Sažetak

Uvod: Propolis je smolasta prirodna tvar koju pčele sakupljaju iz pupova i izlučevina raznih stabala i biljaka; Opće je prihvaćeno da sastav propolisa ovisi o fitogeografskim karakteristikama mjesta sakupljanja.

Glikozid cistanhe također može povećati aktivnost SOD-a u tkivima srca i jetre, te značajno smanjiti sadržaj lipofuscina i MDA u svakom tkivu, učinkovito čisteći različite reaktivne kisikove radikale (OH-, H₂O₂, itd.) i štiteći od oštećenja DNA uzrokovanog pomoću OH-radikala. Cistanche feniletanoidni glikozidi imaju jaku sposobnost hvatanja slobodnih radikala, veću reducirajuću sposobnost od vitamina C, poboljšavaju aktivnost SOD u suspenziji spermija, smanjuju sadržaj MDA i imaju određeni zaštitni učinak na funkciju membrane spermija. Cistanche polisaharidi mogu pojačati aktivnost SOD i GSH-Px u eritrocitima i tkivu pluća eksperimentalno starih miševa uzrokovanih D-galaktozom, kao i smanjiti sadržaj MDA i kolagena u plućima i plazmi, te povećati sadržaj elastina, imaju dobar učinak čišćenja na DPPH, produžiti vrijeme hipoksije u starim miševima, poboljšati aktivnost SOD u serumu i odgoditi fiziološku degeneraciju pluća u eksperimentalno starim miševima Uz stančnu morfološke degeneraciju, pokusi su pokazali da Cistanche ima dobru antioksidacijsku sposobnost i ima potencijal da bude lijek za prevenciju i liječenje bolesti starenja kože. U isto vrijeme, ehinakozid u Cistancheu ima značajnu sposobnost hvatanja slobodnih radikala DPPH i može hvatati reaktivne vrste kisika, spriječiti degradaciju kolagena izazvanu slobodnim radikalima, a također ima dobar učinak popravka na oštećenje aniona slobodnih radikala timina.

Kliknite na dodatak Cistanche Tubulosa

【Za više informacija: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Ciljevi: Ovo je istraživanje imalo za cilj odrediti fitokemijski sastav etanolnih ekstrakata iz osam serija propolisa prikupljenih u različitim regijama Benina (sjever, središte i jug) i Konga u Africi.

Materijal i metode:Karakterizacija uzoraka propolisa provedena je korištenjem različitih kromatografskih metoda s crticom u kombinaciji s dereplikacijom nuklearne magnetske rezonancije ugljika-13 (13C NMR) pomoću softvera MixONat. Njihova antioksidacijska aktivnost ili aktivnost krajnjeg produkta glikacije protiv uznapredovale glikacije (anti-AGE) zatim je procijenjena korištenjem testova difenilpikrilhidrazila i goveđeg serumskog albumina.

Rezultati: Kromatografske analize u kombinaciji s 13C NMR dereplikacijom pokazale su da dva uzorka iz središta Benina pokazuju, osim ogromne količine pentacikličkih triterpena, metoksilirane stilbenoide ili fenantrene, odgovorne za antioksidacijsku aktivnost ekstrakta prvog. Među njima, kombretastatin bi mogao biti citotoksičan. Za drugu, prenilirani flavanoni poznati u propolisu tipa Macaranga odgovorni su za njihovu značajnu aktivnost protiv starenja. Uzorak iz Konga sastojao se od mnogih derivata triterpena koji pripadaju vrsti Mangifera indica.

Zaključak: Stoga se propolis iz središta Benina čini posebno zanimljivim, zbog svojih antioksidativnih i anti-AGE svojstava. Ipak, kako je standardizacija propolisa teška u tropskim zonama zbog njegove velike kemoraznolikosti, potrebna je sustavna fitokemijska analiza prije promicanja upotrebe propolisa u prehrambenim i zdravstvenim proizvodima u Africi.

KLJUČNE RIJEČI

13C NMR dereplikacija, metoksilirani stilbenoidi ili fenantreni, pentaciklički triterpeni, prenilirani flavanoni, propolis

