Feniletanoidni glikozidi Cistanche Tubulosa induciraju apoptozu u Eca-109 stanicama putem puta koji ovisi o mitohondrijima

Uvod

Rak jednjaka jedna je od najčešćih vrsta raka s 11. najvišom stopom morbiditeta i 6. najvišom stopom mortaliteta na globalnoj razini, te je izazvao ~439 000 smrtnosti u 2015. Učestalost raka jednjaka znatno varira među različitim regijama, s istočnim Azija te istočna i južna Afrika pokazuju najviše stope incidencije, a zapadna Afrika pokazuje najniže stope u 2012. U Kini, procijenjeni slučajevi raka jednjaka i smrtnost bili su 477,000 odnosno 375,000 , 2015. Iako se stopa morbiditeta od raka jednjaka smanjila u zemljama srednjeg i visokog srednjeg sociodemografskog indeksa između 2005. i 2015., stopa mortaliteta ostaje visoka zbog loše prognoze. Kombinacija kirurške resekcije s kemoterapijom ili radioterapijom koristila se za liječenje raka jednjaka, međutim, objavljeno je da je između 2003. i 2014. 5-godišnja stopa preživljenja ostala<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studypokazao daCistanche tubulosa feniletanoidni glikozidi(CTPG) mogao suzbiti rast stanica melanoma B16-F10 in vitro i in vivo (24). Međutim, slaba topljivost u vodi prethodno korištenog CTPG-a ograničava razvoj lijeka. Stoga je korišten vodotopivi CTPG (CTPG-W) te je ispitan antitumorski učinak na stanice raka jednjaka (Eca-109). Utvrđeno je da CTPG-W može ovisno o dozi inhibirati održivost Eca-109 stanica putem indukcije apoptoze putem puta ovisnog o mitohondrijima.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materijali i metode

Životinje.

Ženke miševa C57BL/6 (6-8 tjedana, ~25 g) kupljene su od Beijing Laboratory Animal Research Center (Peking, Kina) i smještene u komoru s kontroliranom temperaturom (25˚C), s ciklusom svjetlosti (12/ 12) Zavod za životinje Sveučilišta Xinjiang (Urumqi, Kina). Sve su životinje dobile vodu i hranu bez patogena.

Stanična linija i kultura.

Stanična linija ljudskog karcinoma jednjaka (Eca-109) sačuvana je u Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (Koledž za znanost i tehnologiju života, Sveučilište Xinjiang, Urumqi, Kina) i uzgojena u RPMI{{1} } medij (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, SAD) s dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma inaktiviranog toplinom (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Kina), 1% L -glutamin (100 mM), 100 U/ml penicilina i 100 µg/ml streptomicina na 37˚C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5% CO2.

Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti (HPLC).

CTPG-W (kat. br. SGJG20170410) kupljen je od Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Šangaj, Kina). Glavni spojevi CTPG-a kvalificirani su i kvantificirani HPLC-om prema našoj prethodnoj studiji (24). Ukratko, HPLC je proveden na ZORBAX SB‑C18 koloni (250x4,6 mm; 5 µm) na 30˚C i eluiran s 0,2% otopinom mravlje kiseline i gradijentom metanola počevši od 23%, jer je 1 ml dodavan svake minute 45 minuta do postizanja 31%. Ukupno 10 µl uzorka je ubrizgano i detektirano na 330 nm. Standard ehinakozida nabavljen je od Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Šangaj, Kina), a standard akteozida nabavljen je od Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka). Standardi su korišteni za analizu komponenti CTPG-W.

MTT test.

Proliferacija stanica mjerena je MTT testom. Eca{{0}} stanice inokulirane su u 96-pločice s jažicama u gustoći od 5x103 stanice u 100 µl RPMI{{5 }} medij/jažica i uzgaja se na 37˚C 24 sata, zatim se tretira različitim koncentracijama (0, 200, 400, 600 i 800 µg/ml) CTPG-W ili 0,4% dimetil sulfoksida (DMSO) 24 sata, 48 i 72 h. DMSO je korišten kao kontrola otapala (800 ug/ml CTPG-W koji sadrži 0,4% DMSO). Cisplatin (20 µg/ml) korišten je kao pozitivna kontrola. Nakon toga, supernatant je bačen nakon centrifugiranja na 225 xg tijekom 5 minuta na sobnoj temperaturi i 100 µl MTT otopine (0,5 mg/ml u RPMI-1640 mediju bez FBS) je dodano u svaku jažicu i inkubirano na 37˚C tijekom 3 h. Nastali kristali formazana otopljeni su u 200 ul DMSO. Vrijednosti optičke gustoće (OD) izmjerene su na valnoj duljini od 490 nm pomoću 96-čitača mikropločica (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, SAD). Relativna vitalnost stanica izračunata je prema formuli: vitalnost stanica (%)=(ODtretirane/ODnetretirane)x100%. Morfologija stanica Eca‑109 promatrana je invertnim fluorescentnim mikroskopom (povećanje, x200) (Nikon Eclipse Ti‑E; Nikon Corporation, Tokio, Japan).

