1. Uvod

Identificiranje sastojaka hrane s imunomodulatornim svojstvima zajedno s njihovim odgovarajućim molekularnim ciljevima privuklo je povećano zanimanje posljednjih godina. Zbog velike raznolikosti liganda, prijelazna receptorska potencijalna superobitelj ionskih kanala (TRP kanali) predstavlja vrlo zanimljivu klasu potencijalnih ciljnih struktura.

Superobitelj TRP kanala sisavaca uključuje šest srodnih obitelji proteina, naime ankirin (TRPA), kanonik (TRPC), melastatin (TRPM), mukolipin (TRPML), policistin (TRPP) i vaniloid (TRPV) obitelj, od kojih sve tipično dijele šest transmembranskih segmenata koji se okupljaju kao tetrameri da tvore pore propusne za katione s različitom kationskom selektivnošću.[1] TRPV1 kanal je možda daleko najintenzivnije istraženi član TRP superobitelji. TRPV1 je u početku identificiran kao receptor za kapsaicin, ljutu komponentu čili papričica.[2] Kasnije se također pokazalo da ljuti sastojci iz đumbira, gingeroli, aktiviraju TRPV1.[3]

Biološka uloga TRPV1 u tipovima ne-neuronskih stanica još uvijek je pod opsežnim istraživanjem, ali dostupni rezultati impliciraju funkcije daleko iznad osjetilne i toplinske percepcije. Na primjer, 12-tjedna intervencija s dnevnom dozom od 0,15 mg agonista TRPV1 nonivamida, strukturnog analoga kapsaicina, spriječila je dijetom inducirano povećanje tjelesne masne mase i povećala razinu serotonina u plazmi kod zdravih subjekata s prekomjernom težinom.[4]

U 3T3-L1 adipocitima aktivacija TRPV1 nenivamidom smanjila je nakupljanje lipida tijekom diferencijacije i sazrijevanja potiskivanjem ekspresije PPAR𝛾.[5] U makrofagima, kapsaicin i nonivamid oslabili su LPS-om izazvano otpuštanje proupalnih citokina poput IL6, CXCL8 i TNF-alfa, na način ovisan o TRPV1.[6] Ipak, posebne funkcije TRPV1 u leukocitima ljudske krvi ostaju nejasne. U ljudskim NK stanicama, 10 i 50 µM kapsaicina izazvalo je porast intracelularnih koncentracija Ca2+, što ukazuje na funkcionalni TRPV1 kanal.[7]

Međutim, prigušene efektorske funkcije NK stanica kao što su citotoksična degranulacija i izlučivanje citokina, izazvane prethodnim tretmanom stanica kapsaicinom tijekom 1 sata u rasponu koncentracija od 10-100 µM, bile su u velikoj mjeri neovisne o TRPV1.[7] U T stanicama je dokumentirano da je TRPV1 uključen u procese signalizacije T staničnih receptora, proliferaciju i diferencijaciju T stanica, kao i proizvodnju citokina.[8] Prethodni rad naše grupe također je pokazao funkcionalnu ekspresiju TRPV1 u ljudskim primarnim T stanicama.[9] Nadalje, analize doze i odgovora u koncentracijama u rasponu od 0,03 do 300 μmol L-1 otkrile su da [6]-gingerol inhibira izlučivanje citokina primarnim ljudskim leukocitima s IC50 vrijednošću od 82,2 μmol L-1.

Međutim, kvantifikacija [6]-gingerola u uzorcima plazme zdravih ispitanika otkrila je srednju maksimalnu koncentraciju u plazmi od samo 42,0 ± 16,3 nmol L-1 nakon uzimanja 1 L čaja od đumbira. Budući da ove [6]-koncentracije gingerola nisu imale značajan utjecaj na izlučivanje citokina u prethodnim studijama, [9] nejasno je je li prehrambena relevantna koncentracija od 50 nmol L-1, koja se postiže u krvnoj plazmi nakon konzumacije 1 L čaja od đumbira, dovoljna za modulaciju staničnih imunoloških odgovora u drugim ljudskim primarnim leukocitima.