1. UVOD

Propolis je prirodna smolasta tvar koju pčele skupljaju iz pupova i izlučevina raznih stabala i biljaka, pomiješana s pčelinjim voskom i enzimima sline.1 Pčele ga koriste za zaštitu ulaza od uljeza, začepljenje rupa, glačanje unutarnjih zidova, mumificiranje mrtvih životinja (mali kukci) unutar košnice, te uravnotežiti ekstremnu vlažnost ili sušne uvjete.2,3 Propolis je naširoko korišten u narodnoj medicini od davnina zbog svog širokog spektra terapeutskih svojstava.4 Propolis se općenito sastoji od smole (50 posto) , vosak (30 posto), ulja (10 posto), pelud (5 posto) i dodatne fenolne spojeve kao što su flavonoidi.5,6 Poznato je da je kemijski sastav propolisa složen i varira ovisno o biljnoj vrsti koja raste oko košnice. , s kojeg pčele skupljaju eksudate.7 Prihvaćeno je da se tijekom eksploatacija propolisa utječe na kemijski sastav propolisa.8,9 Postoje različite vrste propolisa, ovisno o geografskom području proizvodnje, botaničkom izvoru i kemijskom sastavu. Najčešće vrste propolisa su umjereni, brezov, tropski, mediteranski i pacifički.10 Propolis iz umjerenih klimatskih zona, kao što su Europa, Sjeverna Amerika ili netropska područja Azije, dolazi uglavnom iz izlučevina pupova vrste Populus ( Salicaceae) i stoga je bogata flavonoidima i fenolnim kiselinama i njihovim esterima; međutim, tropski propolis, koji potječe iz regija u kojima ne rastu ni topola ni breza, bogat je preniliranim derivatima p-kumarinske kiseline, benzofenona ili terpenoida.11 Pacifički propolis, obično bogat preniliranim flavanonima, još je jedna važna vrsta propolisa koja se nalazi u Tajvanu , Japanu i Salomonskim otocima, a propolis breze nalazi se posebno u Rusiji.12 Proučavanje propolisa iz tropske Azije dovelo je do otkrića Macaranga denarius L. i Mangifera indica L. kao biljnih izvora indonezijskog propolisa.13 Na s druge strane, crnogorične vrste iz obitelji Cupressaceae glavni su botanički izvor propolisa u mediteranskim regijama.14 Kemijske analize otkrile su da propolis sadrži više od 300 različitih prirodnih proizvoda (NP), uključujući derivate fenolne kiseline, kumarine, flavonoide, seskviterpene, diterpene, triterpene, steroide, lignane ili prenilirane benzofenone.15 Biološki učinci propolisa opisani su uglavnom ne samo zbog antioksidansa,16-18 protiv AGE-a (tj. inhibicije stvaranja uznapredovalog krajnjeg proizvoda glikacije [AGE]),19 protiv -upalne,20 i antitumorske učinke,21-23 ali također i njihovo antibakterijsko,24-26 antigljivično,15 antivirusno,27 i antiparazitsko28 djelovanje. Poznato je da propolis također stimulira proizvodnju protutijela, što ukazuje na njegovu potencijalnu upotrebu kao adjuvansa u cjepivima.29 Sve veća uporaba ove prirodne tvari raznolikog sastava i stoga različitih bioloških aktivnosti u farmaceutskoj, kozmetičkoj i prehrambenoj industriji izaziva poseban interes u znanstvenim istraživanjima, posebice kada je u pitanju definiranje njegovog kemijskog sastava. Većina studija provedena je na uzorcima iz Europe19,30–33 i Latinske Amerike, točnije Brazila,20,23,34–36 dok je nekoliko studija provedeno u Africi.37–41 Informacije o beninskom i kongoanskom42 propolisu i dalje su rijetke.

Stoga je ova studija imala za cilj karakterizirati glavne spojeve iz uzoraka propolisa prikupljenih u raznim fitogeografskim zonama Benina i Konga (Afrika) korištenjem dereplikacije 13C nuklearne magnetske rezonancije (NMR) sa softverom MixONat.43,44 Preliminarna studija korištenjem baze podataka (DB) koja sadrži NP prethodno prijavljeni iz propolisa zajedno sa svojim 13C predviđenim kemijskim pomacima (δC) nisu dali nikakve upotrebljive podatke u usporedbi sa zadovoljavajućim rezultatima koji se obično dobivaju s biljnim ekstraktima.43-45 To se može objasniti kemijskim sastavom propolisa, koji je jako ovisan na lokalnu floru, što onemogućuje konstruiranje kemotaksonomske baze podataka. Stoga smo, kako bismo dešifrirali glavne spojeve iz beninskog i kongoanskog propolisa, u ovom radu proveli tekućinsku kromatografiju visoke učinkovitosti spojenu s ultraljubičastom i masenom spektrometrijom za detekciju raspršenog svjetla (HPLC-UV-ELSD-MS) i plinsku kromatografiju spojenu s masenom spektrometrijom ( GC-MS) analize sirovih ekstrakata propolisa kako bi se identificirale njihove glavne strukturne značajke i izgradile odgovarajuće baze podataka NP-ova prikladne za softver MixONat.46 Zatim, nakon grubog frakcioniranja uzoraka propolisa odabranih prema njihovom kemijskom profilu, dereplikacija temeljena na 13C NMR-u je omogućila identifikacija glavnih NP bez daljnjeg pročišćavanja. Također su provedeni antioksidativni i anti-AGE testovi.

2. EKSPERIMENTALNI POSTUPCI

2.1 Kemikalije

1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), Folin–Ciocalteu reagens, mravlja kiselina i galna kiselina, sve analitičke čistoće, kupljene su od Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, Francuska). 6-Hidroksi-2,- 5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksilna kiselina (Trolox®) i 50 - kafeoilkininska kiselina (klorogena kiselina) bile su dobiven od Acros Organics (Geel, Belgija).

