchedeserticola)ekstrahira povećanu ekspresiju mRNA ALP, BMP-2 i OPN na način ovisan o koncentraciji (Slika 1c), pokazujući da CD(Cistanchedeserticola)ekstrahirati induciranu diferencijaciju osteoblasta pojačavanjem ekspresije ALP, BMP-2 i OPN.

Ekstrakt Cistanche deserticola povećava formiranje koštanih nodula kroz put protein kinaze aktiviran mitogenom

Zabilježeno je da MAPK igra važnu ulogu ukostformiranje[24,25] pa smo zatim ispitali je li ovaj signalni put uključen u CD(Cistanchedeserticola)mineralizacija kosti izazvana ekstraktima. Predtretman stanica s ERK inhibitorom U0126, p38 inhibitorom SB203580 ili JNK inhibitorom SP600125 smanjio je CD(Cistanchedeserticola)ekstraktom povećana mineralizacija kosti (slike 2a, 3a i 4a). Nadalje, inhibitori su također blokirali CD(Cistanchedeserticola)ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN izazvanu ekstraktom (slike 2b–4c). Transfekcija stanica s ERK2, p38 ili JNK mutantnim smanjenim CD-om(Cistanchedeserticola)ekstrakt-povećanje ekspresije mRNA ALP, BMP-2 i OPN (slike 2c, 3c i 4c). Zatim smo izravno ispitali ERK, p38 i JNK aktivaciju nakon CD-a(Cistanchedeserticola)liječenje ekstraktom. Inkubacija stanica s CD-om(Cistanchedeserticola)fosforilacija ERK, p38 i JNK inducirana ekstraktom (slike 2d, 3d i 4d). Stoga ERK, p38 i JNK posreduju u povećanjukostformiranjeizazvana CD-om(Cistanchedeserticola)liječenje osteoblasta.

Ekstrakt Cistanche deserticola povećava stvaranje koštanih nodula putem nuklearnog faktora-kB

Kao što je prethodno spomenuto, NF-kB aktivacija je neophodna zakostformiranje[26,27] Zatim smo osteoblaste tretirali inhibitorima NF-kB pirolidin ditiokarbamatom (PDTC) i N-tozil-L-fenilalanin klorometil ketonom (TPCK) kupljenim od Calbiochema (Darmstadt, Njemačka) kako bismo utvrdili je li aktivacija NF-kB uključen u CD(Cistanchedeserticola)mineralizacija kosti izazvana ekstraktima. Slika 5a pokazuje da je prethodna obrada osteoblasta s PDTC ili TPCK inhibirala CD(Cistanchedeserticola)ekstraktom inducirano stvaranje koštanih nodula, a također je smanjio porast ekspresije ALP, BMP-2 i OPN (Slika 5b i 5c). Fosforilacija podjedinice NF-kB p65 pokazatelj je aktivacije NF-kB;[28] u skladu s tim, otkrili smo da CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt povećao fosforilaciju p65 u osteoblastima (Slika 5d). Ovi rezultati pokazuju da je aktivacija NF-kB važna za ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN izazvanu ekstraktom CD-a i stvaranje koštanih čvorića.

Slika 4. Uključenost c-Jun N-terminalnih kinaza (JNK) uCistanchedeserticola(CD) ekstraktom inducirana mineralizacija kosti u osteoblastima. (a) Stanice su postavljene u 24-pločice s jažicama i uzgajane u mediju koji sadrži vitamin C (50 mg/ml) i b-glicerofosfat (10 mM) dva tjedna. Stanice su istovremeno tretirane CD-om(Cistanchedeserticola)ekstrakt (26 mg/ml) plus SP600125 (3 mM). Formiranje mineraliziranih nodula procijenjeno je bojanjem alizarin crvenim S (n=5). (b, c) Stanice su prethodno tretirane SP600125 30 minuta ili transficirane JNK mutantom ili 24 sata nakon čega je uslijedila stimulacija ekstraktom CD-a i aktivnost alkalne fosfataze (ALP) i ALP, koštani morfogenetski protein (BMP)-2 i Ekspresija mRNA osteopontina (OPN) mjerena je ALP priborom i kvantitativnom lančanom reakcijom polimeraze u stvarnom vremenu. (d) Stanice su tretirane CD ekstraktom u navedenim vremenskim intervalima, a ekspresija p-JNK ispitana je Western blotingom. *P< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Cistanchedeserticola)skupina tretirana ekstraktima.

Inhibicija gubitka koštane mase ekstraktom Cistanche deserticola u ovarijektomiziranih miševa

Za ispitivanje učinka CD-a(Cistanchedeserticola)ekstrakta na gubitak koštane mase, osteoporoza je inducirana u ženki miševa ovariektomijom. Kao što se očekivalo, miševi s ovariektomijom pokazali su smanjenu ukupnu mineralnu gustoću kostiju i mineralni sadržaj kostiju (Slika 6a i 6b). Liječenje CD-om(Cistanchedeserticola)ekstrakta tijekom četiri tjedna inhibirao je gubitak mineralne gustoće kostiju i mineralnog sadržaja kostiju na način ovisan o dozi (Slika 6a i 6b). Koncentracije ALP u krvi mogu odražavati osteoblastičnu aktivnost.[29] Kao što je prikazano na slici 6c, CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt inhibira smanjenje aktivnosti ALP u serumu izazvano ovarijektomijom. Osim toga, CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt je također povećao razinu osteokalcina, markerakostformiranje, i smanjio razinu C-terminalnih telopeptida kolagena tipa I, markera resorpcije kosti (Slika 6d i 6e). Ovi nalazi stoga podupiru moć i učinkovitost CD-a(Cistanchedeserticola)ekstrakt u sprječavanju gubitka koštane mase in vivo.

Slika 6 Inhibicija smanjenja mineralne gustoće kostiju i sadržaja minerala u kostima izazvana ovariektomijomCistanchedeserticola(CD) izvod. Ženke ICR miševa su podvrgnute lažnoj operaciji ili su ovariektomirane. Ovarijektomirani miševi tretirani su navedenim koncentracijama CD-a(Cistanchedeserticola)ekstrakt oralnim hranjenjem. Ukupna tjelesna mineralna gustoća kostiju (a), sadržaj minerala u kostima (b), aktivnost alkalne fosfataze (ALP) u serumu (c), serumski osteokalcin (d) i serumski C-terminalni telopeptidi kolagena tipa I (e), određeni su četiri tjedana nakon operacije. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost SE, n=8–10 miševa/skupini. *P < 0.05,="" u="" usporedbi="" s="" lažnim;="" #p="">< 0,05,="" u="" usporedbi="" s="" ovariektomiranom="">

RASPRAVA

Kliknite ovdje za informacije o II. dijelu (Rasprava i zaključak) ovog članka.

Od: 'Cistanchedeserticolaekstrakt se povećavakostformiranjeu osteoblastima' poTe-Mao Li^aet al

---© 2012 Autori. JPP © 2012. Kraljevsko farmaceutsko društvo 2012Časopis za farmaciju i farmakologiju, 64, str. 897–907