Feniletanoidni glikozidi Cistanche Tubulosa induciraju apoptozu u stanicama H22 hepatocelularnog karcinoma kroz ekstrinzične i intrinzične signalne puteve

Pozadina

Rak jetre zauzeo je šesto mjesto po učestalosti raka i četvrto mjesto po smrti od raka u svijetu. Štoviše, zauzeo je četvrto mjesto po učestalosti raka i prvo mjesto po smrtnosti od raka u zemljama s niskim sociodemografskim indeksom [1]. U Kini je rak jetre treći vodeći uzrok smrti od raka u 2015. [2]. Više od 90% primarnih karcinoma jetre u svijetu je hepatocelularni karcinom (HCC) [3]. Trenutačno je resekcija jetre glavna opcija za terapiju HCC-a. Međutim, manje od 30% bolesnika s HCC-om ispunilo je kriterije kurativne resekcije jetre, a ukupna 5--godišnja stopa preživljenja još uvijek je samo 35-50% zbog visoke stope recidiva [4, 5] . Dostupnost mogućnosti liječenja za bolesnike sa srednje do uznapredovalim HCC-om vrlo je ograničena. Sorafenib, molekularno ciljani lijek, odobrila je FDA kao prvu liniju liječenja uznapredovalog HCC-a. Međutim, sorafenib samo produljuje oko 3 mjeseca preživljenja, a stopa odgovora je manja od 4% [6, 7]. Hitno je potrebno razviti nove lijekove ili strategije protiv HCC-a.

Tradicionalna kineska medicina (TCM) sama ili u kombinaciji s drugim strategijama korištena je za liječenje HCC-a i pokazala je kliničke prednosti uključujući produljeno vrijeme preživljavanja, poboljšanu kvalitetu života, smanjene nuspojave i tako dalje [8, 9]. Cistanche, vrsta TCM-a, ima različite biološke funkcije, kao što su antioksidacijska, protuupalna, protiv starenja i neuroprotekcija [10, 11]. Feniletanoidni glikozidi smatraju se glavnim aktivnim sastojcima Cistanche, koji imaju različite aktivnosti uključujući antioksidaciju, protuupalno, hepatoprotekciju i neuroprotekciju [12-15]. Naša grupa je to prijavilaFeniletanoidni glikozidi Cistanche tubulosa (CTPG)mogao inducirati apoptozu u stanicama melanoma B16-F10 i inhibirati rast tumora kod miševa [16]. U ovoj studiji mjerili smo antitumorski učinak CTPG na HCC H22 stanice i in vitro i in vivo te istraživali njegove mehanizme. Otkrili smo da CTPG inducira apoptozu u H22 stanicama kroz ekstrinzične i intrinzične signalne putove i suzbija rast H22 tumora kod miševa.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Metode

Stanična linija

Stanice mišjeg H22 hepatocelularnog karcinoma dobivene su iz Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, Xinjiang University (Urumqi, Xinjiang, Kina) i uzgojene u mediju RPMI 1640 (Gibco) s dodatkom 100 U/ml penicilina i 100 ug/ml streptomicin i 10% toplinski inaktivirani fetalni goveđi serum (Gibco) na 37 stupnjeva u vlažnoj atmosferi od 5% CO2.

MTT test

CTPG je kupljen od Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. (Hetian, Xinjiang, Kina), a glavni spojevi CTPG-a kvalificirani su i kvantificirani tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti [16]. Vijabilnost stanica procijenjena je 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolij bromidom (MTT) (Sigma, St. Louis, MO , SAD). Stanice H22 inokulirane su u 96-pločice s jažicama u gustoći od 2 × 104 stanice u 100 ul medija po jažici i uzgajane na 37 stupnjeva. Nakon 24 sata, stanice su tretirane različitim koncentracijama CTPG (0, 100, 200, 300 i 400 ug/ml) ili 0,3% DMSO (jednako onom u 400 ug/ml CTPG) tijekom 24, 48 i 72 sata, odnosno. Nakon centrifugiranja na 1000 okretaja u minuti tijekom 7 minuta, supernatant je odbačen i 100 ul MTT otopine (5 mg/ml u PBS) je dodano u svaku jažicu. Ploče su inkubirane na 37 stupnjeva 4 h i dodano je 100 ul DMSO da se otope formirani kristali formazana. Vrijednosti OD490 detektirane su 96-čitačem mikropločica (Bio-Rad Laboratories, CA, SAD). Vijabilnost stanica izračunata je prema formuli: Vijabilnost stanica (%)=(ODtretirane/ODnetretirane) × 100%.