Za ljudske neutrofile znanje o funkcionalnoj ulozi TRPV1 je ograničeno. Dok su Köse i Nazıroglu˘ [10] pokazali fluks Ca2+- u neutrofilima kao odgovor na 10 µM kapsaicina koji treba smanjiti antagonistom TRPV1 kapsazepinom, drugi rezultati nisu pokazali da kapsaicin inducira priljev Ca2+ kada je testiran u rasponu koncentracija od 1-100 µM, unatoč detektabilnom TRPV1 Ekspresija RNA.[11]

Neutrofili su najzastupljeniji leukociti u ljudskoj krvi, čineći 60–70 % svih cirkulirajućih bijelih krvnih stanica. One su prve imunološke stanice koje se regrutiraju na mjesta infekcije; stoga se često nazivaju prvom crtom obrane.[12] Regrutiranje neutrofila pokreću, između ostalog, bakterijski ili mitohondrijski peptid N-formilmetionin-leucil-fenilalanin (fMLF) ili kemokini kao što je CXCL8 (IL-8).[13]

Obrambeni mehanizmi neutrofila uključuju fagocitozu, [14] otpuštanje antimikrobnih enzima putem degranulacije, [15] stvaranje reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) [16] i stvaranje izvanstaničnih zamki neutrofila.[17] Osim ovih izravnih obrambenih mehanizama, neutrofili dodatno pridonose kasnijim imunološkim odgovorima putem otpuštanja raznih citokina i kemokina.[18] Također, neutrofili mogu proći proces pripreme koji im omogućuje snažniji odgovor na kasniju potpunu aktivaciju.[16b]

Posljednjih godina sve je više dokaza da sastojci iz hrane i/ili ljekovitog bilja mogu modificirati jedan ili više spomenutih obrambenih odgovora ljudskih neutrofila. Ove modifikacije uključuju povećanu fagocitotsku aktivnost[19] i stvaranje ROS-a, [20] povećanu kemotaksiju prema fMLF-u, [21] i stvaranje izvanstaničnih zamki neutrofila.[20] Međutim, aktivni spoj(evi) nije identificiran. Sastojci iz Ferule akitschkensis (𝛽-pinen, sabinene, 𝛾-terpinen, geranylacetone i izobornilacetat) desenzibilizirali su neutrofile na fMLF- i CXCL8-inducirani Ca2+ influks i inhibirali fMLF-induciranu kemotaksiju, pri čemu učinci izazvani geranylacetonom posredovani su putem TRPV1.[22]

Na temelju dostupnih podataka, pretpostavili smo da ligandom inducirana aktivacija TRPV1 pomoću [6]-gingerola može utjecati na opće funkcije neutrofila, bilo izravno ili putem pojačavanja njihovih odgovora na aktivirajuće podražaje. U okviru ove hipoteze, posebno smo željeli razjasniti je li verificirana nutritivno relevantna koncentracija dovoljna za modulaciju staničnih imunoloških odgovora u ljudskim primarnim neutrofilima kao dijelu populacije leukocita. '

Nadalje, nastojali smo usporediti razine ekspresije RNA svih članova superobitelji TRP sisavaca u pet najistaknutijih tipova stanica u ljudskoj krvi kako bismo dobili kvalitativno i kvantitativno sveobuhvatan pregled ekspresije TRP kanala u ljudskim leukocitima.

2. Rezultati

2.1. Brojnost i relativne razine transkripta TRP kanala u ljudskim leukocitima

Kako bi se procijenila ekspresija RNA TRP kanala u krvnim leukocitima, pet najistaknutijih tipova stanica leukocita izolirano je iz krvi zdravih darivatelja, a ekspresija RNA TRP kanala analizirana je kvantitativnom RT-PCR (Slika 1).

Specifični transkripti TRPV-a kao i TRPM obitelji otkriveni su s visokim učestalostima od 75-100% u svim analiziranim tipovima stanica. Prosječna ukupna učestalost uzimajući u obzir sve vrste stanica bila je 96% za obitelj TRPV i 98% za obitelj TRPM. Transkripti specifični za TRPC bili su mnogo manje zastupljeni, u rasponu od 0% u monocitima, NK stanicama, T stanicama i B stanicama do 100% u NK stanicama i T stanicama s ukupnom prosječnom učestalošću od samo 53% (Slika 1A). Transkript specifičan za TRPC5 detektiran je samo u neutrofilima, s učestalošću od 70%.