Za proliferaciju splenocita, C57BL/6 miševi su eutanazirani dislokacijom cerviksa, a slezene su izolirane. Napravljena je jednostanična suspenzija i splenociti su nasađeni u 96-pločice s jažicama u gustoći od 1x105 stanica/jažici u 100 µl RPMI-1640 medija, a zatim tretirani različitim koncentracijama (0, 200, 400, 600 i 800 µg/ml) CTPG-W tijekom 24, 48 i 72 h na 37˚C s 5% CO2. Proliferacija splenocita mjerena je MTT testom, prema gore navedenom protokolu. Stimulacijski indeks=OD liječen/OD neliječen.

Mjerenje apoptoze i staničnog ciklusa. Eca{{0}} stanice su uzgajane u posudama od 60 mm pri gustoći od 2,5x105 stanica/posudi 24 sata i tretirane različitim koncentracijama ({{31} }, 200, 400, 600 i 800 µg/ml) CTPG-W ili 0,4% DMSO tijekom 24 sata na 37˚C s 5% CO2. Stanice su sakupljene i obojene kompletom za otkrivanje apoptoze Annexin V-fluorescein izotiocijanat (FITC)/Propidium jodid (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Šangaj, Kina), u skladu s protokolima proizvođača. Uzorci su prikupljeni protočnom citometrijom (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, SAD) i analizirani FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, SAD). Kako bi se analizirao učinak CTPG-W na stanični ciklus, 2,5x105 Eca-109 stanica nasađeno je u zdjelice za kulture od 60 mm i tretirano s CTPG-W (0, 100, 200 i 400 µg/ml) ili 0,4 % DMSO 24 h na 37˚C s 5% CO2. Sve su stanice sakupljene i isprane dva puta s ledeno hladnim PBS-om (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), zatim fiksirane u 70% ledeno hladnom etanolu na 4˚C tijekom 30 minuta. Nakon dvaput ispiranja s ledeno hladnim PBS-om, stanice su resuspendirane u 300 µl PI/RNase pufera za bojenje (BD Biosciences, San Jose, CA, SAD) 10 minuta na sobnoj temperaturi. Distribucija staničnog ciklusa analizirana je programom ModFit LT 3.0 protočnom citometrijom (BD FACSCalibur).

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSAProtiv umoraŠtiti jetru PHGS 75% ECH 30% ACT 12%

Analiza mitohondrijskog membranskog potencijala (Δψm) i reaktivnih kisikovih vrsta (ROS).Za analizu Δψm, Eca{{0}} stanice su tretirane s CTPG-W (0, 400, 600 i 800 µg/ml) ili 0,4% DMSO za 24 h na 37˚C s 5% CO2 i obojen kompletom za ispitivanje potencijala mitohondrijske membrane s JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Kina), prema protokolu proizvođača, 20 minuta na 37˚ C. Nakon dva puta ispiranja s JC-1 puferom za ispiranje (Beyotime Institute of Biotechnology), uzorci su resuspendirani s 300 µl JC-1 pufera za ispiranje i analizirani protočnom citometrijom (BD FACSCalibur). Fluorescencija boje JC‑1 u stanicama Eca‑109 također je promatrana invertnim fluorescentnim mikroskopom (povećanje, x200; Nikon Eclipse Ti‑E). Za analizu ROS-a, Eca-109 stanice su tretirane s CTPG-W (0, 400, 600 i 800 µg/ml) tijekom 2, 4, 6, 12 i 24 h i obojene testom reaktivnih kisikovih vrsta kit (Beyotime Institute of Biotechnology), prema protokolu proizvođača, 20 minuta na 37˚C. Nakon tri puta ispiranja s ledeno hladnim PBS-om, uzorci su prikupljeni protočnom citometrijom (BD FACSCalibur) i analizirani softverom FlowJo 7.6.