Detekcija apoptoze

H22 stanice su tretirane različitim koncentracijama CTPG (0, 100, 200, 300 i 400 ug/ml) ili 0,3% DMSO tijekom 24 sata, a zatim su obojene Annexin VFITC/Propidiumom jodid (PI) Apoptosis Detection Kit (YEASEN, Kina) prema uputama proizvođača. Uzorci su analizirani protočnom citometrijom (BD FACSCalibur, SAD).

Detekcija potencijala mitohondrijske membrane

Stanice H22 tretirane su različitim koncentracijama CTPG-a (0, 200 i 400 ug/ml) tijekom 24 sata, a zatim su obojene bojom JC-1 koja propušta membranu (Beyotime, Kina) tijekom 20 sati. min na 37 stupnjeva. Nakon dva puta ispiranja s JC-1 puferom, uzorci su resuspendirani s 300 ul JC-1 pufera i analizirani protočnom citometrijom (BD FACSCalibur, SAD).

Analiza staničnog ciklusa

H22 stanice su inokulirane u 60 mm posude za kulturu i tretirane različitim koncentracijama CTPG (0, 100, 200, 300 i 400 ug/ml) ili 0,3% DMSO tijekom 24 h. Sve stanice su sakupljene i isprane dva puta s PBS. Stanice su fiksirane u 70%-tnom ledeno hladnom etanolu na -20 stupnjeva tijekom 2 h i isprane dva puta s PBS-om, zatim ponovno suspendirane u 300 ul pufera za bojenje Propidium jodid/RNase (BD Biosciences). Nakon 10 minuta na sobnoj temperaturi uzorci su prikupljeni protočnom citometrijom (BD FACSCalibur, SAD), a distribucija staničnog ciklusa analizirana je programom ModFit LT 3.0.

Hoechst 33,258 bojenje

Morfološke promjene H22 staničnih jezgri analizirane su membranski permeabilnom bojom za vezanje DNA Hoechst 33,258. Stanice H22 posađene su u 6-ploču s jažicom u koncentraciji od 1 × 105 stanica/jažici u mediju od 2 ml. Nakon 60% ~ 70% konfluencije, stanice su tretirane s CTPG (0, 100, 200, 300 i 400 ug/ml) tijekom 24 sata. Stanice su sakupljene i fiksirane s 4% ledeno hladnim paraformaldehidom na 4 stupnja tijekom 10 minuta. Nakon ispiranja s PBS-om, stanice su obojene s Hoechst 33,258 (Beyotime, Kina) na 4 stupnja tijekom 10 minuta. Uzorci su promatrani invertnim fluorescentnim mikroskopom (Nikon Eclipse Ti-E, Japan).

Western blot

Anti-kaspaza-3, anti-cijepana kaspaza-3, anti-Bcl-2 i antiBax kupljeni su od Beyotime Biotech Co., Ltd. (Šangaj, Kina). Anti-kaspaza-7, anti-cijepana-kaspaza-7, anti-kaspaza-8, anti-cijepana-kaspaza-8, anti-kaspaza-9, anti -cijepana kaspaza-9, anti-PARP, anti-cijepani PARP, antimišji IgG-HRP i anti-zečji IgG-HRP kupljeni su od Cell Signaling Technology. Anti- -aktin je kupljen od Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Peking, Kina).