Također, transkript specifičan za TRPA1 općenito je otkrio prilično nisku zastupljenost u tipovima stanica analiziranih s učestalošću od 100% u neutrofilima, 25% u monocitima, 80% u NK stanicama, 100% u T stanicama i 60% u B stanicama. Isto tako, transkript specifičan za TRPML3 pokazao je nisku učestalost u neutrofilima (50%), monocitima (25%), NK stanicama (40%) i B stanicama (20%), ali učestalost od 100% u T stanicama. Transkript specifičan za TRPV1 detektiran je u svim tipovima stanica, pokazujući učestalost od 100% u monocitima, NK stanicama i T stanicama, te učestalost od 90% u neutrofilima i 80% u B stanicama.

Što se tiče relativne ekspresije RNA, u usporedbi s odgovarajućim frekvencijama, TRP kanali su otkrili obrazac ekspresije više specifičan za stanični tip, što je vidljivo usporedbom odgovarajućih Δct vrijednosti u različitim analiziranim tipovima stanica (Slika 1B). Na primjer, TRPP3 je detektiran s učestalošću od 100% u svim tipovima stanica, ali je jasno otkrio najveću razinu ekspresije u monocitima.

Nasuprot tome, kanal TRPV2 otkriven je u svim ispitanim tipovima stanica, s relativno visokom razinom ekspresije RNA kao i visokom učestalošću. Isto tako, razine transkripta TRPV1 bile su slične u svim ispitanim vrstama stanica (Slika 1B).

2.2. TRPV1 površinska ekspresija na neutrofilima

Trenutno znanje o funkciji TRPV1 u ljudskim neutrofilima još uvijek je nejasno. Kako bismo dalje istražili uloge TRPV1 u ljudskim neutrofilima, zatim smo istražili eksprimira li se kanal TRPV1 na površini primarnih ljudskih neutrofila pomoću protočne citometrije živih stanica (Slika 2).

Izolirani neutrofili su obojeni na CD15 kao površinski marker za neutrofile (Slika 2A, B) i istovremeno su obojeni antitijelom podignutim protiv epitopa u prvoj izvanstaničnoj petlji proteina TRPV1 (Slika 2B) ili odgovarajućom kontrolom izotipa, pri čemu potonja služi kao surogat za mjerenje nespecifičnog vezanja (Slika 2A). Unutar populacije CD15+, analiziran je intenzitet fluorescencije za FITC. Bojanje neutrofila protutijelom TRPV1 dovelo je do jasno prepoznatljivog signala fluorescencije u usporedbi s kontrolom izotipa, čime je potvrđena površinska ekspresija TRPV1 u primarnim ljudskim neutrofilima (Slika 2C). Analizom neutrofila četiri pojedinačna donora otkrivena je usporediva površinska ekspresija TRPV1 (Slika 2D).

2.3. [6]-Gingerolom izazvano povećanje intracelularnog Ca2+

Budući da će ligandom inducirana aktivacija TRPV1 rezultirati priljevom Ca2+, [23] intracelularne Ca2+ koncentracije neutrofila određene su pomoću Ca2+-osjetljive boje Fura-2. Na temelju naših prethodnih otkrića [9] odabrana je koncentracija od 50 nM dobro poznatog TRPV1 liganda [6]-gingerola i vrijeme inkubacije od 2 sata. Analize su pokazale da je inkubacija neutrofila s 50 nM [6]-gingerola rezultirala povećanjem unutarstaničnih koncentracija Ca2+ koje su u prosjeku iznosile 18,4% ± 1,0% maksimalne vrijednosti, utvrđene primjenom 1 μM ionofora ionomicina. Povećanje izazvano DMSO bilo je 4,7% ± 1,2% (Slika 3).