Slika 1. Kvalificirana kontrola CTPG-W. Komponente CTPG-W su kvalitativno i kvantitativno analizirane tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti i uspoređene sa standardima ehinakozida i akteozida. CTPG-W, feniletanoidni glikozidi topljivi u vodiC. tubuloza.

2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) aktivnost hvatanja radikala. Aktivnost hvatanja slobodnih radikala CTPG-W određena je DPPH analizom slobodnih radikala prema objavljenom protokolu uz manju modifikaciju, jer je metanol zamijenjen etanolom da se otopi DPPH (25,26). Za mjerenja u stabilnom stanju, 150 µl DPPH (100 mmol/l) u etanolu je pomiješano s različitim koncentracijama CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 i 600 µg/ml) u 50 µl PBS, i inkubirano u mraku 30 minuta na sobnoj temperaturi. Apsorpcija na 517 nm detektirana je u prisutnosti i odsutnosti CTPG-W. Kao pozitivna kontrola korišteno je ukupno 50 µl vitamina C. Aktivnost uklanjanja DPPH radikala izračunata je pomoću formule: uklanjanje (%)=[1-(Auzorak-prazno)/A0] x100, gdje je prazno apsorbancija kontrole (bez DPPH), kao uzorak je apsorbancija uzorka, a A0 je apsorbancija PBS-a s DPPH.

Western blot analiza. Eca{{0}} stanice su tretirane s CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) ili 0,4% DMSO tijekom 24 sata na 37˚C s 5% CO2. Sljedeće ispiranje dva puta s PBS, stanice 

Slika 2. Učinak CTPG-W na rast Eca-109 stanica i splenocita. (A) Eca-109 stanice su tretirane s različitim koncentracijama CTPG-W tijekom 24, 48 i 72 h, a zatim je vitalnost stanica detektirana MTT testom. (B) Morfološke promjene stanica Eca-109 nakon tretmana CTPG-W nakon 24 sata. (C) Splenociti miševa C57BL/6 tretirani su različitim koncentracijama CTPG-W tijekom 24, 48 i 72 sata, a zatim je proliferacija analizirana s MTT testom.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubuloza.

su lizirani u puferu za lizu radioimunoprecipitacijskim testom (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Peking, Kina) 20 minuta na ledu. Nakon centrifugiranja na 10,{2}} xg tijekom 10 minuta na 4˚C, supernatanti su sakupljeni, a koncentracije proteina su detektirane kompletom bicinhoninske kiseline (Thermo Fisher Scientific, Inc.) u skladu s protokolima proizvođača. Western blot analiza provedena je prema našem prethodnom opisu (24). Antitijela protiv kaspaze-7 (kat. br. D120077), kaspaze-8 (kat. br. D155240), kaspaze-9 (kat. br. D220078), B-stanični limfom{ {13}} (Bcl-2)-povezan X (Bax) (kat. br. D220073) i Bcl-2 (kat. br. D260117), i anti-mišji IgG-peroksidaza hrena (HRP ) (kat. br. D111050) i anti-zečji IgG-HRP (kat. br. D110058) kupljeni su od BBI Life Sciences (Šangaj, Kina). Antitijela protiv kaspaze-3 (kat. br. E-AB-10050) i aktivne kaspaze-3 (kat. br. E-AB-22115) kupljena su od Elabscience ( Wuhan, Kina). Ostala antitijela protiv kaspaze-7 (kat. br. 9492), poli (ADP-riboza) polimeraze (PARP) (kat. br. 9542), citokroma c (kat. br. AC909), c-Jun NH{ {37}}terminalna kinaza (JNK) (kat. br. 9252S) i -aktin (kat. br. 58169) dobiveni su od Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, SAD). Sva primarna i sekundarna antitijela razrijeđena su u omjeru 1:1,000. Primarna antitijela su inkubirana na 4˚C preko noći, a sekundarna antitijela su inkubirana na 37˚C 1 sat.

Slika 3. Apoptoza Eca-109 stanica izazvana CTPG-W. Stanice su tretirane različitim koncentracijama CTPG-W tijekom 24 sata. (A) Apoptotične i nekrotične Eca‑109 stanice analizirane su protočnom citometrijom. Gornja ploča prikazuje pojedinačne točkaste dijagrame, a donja ploča prikazuje podatke sažetka. * P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubuloza.