2.2 Uzorci propolisa

Osam beninskih uzoraka propolisa prikupljeno je struganjem iz košnica u tri fitogeografske zone (tablica 1 i slika SI-1). Uzorak kongoanskog propolisa prikupljen je u umjetnoj šumi akacije na visoravni Bateke u središtu Republike Kongo (Tablica 1).

2.3 Ekstrakcija propolisa

Etanolni ekstrakti propolisa (EEP) prvotno su pripremljeni korištenjem sljedećeg ekstrakcijskog protokola.19 Sirovi propolis prvo je homogeno usitnjen u prah u prisutnosti tekućeg dušika. Za sve uzorke 1 g propolisa u prahu je maceriran u 20 ml 95 postotnog EtOH. Nakon miješanja 2 sata na sobnoj temperaturi, smjesa je filtrirana pomoću ljevkastog filtra od sinteriranog stakla (veličina pora 16–40 μm). Ostatak je ponovno ekstrahiran dva puta korištenjem istih koraka. Zatim su tri sakupljena filtrata držana na 18 C preko noći, filtrirana da bi se uklonili voskovi i isparena pod sniženim tlakom (40 C, 10 bara) da se dobiju EEP-ovi.

Količine od 8.0 g propolis praha BC1 (1) i BC2 (2) ili 10,3 g CG (3) ponovno su ekstrahirane s EtOH 95 posto (UAE, 4 80 ml, 15 min) za daljnje flash kromatografija.

2.4 Određivanje ukupnog sadržaja fenola

Ukupni sadržaj fenola određen je Folin–Ciocalteu kolorimetrijskom metodom kao što je prethodno opisano,19 i nedavno prilagođeno za izravnu upotrebu u mikropločicama. Ukratko, 10 ul svakog ekstrakta propolisa u MeOH (3,5 mg/ml za BC1, 5 mg/ml za BN2, BC2 i CG, 7,5 mg/ml za BN1, BS1a, BS1b i BS2, i 10 mg/ml za BS3) pomiješan je s 20 ul destilirane vode i 10 ul Folin-Ciocalteu reagensa u 96-mikroploči s jažicama. Nakon 3 minute, dodano je 120 ul destilirane vode i 40 ul 20 postotnog vodenog natrijevog karbonata. Apsorbancija je mjerena na TECAN® spektrofotometru za mikroploču (V6.5) na 760 nm nakon 30 minuta u mraku na sobnoj temperaturi. Slijepa proba pripremljena je na isti način upotrebom MeOH umjesto otopine ekstrakta, a galna kiselina korištena je za izračunavanje kalibracijske krivulje (0,04–0,328 mg/ml; y=2.7241x 0,0039; r2=0 .9982). Svaki uzorak je analiziran u tri primjerka. Ukupni sadržaj fenola izražen je u ekvivalentima galne kiseline (mg) po gramu ekstrakta (mg GAE/g).

2.5 Preliminarne kromatografske analize

2.5.1 Analitička TLC

Analitička tankoslojna kromatografija (TLC) provedena je na TLC Alugram Xtra SIL G/UV254 (Macherey-Nagel, Düren, Njemačka), koristeći smjesu cikloheksan: AcOEt kao eluant. Točke u kromatogramu vizualizirane su najprije pod UV svjetlom (254 nm), a zatim prskanjem reagensom vanilin-sumporna kiselina (2 ml koncentrirane sumporne kiseline u 98 ml 1:99 w/v otopine vanilin:95 posto etanola) i zagrijavanje kromatograma na 110 stupnjeva C tijekom 5 minuta.

2.5.2 GC-MS postupak

GC-MS analiza provedena je na nederivatiziranim uzorcima korištenjem plinskog kromatografa Shimadzu GCMS-QP2010 SE (Noisiel, Francuska) s ionizacijskim naponom od 70 eV (Electronic Udarac). Uzorci su pripremljeni u diklorometanu (DCM) u koncentraciji od 2 mg/ml za ekstrakte i 1 mg/ml za frakcije. Odvajanja su provedena upotrebom kolone Phenomenex ZB5 (30 m * 0,250 mm unutarnjeg promjera s 0,25 mm debljine filma; Phenomenex, Le Pecq, Francuska). Temperatura je programirana na sljedeći način: 180 stupnjeva C (3 minute), 180-280 stupnjeva C brzinom od 10 C/min i 280 stupnjeva C (27 minuta). Helij je korišten kao plin nosač pri protoku od 2,0 ml/min. Temperature injektora i detektora postavljene su na 250 stupnjeva C, odnosno 280 stupnjeva C. Metaboliti su identificirani usporedbom njihovih vremena zadržavanja (Rt), nominalne mase i/ili uzoraka fragmentacije s onima autentičnih uzoraka i/ili onih sadržanih u bibliotekama uzoraka fragmentacije opreme (NIST11, NIST11s i FFNSC2).