H22 stanice su tretirane različitim koncentracijama CTPG (0, 100, 200, 300 i 400 ug/ml) ili 0,3% DMSO tijekom 24 sata. Stanice su sakupljene i lizirane otopinom za lizu stanica RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) 30 minuta na ledu. Uzorci su centrifugirani (12,000 g tijekom 15 minuta na 4 stupnja) kako bi se prikupili supernatanti, a koncentracije proteina izmjerene su BCA kompletom (Thermo Fisher Scientific, SAD). Jednaka količina proteina u svakom uzorku izolirana je pomoću 12% SDS-PAGE i prenesena na PVDF membrane (Biosharp, Kina). Nakon blokiranja puferom TBST koji sadrži 5% nemasnog mlijeka, membrane su inkubirane s odgovarajućim primarnim protutijelima i sekundarnim protutijelima konjugiranim na peroksidazu hrena (HRP). Nakon ispiranja s TBST-om, ciljni proteini su detektirani ECL kompletom za ispitivanje (Beyotime, Kina).

Životinje i etička izjava

6-8 tjedana stari mužjaci Kunming miševa kupljeni su od Animal Laboratory Center, Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, Kina). Miševi su držani u standardnoj ustanovi za životinje s kontroliranom temperaturom i svjetlosnim ciklusima na Sveučilištu Xinjiang. Sve studije na životinjama provedene su u skladu sa smjernicama Odbora za brigu i korištenje životinja Sveučilišta Xinjiang. Protokol je odobrio Odbor za etiku pokusa na životinjama Ključnog laboratorija za biološke resurse i genetski inženjering u Xinjiangu (BRGE-AE001) Sveučilišta Xinjiang.

Studija tumora na mišu

Za indukciju tumorskog modela miša, mužjacima Kunming miševa supkutano je ubrizgano 1 × 106 H22 stanica u 100 ul PBS-a u desni bok. Nakon 3 dana, miševi su nasumično podijeljeni u 3 skupine (7 miševa po skupini). Kontrolnoj skupini ubrizgano je 0,1 ml DMSO supkutano oko tumora. Skupinama CTPG-200 i CTPG-400 supkutano je ubrizgano 200 ili 400 mg/kg CTPG u 0,1 ml DMSO oko tumora. Miševi su tretirani svaka 2 dana do 21 dan. Veličine tumora mjerene su pomoću čeljusti do 25 dana, a volumen tumora izračunat je prema formuli: volumen tumora (mm3 )=(dužinaךirina2 )/2. Nakon 25 dana, preživljenje tumorskih miševa praćeno je svaki dan do kraja ove studije.

Statistička analiza

Statistička značajnost izračunata je jednosmjernom analizom varijance između liječenih i kontrolnih skupina. Svi podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). p < 0.05 smatra se statistički značajnim.

Rezultati

CTPG je smanjio održivost H22 stanica in vitro

Kako bi se istražio antitumorski učinak CTPG-a na HCC, stanice H22 tretirane su različitim koncentracijama CTPG-a (0, 100, 200, 300 i 400 ug/ml) in vitro. Nakon 24 sata, morfologija H22 stanica promatrana je pomoću invertnog mikroskopa. Otkrili smo da je morfologija H22 stanica dramatično promijenjena tretmanom CTPG-om. S porastom koncentracije CTPG-a stanice su postale male i okrugle, a broj stanica također se znatno smanjio (slika 1a). MTT test korišten je za analizu održivosti H22 stanica nakon tretmana CTPG-om tijekom 24, 48, odnosno 72 sata. CTPG je značajno smanjio vitalnost H22 stanica na način ovisan o dozi i vremenu (slika 1b). CTPG od 300 ug/ml postigao je najbolju stopu inhibicije (slika 1c). Vrijednosti IC50 CTPG za H22 stanice su 236 ug/ml nakon 24 sata i 169,8 ug/ml nakon 48 sati.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE PAMĆENJA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

CTPG je inducirao apoptozu u H22 stanicama

Kako bi se istražilo je li smanjena vitalnost H22 stanica posredovana indukcijom apoptoze, H22 stanice su tretirane različitim koncentracijama CTPG (0, 100, 200, 300 i 400 ug/ml) tijekom 24 sata i obojene s PI i aneksin V. Rezultati protočne citometrije pokazali su da CTPG značajno inducira apoptozu H22 stanica (uključujući ranu i kasnu apoptozu) na način ovisan o dozi (Slika 2a). Iako je visoka doza CTPG također značajno povećala nekrozu H22 stanica, nekroza ima manju ulogu u inhibiciji rasta H22 stanica zbog nižeg udjela (8,3%) u usporedbi s onim apoptoze (52,6%). Nadalje, ukupni proteini H22 stanica izolirani su nakon tretmana CTPG-om, a Western mrlja. Podaci skeniranja u sivim tonovima pokazali su da su razine ekspresije Bax i Bcl-2 povećane odnosno smanjene. Omjer Bax/Bcl-2 značajno je povećan (slika 2b). Ovi rezultati sugeriraju da CTPG inducira apoptozu u H22 stanicama.