Ciljani proteini detektirani su pomoću kompleta za ispitivanje poboljšane kemiluminescencije (Beyotime Institute of Biotechnology), prema protokolu proizvođača.

Statistička analiza. Statistička značajnost izračunata je jednosmjernom analizom varijance s Tukeyjevim post hoc testom, a rezultati su analizirani pomoću softvera GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, SAD) među tretiranim i kontrolnim skupinama. Svi podaci prikazani su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

EKSTRAKT CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE FUNKCIJE BUBREGA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Rezultati

CTPG-W suzbija rast Eca-109 stanica.

Komponente CTPG-W kvalificirane su i kvantificirane pomoću HPLC (slika 1), koje su uspoređene sa standardima ehinakozida i akteozida. Prema vršnim retencijskim vremenima i vršnim površinama, CTPG-W je sadržavao 39,16% ehinakozida i 2,44% akteozida. Prvo, učinak CTPG-W na održivost Eca-109 stanica određen je MTT testom. CTPG-W je otopljen u DMSO pri 200 mg/ml i razrijeđen s RPMI-1640 medijem koji sadrži 10% toplinski inaktiviranog FBS-a do naznačenih koncentracija. Eca-109 stanice su tretirane s CTPG-W, a viabilnost stanica analizirana je MTT testom u naznačenim vremenskim točkama. Liječenje CTPG-W značajno je smanjilo održivost Eca-109 stanica na način ovisan o dozi i vremenu (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Slika 4. Učinak CTPG-W na distribuciju staničnog ciklusa u Eca-109 stanicama. Različite koncentracije CTPG-W korištene su za tretiranje Eca-109 stanica tijekom 24 sata, a distribucija staničnog ciklusa analizirana je protočnom citometrijom. * P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubuloza.

CTPG-W izaziva apoptozu u stanicama Eca-109. Kako bi se istražilo je li CTPG-W potisnuo rast Eca-109 stanica putem indukcije apoptoze ili nekroze, stanice su tretirane različitim koncentracijama CTPG-W. Nakon 24 sata, apoptoza i nekroza Eca-109 stanica otkrivene su bojanjem aneksinom V/PI. Kao što je prikazano na slici 3A, Annexin V- /PI+ stanice su zatvorene kao nekrotične stanice, a Annexin V+ /PI+ i Annexin V+ /PI- stanice su zatvorene kao apoptotične stanice. CTPG-W primarno je inducirao apoptozu Eca-109 stanica na način ovisan o dozi, iako se broj nekrotičnih Eca-109 stanica također značajno povećao pod tretmanom od 600 i 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG‑W izaziva zaustavljanje staničnog ciklusa u S fazi u Eca‑109 stanicama. Poremećaj staničnog ciklusa raka suzbit će rast stanica i potaknuti apoptozu (27). Distribucija staničnog ciklusa u Eca-109 stanicama detektirana je PI bojenjem nakon tretmana CTPG-W tijekom 24 sata. Uočeno je da su stanice u S fazi porasle, a stanice u G0/G1 fazama pokazale ukupno značajno smanjenje nakon tretmana CTPG-W (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG-W smanjuje Δψm i potiče otpuštanje citokroma c. Apoptoza se može inducirati putem koji ovisi o mitohondriju (28,29). Pro- i anti-apoptotski članovi obitelji BCL-2 proteina igraju važnu ulogu u regulaciji integriteta mitohondrijske membrane (30,31). Nakon tretmana CTPG-W tijekom 24 sata, Δψm je procijenjen pomoću JC-1 bojenja. JC-1 agregat (crvena fluorescencija otkrivena u FL-2) će se raspasti u monomer (zelena fluorescencija otkrivena u FL-1) kada se Δψm smanji (32). Kao što je prikazano na slici 5A, frekvencije FL-1+ FL-2-/+ stanica značajno su porasle ovisno o dozi, što ukazuje da se Δψm Eca-109 stanica smanjio. Promjene fluorescencije u stanicama Eca‑109 također su promatrane invertnim fluorescentnim mikroskopom (slika 5B). S povećanjem koncentracije CTPG-W, crvena fluorescencija se smanjila, a zelena povećala, što je u skladu s podacima iz protočne citometrije. Također je uočeno da je razina citokroma c u citosolu značajno povećana (slika 5C), što je rezultat smanjenja Δψm. Ovo pojačava zaključak izvučen iz povećanog broja FL-1+ FL-2-/+ stanica da se Δψm smanjio kao rezultat tretmana CTPG-W. Zabilježeno je da JNK može regulirati aktivaciju obitelji proteina BCL-2 uzrokujući otpuštanje citokroma c (33-35). Također je utvrđeno da je razina JNK značajno povišena nakon tretmana CTPG-W (slika 5C). Rezultati su pokazali da CTPG-W može inducirati apoptozu Eca-109 stanica kroz put ovisan o mitohondrijima.