2.5.3 HPLC-DAD-ELSD postupak

Kromatografske analize provedene su korištenjem Shimadzu 2030C 3D tekućinskog kromatografa (Noisiel, Francuska) opremljenog nizom diodadetektor (DAD) i ELSD (Sedere®) s Lichrospher® stupcem 1{{10}}0 RP-18 (125 mm * 4 mm id, 5 μm, Merck, Darmstadt, Njemačka ) zaštićen Lichrocart® 4–4 zaštitnim uloškom (4 mm*4 mm id), koristeći brzinu protoka od 1 ml/min. Mobilna faza sastojala se od 0,1 posto mravlje kiseline u vodi (otapalo A) i metanola (otapalo B), a odvajanje je provedeno sljedećim linearnim gradijentom: 25-100 posto B (0-40 min), 100 posto (40-45 min). UV-vis spektri su snimljeni u rasponu od 190-600 nm, a kromatogrami su snimljeni na 254 i 280 nm. ELSD je zagrijavan na 30stupanjC, a na signal je primijenjeno pojačanje od 4. Uzorci su pripremljeni u koncentraciji od 10 mg/ml u MeOH i centrifugirani na 13,000 g 10 minuta prije ubrizgavanja (10 ul) kako bi se uklonili tragovi suspendiranih materijala.

2.5.4 HPLC-UV-MS postupak

HPLC-UV-MS analize provedene su pomoću modula za odvajanje 2795 Waters (Guyancourt, Francuska) opremljenog Dual λ 2487 Waters detektorom. Kolona, ​​mobilne faze i gradijent bili su isti kao što je gore opisano za HPLC-DAD-ELSD. Kromatogrami su dobiveni na 254 i 280 nm. Masene analize provedene su na Bruker (Bremen, Njemačka) elektrosprej ionizacija/kemijska ionizacija pri atmosferskom tlaku (ESI/APCI) Ion Trap Esquire 3000 plus u pozitivnim i negativnim modovima kako slijedi: kolizijski plin, He; amplituda energije sudara, 1,3 V; nebulizator i plin za sušenje, N2, 7 L/min; tlak plina raspršivača, 30 psi; suha temperatura, 340 C; brzina protoka, 1,0 ml/min; omjer dijeljenja otapala, 1:9; raspon skeniranja, m/z 100–1,000. Uzorci su pripremljeni u koncentraciji od 10 mg/ml u MeOH, centrifugirani na 13 000 g tijekom 10 minuta i filtrirani kroz politetrafluoroetilenski (PTFE) membranski filter štrcaljke od 0.45-μm prije ubrizgavanja (20 ul) kako bi se uklonili tragovi suspendiranih materijala.

2.6 EEP frakcioniranje flash kromatografijom

Najprije je 3,8 g BC1 (1), 3,5 g BC2 (2) ili 40 g CG (3) EEP-a otopljeno u minimalnom volumenu DCM-a i acetona i pomiješano sa silika gelom (silika gel: omjer ekstrakta 2:1). Za sve njih, otapalo je ostavljeno da ispari dok nije dobiven fini suhi prah. Za svaki EEP, zatim je provedeno frakcioniranje pomoću aparata CombiFlash Teledyne ISCO (Lincoln, NE, SAD) sa kolonom silikagela (Chromabond® Flash RS 4{{20}} SiOH, 4{{83} } g, Macherey-Nagel, Hoerdt, Francuska) pri brzini protoka od 25 ml/min s cikloheksanom (otapalo A) i etil acetatom (EtOAc) (otapalo B) koristeći sljedeći gradijent eluacije: (1) za BC1 EEP, 5 postotak B (0-10 min), 5-20 posto B (10-30 min), 20-30 posto B (30-60 min), 30-50 posto B (60-85 min) i 50-100 posto B (85–110 min); Sakupljeno je 160 epruveta od 20 ml i spojeno u 14 frakcija (BC1_F1 do BC1_F14) na temelju njihovih TLC kromatografskih profila (omjer cikloheksan:EtOAc, 90:10 do 50:50). ); (2) za BC2 EEP, 5 posto B (0-10 min), 5-10 posto B (10-20 min), 10-30 posto B (20-40 min), 30-40 posto B (40-55 min) i 40-100 posto B (55-70 min); 100 epruveta od 20 ml sakupljeno je i spojeno u 8 frakcija (BC2_F1 do BC2_F8) na temelju njihovih TLC kromatografskih profila (omjer cikloheksan:EtOAc, 90:10 do 60:40 ); (3) za CG EEP, 5 posto B (0-10 min), 5-10 posto B (10-30 min), 10-20 posto B (30-50 min), 20-40 posto B (50-70 min), 40-60 posto B (70-80 min) i 60-100 posto B (80-90 min); Sakupljeno je 135 epruveta od 20 ml i spojeno u 23 frakcije (CG_F1 do CG_F23) na temelju njihovih TLC kromatografskih profila (omjer cikloheksan:EtOAc, 80:20 do 60:40 ).