CTPG izaziva kromosomsku kondenzaciju i zaustavljanje staničnog ciklusa u H22 stanicama

Zabilježeno je da oštećenje DNA i zaustavljanje staničnog ciklusa izazvano lijekovima može inhibirati rast tumorskih stanica i izazvati apoptozu u tumorskim stanicama [17, 18]. Kako bi se otkrila morfologija jezgri u H22 stanicama nakon tretmana CTPG-om tijekom 24 sata, H22 stanice su obojene Hoechstom 33,342 i promatrane pomoću invertne fluorescentne mikroskopije. Stanice tretirane CTPG-om pokazale su o dozi ovisan porast jarko kondenziranog kromatina jezgri, dok su netretirane stanice pokazale homogeno obojene jezgre (Slika 3a). Distribucija staničnog ciklusa u H22 stanicama je dalje analizirana PI bojenjem nakonCTPG liječenjetijekom 24 h. Kao što je prikazano na slici 3b, liječenje CTPG-om značajno je povećalo udio stanica G0/G1- i G2/M-faze i značajno smanjilo udio stanica S-faze, što sugerira da je CTPG inducirao G 0/G1 i G2/Mfazni zastoj u H22 stanicama. Visoka doza CTPG također je značajno povećala udio sub-G1 stanica.

CTPG je smanjio potencijal mitohondrijske membrane i povećao otpuštanje citokroma c

Put ovisan o mitohondriju igra važnu ulogu u indukciji apoptoze [19, 20]. Promjene u potencijalu mitohondrijske membrane (Δψm) mogu se pratiti JC-1 bojenjem jer se JC-1 agregat (crvena fluorescencija) može raspasti u monomer (zelena fluorescencija) uz smanjenje Δψm [21]. Nakon CTPG tretmana tijekom 24 sata, H22 stanice su obojene JC- 1 bojom. Podaci protočne citometrije pokazali su da su crvena fluorescencija u FL-2 kanalu i zelena fluorescencija u FL-1 kanalu značajno smanjene i povećane nakon tretmana CTPG-om. Udio PE− FITC+ stanica bio je značajno povećan (Slika 4a), što sugerira da je CTPG smanjio Δψm u H22 stanicama. To je u skladu s povećanim omjerom Bax/Bcl-2. Posljedično, primijetili smo da je otpuštanje citokroma c značajno povećano nakon tretmana CTPG-om (slika 4b). Ovi rezultati pokazuju da bi CTPG mogao djelomično inducirati apoptozu u H22 stanicama mitohondrijskim (intrinzičnim) putem.

CTPG je aktivirao put kaspaze i spriječio popravak DNK

Zatim je analizirana aktivacija kaspaze inducirana CTPG-om preko ekstrinzičnih i intrinzičkih signalnih putova. Nakon CTPG tretmana tijekom 24 sata, ukupni proteini su izolirani iz H22 stanica i razine pro- i cijepanih kaspaza su detektirane Western blotom. U usporedbi s netretiranom ili DMSO kontrolom, liječenje CTPG-om značajno je povećalo ne samo razinu pocijepane kaspaze-8 (vanjski put), već i razinu pocijepane kaspaze-9 (unutarnji put) (Sl. 5). Sekvencijalno, aktivirane kaspaze-8 i -9 cijepaju nizvodnu pro-kaspazu-3 i -7 što je uočeno na slici 5. Aktivirana kaspaza-3 cijepa DNK popravak enzima poli (ADP-riboza) polimeraze (PARP) kako bi se spriječio popravak DNA i akumulacija oštećenja DNA kao što je prikazano na slici 3a.

Ovi rezultati pokazuju da je CTPG inducirao apoptozu u H22 stanicama kroz ekstrinzične i intrinzične signalne putove.