2.4. Utjecaj [6]-Gingerola na ekspresiju TRPV1

Zatim smo ciljali na analizu utjecaja stimulacije TRPV1 pomoću [6]-gingerola na ekspresiju TRPV1 na razini transkripta putem q-RTPCR kao i na razini površinskih proteina putem bojenja živih stanica. U tu svrhu, ljudski neutrofili su inkubirani s 50 nM [6]-gingerola tijekom 2 sata i kvantificirane su odgovarajuće razine ekspresije.

Ova dvosatna inkubacija nije utjecala niti na transkript TRPV1 niti na razine proteina (Slika 4), a također se nije promijenila, osim za IL6, IL17A, IL24, C5 i GDF5, ekspresiju RNK uobičajenih istraživanih gena za citokine i kemokine (Slika S1, Tablica S2, Popratne informacije).

2.5. Utjecaj [6]-Gingerola na ekspresiju površinskih markera neutrofila

1. Uvod

Identificiranje sastojaka hrane s imunomodulatornim svojstvima zajedno s njihovim odgovarajućim molekularnim ciljevima privuklo je povećano zanimanje posljednjih godina. Zbog velike raznolikosti liganda, prijelazna receptorska potencijalna superobitelj ionskih kanala (TRP kanali) predstavlja vrlo zanimljivu klasu potencijalnih ciljnih struktura.

Superobitelj TRP kanala sisavaca uključuje šest srodnih obitelji proteina, naime ankirin (TRPA), kanonik (TRPC), melastatin (TRPM), mukolipin (TRPML), policistin (TRPP) i vaniloid (TRPV) obitelj, od kojih sve tipično dijele šest transmembranskih segmenata koji se okupljaju kao tetrameri da tvore pore propusne za katione s različitom kationskom selektivnošću.[1] TRPV1 kanal je možda daleko najintenzivnije istraženi član TRP superobitelji. TRPV1 je u početku identificiran kao receptor za kapsaicin, ljutu komponentu čili papričica.[2] Kasnije se također pokazalo da ljuti sastojci iz đumbira, gingeroli, aktiviraju TRPV1.[3]

Biološka uloga TRPV1 u tipovima ne-neuronskih stanica još uvijek je pod opsežnim istraživanjem, ali dostupni rezultati impliciraju funkcije daleko iznad osjetilne i toplinske percepcije. Na primjer, 12-tjedna intervencija s dnevnom dozom od 0,15 mg agonista TRPV1 nonivamida, strukturnog analoga kapsaicina, spriječila je dijetom inducirano povećanje tjelesne masne mase i povećala razinu serotonina u plazmi kod zdravih subjekata s prekomjernom težinom.[4]

U 3T3-L1 adipocitima aktivacija TRPV1 nenivamidom smanjila je nakupljanje lipida tijekom diferencijacije i sazrijevanja potiskivanjem ekspresije PPAR𝛾.[5] U makrofagima, kapsaicin i nonivamid oslabili su LPS-om izazvano otpuštanje proupalnih citokina poput IL6, CXCL8 i TNF-alfa, na način ovisan o TRPV1.[6] Ipak, posebne funkcije TRPV1 u leukocitima ljudske krvi ostaju nejasne. U ljudskim NK stanicama, 10 i 50 µM kapsaicina izazvalo je porast intracelularnih koncentracija Ca2+, što ukazuje na funkcionalni TRPV1 kanal.[7]

Međutim, prigušene efektorske funkcije NK stanica kao što su citotoksična degranulacija i izlučivanje citokina, izazvane prethodnim tretmanom stanica kapsaicinom tijekom 1 sata u rasponu koncentracija od 10-100 µM, bile su u velikoj mjeri neovisne o TRPV1.[7] U T stanicama je dokumentirano da je TRPV1 uključen u procese signalizacije T staničnih receptora, proliferaciju i diferencijaciju T stanica, kao i proizvodnju citokina.[8] Prethodni rad naše grupe također je pokazao funkcionalnu ekspresiju TRPV1 u ljudskim primarnim T stanicama.[9] Nadalje, analize doze i odgovora u koncentracijama u rasponu od 0,03 do 300 μmol L-1 otkrile su da [6]-gingerol inhibira izlučivanje citokina primarnim ljudskim leukocitima s IC50 vrijednošću od 82,2 μmol L-1.