Dodatni korak frakcioniranja izveden je na frakciji BC{{0}}F7: 200 mg je otopljeno u minimalnom volumenu MeOH i pomiješano sa C18-silika gelom (C18-silika omjer gel: ekstrakt 2:1). Razdvajanje je provedeno na koloni C18 (Interchim® PF-C18HP, 4 g, Montluçon, Francuska) pri brzini protoka od 15 ml/min s vodom (otapalo A) i MeOH (otapalo B) koristeći sljedeći gradijent eluacije: 50– 70 posto B (0-30 min) i 70-100 posto B (30-40 min); Sakupljeno je 80 epruveta od 8 ml i spojeno u 5 frakcija (BC2_F7-1 do BC2_F7-5) na temelju njihovih HPLC-UV (280 nm) profila .

2.7 1 H i 13C NMR analize

NMR spektri (1D i 2D) frakcija propolisa (7-58 mg) ili ponekad NP snimljeni su u deuteriranom kloroformu (CDCl3) ili deuteriranom metanolu (CD3OD) (500 ul) na JEOL NMR spektrometru na 400 MHz tijekom 1 H i 100 MHz za 13C. NMR eksperimenti (1H NMR, 13C NMR, DEPT-135, DEPT-90 i 2D NMR) na frakcijama i čistim NP-ovima izvedeni su na 298 K na JEOL 400 MHz H spektrometru (JEOL Europe, Croissy -sur-Seine, Francuska) opremljen inverznom 5-mm sondom (ROYAL RO5). Kemijski pomaci (δH i δC) izraženi su u ppm, a J vrijednosti u Hz.

Za 13C NMR (100 MHz) spektre, WALTZ-16 odvajajuća sekvenca je korištena s vremenom prikupljanja od 1,04 s (32,768 složenih podatkovnih točaka) i odgodom opuštanja od 2 s. Između 1500 i 11, 000 skeniranja prikupljeno je kako bi se dobio zadovoljavajući omjer S/N. Eksponencijalni filtar za širenje linije od 1 Hz primijenjen je na svaki pad slobodne indukcije (FID) prije Fourierove transformacije. Spektri su ručno razvrstani po fazama i korigirani prema osnovnoj liniji pomoću softvera MestReNova (Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Španjolska) i referencirani na središnjoj rezonanciji deuteriranog otapala na δC 77,16 ppm (CDCl3) i δC 49,00 ppm (CD3OD). Za pokuse poboljšanja polarizacijskim prijenosom (DEPT) bez izobličenja bilo je potrebno između 512 i 5500 skeniranja, a usklađenja sa spektrima 13C napravljena su korištenjem danog δC. Zatim je korišten minimalni prag intenziteta za ručno prikupljanje pozitivnih 13C NMR i DEPT-90 signala te pozitivnih i negativnih DEPT-135 signala uz izbjegavanje potencijalnih šumnih artefakata.

Propolis DB1 je prvo napravljen traženjem spojeva opisanih u propolisu na SciFindernu, 47 što je rezultiralo u DB od 1471 NP; Vrijednosti δC predviđene su korištenjem naprednih kemijskih razvojnih (ACD) NMR prediktora (C, H). Iz takvih DB-ova koji sadrže NP zajedno s njihovim δC-SDF vrijednostima, rutina CTypeGen uključena u MixONat stvorila je odgovarajući DB: očitao je datoteku prostornih podataka (SDF) i razvrstao kemijske pomake prema vrsti ugljika. Zatim je stvoren potreban c-type SDF, tj. c-type Propolis DB1.43,44

Stilbenoids_Phenanthrenoids DB2 je stvoren. Pretraživanje tvari pomoću ključnih riječi stilbenoids i fenantrens u LOTUS DB-u koji sadrži 276 518 NP-ova48 (LOTUS, 2022.) omogućilo je dobivanje Stilbenoids_Phenantrenoids DB2 od 2681 NP-ova kao SDF. Zatim su stvoreni flavanoni DB3: pretraživanje na SciFindern47 pomoću 2-fenilkromana-4-jedne podstrukture omogućilo je odabir od 56 679 molekula. Dodatno su smanjeni na 2893 koji se odnose na "Pojavljivanje prirodnih proizvoda" korištenjem analize tvari s filtrom "Referentna uloga" koji je predložio SciFindern. Nakon dodatnog pročišćavanja korakom filtriranja temeljenog na očekivanoj molekularnoj težini (MW) (tj. 340 do 424 Da), svi relevantni flavanoni su naknadno izvezeni kao SDF da bi se dobili NP-ovi iz Flavanones DB3 (684 NP-a). Za svaki NP od DB2 i DB3, δC-SDF vrijednosti su predviđene korištenjem ACD NMR prediktora (C, H) softvera kao i metodologije koju je prethodno opisao Nuzillard46 za izravno dobivanje c-tipa SDF spremnog za korištenje od strane MixONat. Potonji sadrži za svaki spoj DB-a predviđene vrijednosti δC organizirane kao metil, metilen, metin ili kvarterni ugljici.