CTPG suzbija rast H22 HCC in vivo i poboljšava stopu preživljavanja tumorskih miševa

Konačno, antitumorski učinak CTPG-a na HCC procijenjen je na modelu tumora miša, što je utvrđeno supkutanom injekcijom H22 stanica. Nakon 3 dana injekcije H22 stanica, tumorski miševi su tretirani s CTPG 8 puta. Tjelesna težina miševa i veličina tumora praćeni su u naznačenim vremenskim točkama. Kao što je prikazano na slici 6a, tjelesna težina miševa u svakoj skupini nema značajne razlike, što sugerira da odabrane doze CTPG-a nemaju očite nuspojave.

Zanimljivo je da je rast tumora u miševa tretiranih s 200 mg/kg i 400 mg/kg CTPG-a bio značajno inhibiran (slika 6b). Štoviše, dvije doze liječenja CTPG-om uvelike su poboljšale preživljenje tumorskih miševa (3/7, 3/7) u usporedbi s kontrolnom skupinom (0/7) na kraju eksperimenta (Slika 6b). Također smo otkrili da CTPG značajno pojačava proliferaciju splenocita izoliranih iz mužjaka Kunming miševa na način ovisan o dozi (Slika 6c), što sugerira da CTPG ima imunostimulirajući učinak.

NAJKVALITETNIJA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Rasprava

TKM se već dugu povijest koristi za liječenje raznih bolesti uključujući rak. Zabilježeno je da TCM može inducirati apoptozu u različitim vrstama tumorskih stanica kroz ekstrinzične (posredovane receptorima smrti) i intrinzične (ovisne o mitohondrijima) signalne putove za ispoljavanje antitumorskih učinaka [22-25]. Ova dva puta mogu aktivirati kaspazu -8 i -9 [24, 26]. Ovdje smo otkrili da CTPG značajno potiskuje rast H22 stanica kroz indukciju apoptoze i zaustavljanje staničnog ciklusa. Razine cijepane kaspaze-8 i -9 bile su značajno povišeneCTPG liječenje, što sugerira da su i vanjski i unutarnji signalni putovi bili uključeni u indukciju apoptoze. Naša prethodna studija pokazala je da je CTPG inducirao apoptozu u stanicama melanoma B16-F10 putem ovisnim o mitohondrijima koji je povećao razinu pocijepane kaspaze-9, ali ne i kaspaze-8 [16]. CTPG može aktivirati različite signalne putove u različitim tipovima tumorskih stanica.

Integritet mitohondrijske membrane strogo reguliraju članovi obitelji proteina BCL-2 uključujući Bax i Bcl-2 [27, 28]. Omjer Bax prema Bcl-2 igra ključnu ulogu u putu apoptoze ovisnom o mitohondrijima [29]. U stanicama H22 tretiranim CTPG-om, omjer Bax/Bcl-2 bio je značajno povišen, što bi moglo uzrokovati smanjenje Δψm i oslobađanje citokroma c promatrano u ovoj studiji. Posljedično, pro-kaspaza-9 je odcijepljena i aktivirana. Konačno, inicijatori aktivne kaspaze-8 i -9 aktivirali su izvršitelja kaspaze-3 da cijepa PARP kako bi spriječio popravak DNK. Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da CTPG inducira apoptozu u H22 stanicama kroz ekstrinzične i intrinzične signalne putove.

U modelu tumorskog miša, CTPG je značajno potisnuo rast H22 HCC i znatno poboljšao preživljavanje tumorskih miševa. Zanimljivo je da je CTPG ovisno o dozi poticao proliferaciju splenocita Kunming miševa, što je u skladu s našom prethodnom studijom [16]. Ovi rezultati sugeriraju da bi CTPG mogao potisnuti rast H22 HCC u miševa kroz izravni antitumorski učinak i posredno jačanje imunološkog sustava.

Zaključci

CTPG je potisnuo rast H22 stanica i in vitro i in vivo i inducirao apoptozu u H22 stanicama kroz ekstrinzične i intrinzične signalne putove. Ovi podaci pokazuju da bi CTPG mogao biti potencijalni kandidat za liječenje HCC-a.