Međutim, kvantifikacija [6]-gingerola u uzorcima plazme zdravih ispitanika otkrila je srednju maksimalnu koncentraciju u plazmi od samo 42,0 ± 16,3 nmol L-1 nakon uzimanja 1 L čaja od đumbira. Budući da ove [6]-koncentracije gingerola nisu imale značajan utjecaj na izlučivanje citokina u prethodnim studijama, [9] nejasno je je li prehrambena relevantna koncentracija od 50 nmol L-1, koja se postiže u krvnoj plazmi nakon konzumacije 1 L čaja od đumbira, dovoljna za modulaciju staničnih imunoloških odgovora u drugim ljudskim primarnim leukocitima.

Za ljudske neutrofile znanje o funkcionalnoj ulozi TRPV1 je ograničeno. Dok su Köse i Nazıroglu˘ [10] pokazali fluks Ca2+- u neutrofilima kao odgovor na 10 µM kapsaicina koji treba smanjiti antagonistom TRPV1 kapsazepinom, drugi rezultati nisu pokazali da kapsaicin inducira priljev Ca2+ kada je testiran u rasponu koncentracija od 1-100 µM, unatoč detektabilnom TRPV1 Ekspresija RNA.[11]

Neutrofili su najzastupljeniji leukociti u ljudskoj krvi, čineći 60–70 % svih cirkulirajućih bijelih krvnih stanica. One su prve imunološke stanice koje se regrutiraju na mjesta infekcije; stoga se često nazivaju prvom crtom obrane.[12] Regrutiranje neutrofila pokreću, između ostalog, bakterijski ili mitohondrijski peptid N-formilmetionin-leucil-fenilalanin (fMLF) ili kemokini kao što je CXCL8 (IL-8).[13]

Obrambeni mehanizmi neutrofila uključuju fagocitozu, [14] otpuštanje antimikrobnih enzima putem degranulacije, [15] stvaranje reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) [16] i stvaranje izvanstaničnih zamki neutrofila.[17] Osim ovih izravnih obrambenih mehanizama, neutrofili dodatno pridonose kasnijim imunološkim odgovorima putem otpuštanja raznih citokina i kemokina.[18] Također, neutrofili mogu proći proces pripreme koji im omogućuje snažniji odgovor na kasniju potpunu aktivaciju.[16b]

Posljednjih godina sve je više dokaza da sastojci iz hrane i/ili ljekovitog bilja mogu modificirati jedan ili više spomenutih obrambenih odgovora ljudskih neutrofila. Ove modifikacije uključuju povećanu fagocitotsku aktivnost[19] i stvaranje ROS-a, [20] povećanu kemotaksiju prema fMLF-u, [21] i stvaranje izvanstaničnih zamki neutrofila.[20] Međutim, aktivni spoj(evi) nije identificiran. Sastojci iz Ferule akitschkensis (𝛽-pinen, sabinene, 𝛾-terpinen, geranylacetone i izobornilacetat) desenzibilizirali su neutrofile na fMLF- i CXCL8-inducirani Ca2+ influks i inhibirali fMLF-induciranu kemotaksiju, pri čemu učinci izazvani geranylacetonom posredovani su putem TRPV1.[22]

Na temelju dostupnih podataka, pretpostavili smo da ligandom inducirana aktivacija TRPV1 pomoću [6]-gingerola može utjecati na opće funkcije neutrofila, bilo izravno ili putem pojačavanja njihovih odgovora na aktivirajuće podražaje. U okviru ove hipoteze, posebno smo željeli razjasniti je li verificirana nutritivno relevantna koncentracija dovoljna za modulaciju staničnih imunoloških odgovora u ljudskim primarnim neutrofilima kao dijelu populacije leukocita. '

Nadalje, nastojali smo usporediti razine ekspresije RNA svih članova superobitelji TRP sisavaca u pet najistaknutijih tipova stanica u ljudskoj krvi kako bismo dobili kvalitativno i kvantitativno sveobuhvatan pregled ekspresije TRP kanala u ljudskim leukocitima.