Triterpeni DB4 izgrađeni su od PNMRNP3 DB49,50 uvezenog kao SDF u softver ACD NMR prediktori (C, H) pretraživanjem triterpena s MW između 100 i 500 Da (tj. Podaci pretraživanja: triterpeni; Traži MW: 100 do 500) za izravno dobivanje baze podataka od 6623 triterpena u potrebnom c-type formatu datoteke.

Alk(en)il rezorcinol i derivati ​​fenola DB5 izgrađeni su iz PNMRNP3 DB49,50 uvezenog kao SDF u ACD NMR prediktori (C, H) softvera pretraživanjem NP s skelom m-alk(en)il fenola i klasificirani kao fenoli (tj. 3-(hexadec-8-en-1-yl)phenol Substructure search; Search Classyfire klasa: fenol) za izravno dobivanje DB-a od 44 NP-a u potrebnom c-type formatu datoteke.

2.8 13Dereplikacija temeljena na C NMR-u pomoću softvera MixONat

Popis pikova i podaci o intenzitetu dobiveni iz svakog eksperimentalnog spektra (13C NMR, DEPT-135 i DEPT-90) izvezeni su kao . csv datoteku pomoću softvera Microsoft Excel (Microsoft 16.45) i koristi se kao ulazna datoteka u softveru MixONat. Takve datoteke sastoje se od popisa δC vrijednosti poredanih u opadajućem redoslijedu povezanih s njihovim intenzitetima u istom retku, odvojenih zarezom.

Data were then processed using MixONat, which exploits any dataset that provides molecular structures in the previously described SDF (i.e., c-type DB1–5 file format). Based on this information, MixONat was used to compare the experimental δC values of the fractions to the predicted δC-SDF values from the DB and made suggestions for specific NPs potentially present in the analyzed sample. In the end, MixONat provided NP proposals with scores ranging from 0 to 1, i.e., from 0% to 100% (where 1 corresponds to a perfect match and 0 indicates no similarity for a given compound from the used DB). Acceptable values for putative identification were >0.70. Nakon toga, eksperimentalni podaci NP s najboljim rezultatima uspoređeni su s literaturom.

2.9 Pročišćavanje

2.9.1 Preparativna HPLC

Pročišćavanje frakcija BC{{0}}F6 i BC1_F8 (40 mg u 2 ml MeOH) provedeno je korištenjem Shimadzu LC-20AP preparativa tekućinski kromatograf opremljen UV-vis detektorom SPD-40 (Noisiel, Francuska), injekcijskom petljom od 2 ml i kolektorom frakcija FRC-10A, uz upotrebu preparativne kolone C18 (25{{39 }} mm 21,2 mm id, 5 μm) (Pursuit XRs 5, Agilent, Les Ulis, Francuska) pri brzini protoka od 21,24 ml/min. Mobilna faza sastojala se od 0,1 posto mravlje kiseline u vodi (otapalo A) i metanola (otapalo B), a odvajanje je provedeno pomoću sljedećeg gradijenta: (1) za BC1_F6, 40 posto B (0-5 min), 40–70 posto B (5–20 min) i 70–90 posto (20–30 min); (2) za BC1_F8, 40-70 posto B (0-15 min) i 70-90 posto (15-25 min). Kromatogrami su dobiveni na 254 i 280 nm.

2.9.2 Ekstrakcija čvrste faze (SPE)

Da bi se dobila najpolarnija frakcija BC2-EPP (200 mg u 5 ml MeOH pomiješanog s 350 mg C18-silika gela nakon isparavanja), pročišćavanje je provedeno korištenjem C18 kolone za ekstrakciju čvrste faze (2 g/15 ml, Thermo Scientific™, Villebon-sur-Yvette, Francuska) s vodom: MeOH 7:3 (10 ml) i vodom: MeOH 6:4 (10 ml). Epruvete 4-10 kombinirane su kako bi se dobila polarna frakcija BC2 (BC2_SPE) na temelju njihovih HPLC-UV (330 nm) profila.