Slika 5. Smanjenje Δψm i pojačana regulacija citokroma c i JNK. Eca-109 stanice su tretirane različitim koncentracijama CTPG-W tijekom 24 sata. (A) Δψm je otkriven JC-1 bojenjem, a uzorci su analizirani protočnom citometrijom. Pojedinačni točkasti dijagrami prikazuju promjene u fluorescenciji JC-1. Frekvencije ćelija FL-1+ FL-2-/+ prikazane su na donjoj ploči. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Slika 6. Razine ROS-a u Eca-109 stanicama nakon tretmana CTPG-W i antioksidativno djelovanje CTPG-W. (A) Eca-109 stanice tretirane su različitim koncentracijama CTPG-W, a razine ROS-a analizirane su protočnom citometrijom u naznačenim vremenskim točkama. * P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

Učinak CTPG-W na intracelularno stvaranje ROS-a.ROS bi mogao smanjiti Δψm kako bi inducirao apoptozu (36). Kako bi se istražilo može li CTPG-W povećati proizvodnju ROS-a, Eca-109 stanice su tretirane različitim koncentracijama CTPG-W. Stanice su sakupljene u naznačenim vremenskim točkama i obojene s DCFH-DA. Proizvodnja intracelularnih ROS u Eca-109 stanicama određena je protočnom citometrijom. Kao što je prikazano na slici 6A, 800 µg/ml CTPG-W značajno je povećalo proizvodnju ROS-a od 2-6 h, a smanjilo od 12-24 h. Dodatno, 400 µg/ml CTPG‑W značajno je povećalo proizvodnju ROS-a od 12-24 h. Nadalje, 200 µg/ml CTPG-W nije značajno promijenilo proizvodnju ROS-a. Dinamičke promjene u proizvodnji ROS mogu biti povezane s apoptozom Eca-109 stanica. Također je utvrđeno da CTPG-W ima aktivnost hvatanja slobodnih radikala (slika 6B), što se može povezati sa smanjenom proizvodnjom ROS-a u Eca-109 stanicama tretiranim s 800 µg/ml CTPG-W nakon 12 sati.

Slika 7. Razine cijepanih kaspaza i cijepanih PARP nakon tretmana CTPG-W. Proteini su izolirani iz Eca-109 stanica tretiranih s CTPG-W tijekom 24 sata, a razine cijepanih kaspaza i cijepanih PARP detektirane su Western blot analizom. DMSO, dimetil sulfoksid; CTPG-W, feniletanoidni glikozidi topljivi u vodiC. tubuloza; PARP, poli (ADP-riboza) polimeraza.

CTPG-W pojačava aktivnost kaspaze-3, kaspaze-7, kaspaze-9 i PARP-a. Oslobađanje citokroma c zbog smanjenja Δψm moglo bi aktivirati proteaze kaspaze za induciranje apoptoze (29,30,37). Nakon tretmana CTPG-W tijekom 24 sata, Western blot analizom otkrivena je aktivacija kaspaze-3, 7, 8, 9 i PARP. U usporedbi s kontrolom, razine cijepane kaspaze-9, cijepane kaspaze-7, cijepane kaspaze-3 i cijepane PARP, ali ne i razine cijepane kaspaze{{20 }}, regulirani su prema gore liječenjem CTPG-om na način ovisan o dozi (slika 7). Ovi rezultati pokazuju da je CTPG-W smanjio Δψm i pospješio otpuštanje citokroma c da aktivira kaspaze koje induciraju apoptozu Eca-109 stanica.