2. Rezultati

2.1. Brojnost i relativne razine transkripta TRP kanala u ljudskim leukocitima

Kako bi se procijenila ekspresija RNA TRP kanala u krvnim leukocitima, pet najistaknutijih tipova stanica leukocita izolirano je iz krvi zdravih darivatelja, a ekspresija RNA TRP kanala analizirana je kvantitativnom RT-PCR (Slika 1).

Specifični transkripti TRPV-a kao i TRPM obitelji otkriveni su s visokim učestalostima od 75-100% u svim analiziranim tipovima stanica. Prosječna ukupna učestalost uzimajući u obzir sve vrste stanica bila je 96% za obitelj TRPV i 98% za obitelj TRPM. Transkripti specifični za TRPC bili su mnogo manje zastupljeni, u rasponu od 0% u monocitima, NK stanicama, T stanicama i B stanicama do 100% u NK stanicama i T stanicama s ukupnom prosječnom učestalošću od samo 53% (Slika 1A). Transkript specifičan za TRPC5 detektiran je samo u neutrofilima, s učestalošću od 70%.

Također, transkript specifičan za TRPA1 općenito je otkrio prilično nisku zastupljenost u tipovima stanica analiziranih s učestalošću od 100% u neutrofilima, 25% u monocitima, 80% u NK stanicama, 100% u T stanicama i 60% u B stanicama. Isto tako, transkript specifičan za TRPML3 pokazao je nisku učestalost u neutrofilima (50%), monocitima (25%), NK stanicama (40%) i B stanicama (20%), ali učestalost od 100% u T stanicama. Transkript specifičan za TRPV1 detektiran je u svim tipovima stanica, pokazujući učestalost od 100% u monocitima, NK stanicama i T stanicama, te učestalost od 90% u neutrofilima i 80% u B stanicama.

Što se tiče relativne ekspresije RNA, u usporedbi s odgovarajućim frekvencijama, TRP kanali su otkrili obrazac ekspresije više specifičan za stanični tip, što je vidljivo usporedbom odgovarajućih Δct vrijednosti u različitim analiziranim tipovima stanica (Slika 1B). Na primjer, TRPP3 je detektiran s učestalošću od 100% u svim tipovima stanica, ali je jasno otkrio najveću razinu ekspresije u monocitima.

Nasuprot tome, kanal TRPV2 otkriven je u svim ispitanim tipovima stanica, s relativno visokom razinom ekspresije RNA kao i visokom učestalošću. Isto tako, razine transkripta TRPV1 bile su slične u svim ispitanim vrstama stanica (Slika 1B).

2.2. TRPV1 površinska ekspresija na neutrofilima

Trenutno znanje o funkciji TRPV1 u ljudskim neutrofilima još uvijek je nejasno. Kako bismo dalje istražili uloge TRPV1 u ljudskim neutrofilima, zatim smo istražili eksprimira li se kanal TRPV1 na površini primarnih ljudskih neutrofila pomoću protočne citometrije živih stanica (Slika 2).

Izolirani neutrofili su obojeni na CD15 kao površinski marker za neutrofile (Slika 2A, B) i istovremeno su obojeni antitijelom podignutim protiv epitopa u prvoj izvanstaničnoj petlji proteina TRPV1 (Slika 2B) ili odgovarajućom kontrolom izotipa, pri čemu potonja služi kao surogat za mjerenje nespecifičnog vezanja (Slika 2A). Unutar populacije CD15+, analiziran je intenzitet fluorescencije za FITC. Bojanje neutrofila protutijelom TRPV1 dovelo je do jasno prepoznatljivog signala fluorescencije u usporedbi s kontrolom izotipa, čime je potvrđena površinska ekspresija TRPV1 u primarnim ljudskim neutrofilima (Slika 2C). Analizom neutrofila četiri pojedinačna donora otkrivena je usporediva površinska ekspresija TRPV1 (Slika 2D).