2.10 Antioksidativni i anti-AGE testovi

2.10.1 Uklanjanje DPPH radikala

Procjena uklanjanja radikala DPPH beninskih EEP-ova provedena je kao što je prethodno opisano.51 Ukratko, testirani uzorci razrijeđeni su u apsolutnom EtOH na 0.02 mg/ml iz osnovnih otopina na 1 mg/ml u dimetilsulfoksidu (DMSO). Alikvoti (100 ul) ovih razrijeđenih otopina stavljeni su u 96-ploče s jažicama u tri primjerka. Oko 25 ul svježe pripremljene DPPH otopine (1 mM) dodano je u 75 ul apsolutnog EtOH pomoću injektora za čitanje mikroploča (Infinite® 200, Tecan, Francuska) da se dobije konačni volumen od 200 ul po jažici. Nakon 30 minuta u mraku na sobnoj temperaturi, apsorbancija je određena na 517 nm. EtOH je korišten kao slijepa proba, dok su 10, 25, 50 i 75 µM otopine Troloxa (hidrofilni analog tokoferola) korištene za kalibracijsku krivulju. Kao standard za kontrolu kvalitete korišten je uzorak etanolne otopine klorogenske kiseline (0,02 mg/ml). Rezultati su izraženi kao Trolox ekvivalenti (mikromolovi TE po g ekstrakta).

2.10.2 Anti-AGE test

Učinci ekstrakata propolisa i pet glavnih izoliranih derivata naringenina na stvaranje AGE-a određeni su kao što je prethodno opisano.51 Ukratko, goveđi serumski albumin (BSA) (10 mg/ml) inkubiran je s D-ribozom ({{ 13}}.5 M) zajedno s ispitivanim spojem (3 μM do 3 mM) ili ekstraktom (1 ug do 1 mg) u 50 mM fosfatnom puferu pri pH 7,4 (NaN3, 0,02 posto). Otopine su inkubirane u 96- mikrotitarskim pločama na 37 stupnjeva C 24 sata u zatvorenom sustavu prije mjerenja AGE fluorescencije. Fluorescencija iz inkubiranog uzorka u identičnim uvjetima bez D-riboze oduzeta je za svako mjerenje. Fluorescencija AGE-a slična pentozidinu (ekscitacija na 335 nm, emisija na 385 nm) mjerena je fluorometrijom.52 Vrijednosti IC50 definirane su kao količina ekstrakta (ug/ml) ili pozitivne kontrole (μM) potrebna za smanjenje stvaranja AGE-a za 50 posto u odnosu na negativnu kontrolu. Prema testu statističke validacije,53 jedna je analiza dovoljna za točno određivanje IC50.

3. REZULTATI I RASPRAVA

3.1 Kromatografsko profiliranje

Opće LC profiliranje osam beninskih i kongoanskih EPP-a korištenjem kvazi-univerzalnog ELSD detektora pokazalo je da su svi uzorci sadržavali nepolarne spojeve, eluirane na kraju kromatograma (Slika 1). BC1 je također predstavio veliku količinu polarnijih spojeva, a BC2 je pokazao neke srednje polarne spojeve u manjim količinama. Čini se da su nepolarni spojevi u CG EEP prilično različiti od beninskih.

Tako je ELSD profiliranje dovelo do tri različita i originalna uzorka čiji je sastav dalje istražen: BC1, BC2 i CG.

Prvo su provedene GC-MS analize, uspoređujući MS fragmentaciju s NIST DB, kako bi se karakterizirale kemijske klase i, kada je to bilo moguće, identificirali sastojci. Navodna identifikacija (na temelju postotka podudaranja s NIST DB) i kemijske klase spojeva prikazane su u tablici 2 (podaci profila GC – ukupne ionske struje [TIC] prikazani su na slici SI-2).

Svi beninski EEP-ovi prezentirali su iste profile nepolarnih spojeva, označenih slovima od A do F, ali njihove količine mogu varirati. Navodno su identificirani kao - ili -amrinon (A), -amirin (B), lupenon (C), -amirin (D), - ili -amirin acetat (E) i lupeol acetat (F) (usp. Slika SI -3), već opisani kao glavni NP u meksičkom propolisu.54 Zhang et al. (2014) i Tamfu et al. (2020.) također su opisali triterpenoide kao amirin/lupeol i amirin/lupeol acetate u različitim uzorcima afričkog propolisa.41,55 Samo je BC1 predstavio dodatne NP-ove eluirane između Rt 10 i 15 min koji su sugerirani kao metoksilirani stilbenoidi ili fenantreni prema njihovim obrascima fragmentacije. Kongoanski EEP pokazao je drugačiji profil od beninskih, s C16 i C18 kiselim etil esterima kao hlapljivijim spojevima povezanim s dobrim rezultatom podudaranja od 94 posto, derivat fenola na Rt 13,1 min, tri derivata resorcinola u rasponu od 14– 17 min, a različite vrste derivata triterpena nakon Rt 21 min.

Osim toga, EPP-ovi su analizirani pomoću HPLC-DAD-MS da bi se vizualizirali nehlapljivi NP-ovi (usp. sliku SI-4). Različito profiliranje pokazalo je da BC1 EEP ima veliku količinu srednje polarnih spojeva s kromoforima koji apsorbiraju na 280 nm, kao i BC2 u manjim udjelima, a CG ima vrlo loš UV profil na 280 nm.