Rasprava

Tradicionalni CHM mogao bi inducirati apoptozu stanica raka jednjaka različitim putovima, uključujući ekstrinzični receptor smrti i intrinzične mitohondrijske i endoplazmatske retikulumske stresne staze (29). Naša prethodna studija pokazala je da je CTPG, kao glavna komponenta C. tubulosa, inhibirao rast stanica melanoma B16-F10 kroz indukciju apoptoze preko mitohondrija ovisnog puta (24). U ovoj studiji istraživan je antitumorski učinak CTPG-W na Eca-109 stanice i utvrđeno je da CTPG-W potiskuje rast Eca-109 stanica, inducira apoptozu i zaustavljanje staničnog ciklusa, smanjen Δψm, povećano otpuštanje citokroma c i aktivirane kaspaze. CTPG i CTPG-W mogli bi inducirati apoptozu i zaustavljanje staničnog ciklusa u stanicama raka. Međutim, točni mehanizmi su različiti zbog različitih komponenti CTPG-a (26,64% ehinakozida, 10,19% akteozida i 1,71% izoakteozida) i CTPG-W (39,16% ehinakozida i 2,44% akteozida). CTPG je zaustavio B16-F10 stanice u G0/G1 fazama, ali CTPG-W zaustavio je Eca-109 stanice u S fazi (24). Proizvodnja ROS-a bila je ovisno o dozi povećana CTPG-om, ali je ukazivala na promjenu na vremenski ovisan način visokom dozom CTPG-W, koja se značajno povećala na početku liječenja CTPG-W (2-6 h) i značajno smanjio nakon 12 h, u usporedbi s kontrolom. Mogući razlog je taj što je glavna komponenta CTPG-W ehinakozid. Nekoliko je studija izvijestilo da ehinakozid može inhibirati proizvodnju ROS-a i apoptozu izazvanu ROS-om kako bi pokazao svoje neuroprotektivne učinke i učinke protiv starenja (38-40). Slično, aktivnost hvatanja slobodnih radikala opažena je u ovoj studiji. Stoga se nagađalo da bi neke komponente, uključujući verbaskozid, izo-verbaskozid i salidrozid u visokoj dozi CTPG-W, mogle odmah potaknuti stvaranje ROS-a da izazovu apoptozu Eca-109 stanica (41,42), a zatim ROS je skinuo echinakozid. Drugi mogući razlog za razlike u proizvodnji ROS-a od strane CTPG-a i CTPG-W je da su različite stanične linije korištene u ovoj i prethodnoj studiji (24). Dong i suradnici (43) izvijestili su da ehinakozid može inducirati apoptozu ljudskih SW480 kolorektalnih stanica raka stvaranjem oksidativnog oštećenja DNA bez povećanja razine ROS-a.

Liječenje CTPG-W smanjilo je Δψm i izazvalo oslobađanje citokroma c, koji potiče cijepanje kaspaze-9 (28). Dosljedno, razine cijepane kaspaze-9 bile su regulirane prema gore tretmanom CTPG-W. Nakon toga, aktivna kaspaza-9 može aktivirati kaspazu-3 da izazove apoptozu (44). Razine cijepane kaspaze-3 također su bile regulirane prema gore tretmanom CTPG-W. Međutim, CTPG-W nije aktivirao kaspazu-8, što ukazuje da put ekstrinzičnog receptora smrti nije bio uključen u apoptozu induciranu CTPG-W. Ova opažanja pokazuju da CTPG-W inducira apoptozu Eca-109 stanica putem aktivacije puta ovisnog o mitohondrijima.

PARP igra važnu ulogu u genomskoj stabilnosti i mogu ga cijepati aktivne kaspaze, osobito kaspaze -3 i -7 (45). Utvrđeno je da liječenje CTPG-W aktivira kaspazu-3 i -7, koje mogu cijepati PARP kako bi inhibirale popravak DNA i uzrokovale apoptozu.

CTPG-W također ovisno o dozi i vremenu suzbija rast stanica ljudskog hepatocelularnog karcinoma BEL-7404 (neobjavljeni podaci). Iako CTPG-W inhibira rast Eca-109 i BEL-7404 stanica, potiče proliferaciju splenocita, što može biti posljedica sadržaja polisaharida (~50%) u CTPG-W (46 ). Slično tome, nekoliko je studija pokazalo da polisaharidi mogu pospješiti proliferaciju splenocita (46-49). U mišjem modelu utvrđeno je da je CTPG-W značajno povećao indeks slezene, u usporedbi s kontrolnom skupinom, ali nije utjecao na tjelesnu težinu i ostale indekse organa uključujući srce, jetru, bubrege i pluća (neobjavljeni podaci), što ukazuje da CTPG-W nema citotoksični učinak na normalne stanice.

Zajedno, podaci pokazuju da CTPG-W inhibira rast Eca-109 stanica indukcijom apoptoze putem puta koji ovisi o mitohondrijima

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%