2.3. [6]-Gingerolom izazvano povećanje intracelularnog Ca2+

Budući da će ligandom inducirana aktivacija TRPV1 rezultirati priljevom Ca2+, [23] intracelularne Ca2+ koncentracije neutrofila određene su pomoću Ca2+-osjetljive boje Fura-2. Na temelju naših prethodnih otkrića [9] odabrana je koncentracija od 50 nM dobro poznatog TRPV1 liganda [6]-gingerola i vrijeme inkubacije od 2 sata. Analize su pokazale da je inkubacija neutrofila s 50 nM [6]-gingerola rezultirala povećanjem unutarstaničnih koncentracija Ca2+ koje su u prosjeku iznosile 18,4% ± 1,0% maksimalne vrijednosti, utvrđene primjenom 1 μM ionofora ionomicina. Povećanje izazvano DMSO bilo je 4,7% ± 1,2% (Slika 3).

2.4. Utjecaj [6]-Gingerola na ekspresiju TRPV1

Zatim smo ciljali na analizu utjecaja stimulacije TRPV1 pomoću [6]-gingerola na ekspresiju TRPV1 na razini transkripta putem q-RTPCR kao i na razini površinskih proteina putem bojenja živih stanica. U tu svrhu, ljudski neutrofili su inkubirani s 50 nM [6]-gingerola tijekom 2 sata i kvantificirane su odgovarajuće razine ekspresije.

Ova dvosatna inkubacija nije utjecala niti na transkript TRPV1 niti na razine proteina (Slika 4), a također se nije promijenila, osim za IL6, IL17A, IL24, C5 i GDF5, ekspresiju RNK uobičajenih istraživanih gena za citokine i kemokine (Slika S1, Tablica S2, Popratne informacije).

2.5. Utjecaj [6]-Gingerola na ekspresiju površinskih markera neutrofila

Izrežite Jinkui Shenqi pilule na komade, točno izvažite približno 2,0 g uzorka i prenesite ga u začepljenu konusnu tikvicu. Dodati 25 mL 70% metanola, izvagati ukupnu masu i provesti ultrazvučnu ekstrakciju (300 W, 40 kHz) 35 minuta. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, nadoknadite izgubljenu težinu sa 70% metanolom i dobro protresite. Filtrirajte otopinu kroz mikroporoznu membranu od 0,45 μm kako biste dobili ispitnu otopinu.

 

Provedeno je skeniranje pune valne duljine (190–400 nm) kako bi se odabrala valna duljina detekcije. Iako morronisid i loganin imaju maksimalnu apsorpciju na 230-240 nm, ova valna duljina pati od visokog osnovnog šuma. Valna duljina od 254 nm osigurava stabilan odziv i niske pozadinske smetnje. Paeonol, cimetna kiselina, akteozid i 7-hidroksikumarin proizvode stabilnu ultraljubičastu apsorpciju na 254 nm. Stoga je 254 nm odabrano kao jedinstvena valna duljina detekcije za višekomponentnu sinkronu analizu.

 

Među svim prirodnim biljnim sirovinama,Cistanche tubulosa (Cistanche koji živi u pustinji)ističe se kao biljka snajviši sadržaj akteozidaglobalno. Kao ključni feniletanoidni glikozid, akteozid je poznat po protuupalnim, antioksidativnim, neuroprotekcijskim i imunološkim regulacijama. Naša tvornica specijalizirana je za ekstrakt Cistanche tubulosa visoke čistoće, koji sadrži daleko više razine akteozida i drugih aktivnih sastojaka od uobičajenih biljnih materijala, što ga čini idealnom sirovinom za razvoj vrhunskih dodataka prehrani, funkcionalne hrane, biljnih napitaka i proizvoda za njegu kože za europska i američka tržišta.

 

 

Acteoside, prepoznatljiva komponenta našeg ekstrakta Cistanche tubulosa, pruža višestruke temeljne prednosti koje odgovaraju zdravstvenim zahtjevima europskih i američkih potrošača: protiv upale, jačanje imuniteta, protiv hipoksije, hvatanje slobodnih radikala, popravak DNK i zaštita jetre. U kombinaciji s ehinakozidom (antioksidans, neuroprotekcija, kardiovaskularna zaštita) i polisaharidima (imunosna regulacija), naš ekstrakt integrira sve osnovne učinkovitosti vrhunskih biljnih sastojaka navedenih gore, uključujućiprotuupalno, antibakterijsko, antioksidativno, imunološko reguliranje i kardiovaskularna zaštita.