3.2 Kemijski sastav BC1 i BC2

Kako bi se identificirali njihovi glavni NP-ovi pomoću 13C NMR dereplikacije na temelju MixONat i odgovarajućih DB-ova, grubo frakcioniranje BC1 i BC2 EEP postignuto je flash kromatografijom. Doista, za BC1, GC-MS analiza otkrila je prisutnost metoksiliranih stilbenoida ili fenantrena, što nas je vodilo da izgradimo specifične stilbenoide_fenantrenoide DB2. Za BC2, osim za polarnije spojeve na Rt 3,8 min, svi spojevi su pokazali UV spektre flavanona-dihidro flavonola, što je sugeriralo stvaranje flavanona DB3.

Kao što je prikazano u tablici 3, dihidrofenantren 1 i 3–5, fenantren 2 i 6 i dihidro stilben 7 (slika 2) predložio je MixONat u BC1 EEP i potvrdio usporedbom s podacima iz literature (usp. popratne informacije). Kada je bilo potrebno, korišten je MW filter na temelju HPLC-MS podataka.

Preciznije, među 9,10-dihidrofenantrenskih derivata od 2681 NP u DB2, MixONat je predložio 6-metoksikoelonin (2,7-dihidroksi-3,5-dimetoksi{ {10}},10-dihidrofenantren; 3, rang 1, rezultat 0.75, slike SI-13 i SI-14) u BC{{ 18}}F5 i njegova prisutnost potvrđena je usporedbom s objavljenim NMR podacima. Još je identificiran u vrstama Combretaceae56 i u orhideji Bulbophyllum vaginatum; 57 i 2,7-dihidroksi-3,4,6-trimetoksi- 9,10-dihidrofenantren (4, rang 1, rezultat 0,88, slike SI{{33 }} i SI-16) pretpostavljena je u BC1_F2. Spoj 4 već je opisan u senegalskom propolisu58 i njegova je prisutnost potvrđena na temelju podataka koje su prijavili Pettit i sur. iz afričkog stabla Combretum caffrum59 i Lu et al. iz Dioscorea nipponica Makino.60

Proces dereplikacije temeljen na 13C NMR također je predvidio 2,6-dihidroksi-3,4,7-trimetoksi-9,10-dihidrofenantren (5, rang 8, rezultat 0.76, slike SI-15 i SI-16) u BC1_F2 i 2,6,7-trihidroksi{{20 }},4-dimetoksi-9,10-dihidrofenantren (1, rang 2, rezultat 0.5, slike SI-5 i SI-6 ) u BC{{30}}F6-1 kada je korišten molekularni filtar pri MW 288 Da. Za 1, rezultat je bio prilično nizak (0.5); stoga su dodatni 2D NMR eksperimenti (heteronuklearne višestruke kvantne korelacije [HMQC], heteronuklearna povezanost višestrukih veza [HMBC], spektroskopija nuklearnog Overhauserovog efekta [NOESY], usp. slike SI-7–SI-10) izvodi se za potvrdu strukture; za 5 rezultat je bio 0,76, tj. veći od 0,70. Ova dva NP (1 i 5) prvi su spomenuli Letcher i sur. u vrstama Combretum61,62 i 1 je već pronađen u senegalskom propolisu.58

Među derivatima fenantrena, MixONat je pretpostavio 2,6,7-trihidroksi-3,4-dimetoksifenantren (2, rang 1, rezultat 0.88, Slike SI-11 i SI{{10}}) u BC1_F8-1, što je potvrđeno usporedbom s njegovim spektralnim podacima koje su opisali Letcher et al. u Combretum apiculatum. 61 2,7-Dihidroksi-3,4,6-trimetoksifenantren (6, rang 5, rezultat 0,94, slike SI-17 i SI-18) prethodno izoliran iz Photolida Chinensis63 predložen je u BC1_F4.

Combretastatin B{{0}} (7), dihidro stilben, predložio je MixONat u prvom rangu (ocjena 1,0, slike SI-17 i SI-19) u BC1 EPP kada se koristi MW filtar (MW 304 Da) i potvrđen usporedbom s NMR podacima koje su opisali Pettit et al. u Combretum caffrum. 59

Spojevi 2, 6 i 7 već su identificirani u senegalskom propolisu.58

1H i 13C NMR podaci od 1-7 dostupni su u popratnim informacijama.

Za BC2 identificirano je sedam spojeva koji pripadaju dvjema strukturnim klasama polifenola, derivatima kromon-C-glukozida i prenilflavanona (8-14), od kojih su neki po prvi put opisani u propolisu (Slika 3).

Proces temeljen na 13C NMR upotrebom MixONat i DB1 do DB5 nije dao relevantne rezultate koji upućuju na izvorne NP. Dva glavna proizvoda (8-9) u potpunosti su okarakterizirana kao smjesa korištenjem masenih spektara i 1D i 2D NMR podataka (1H, 13C, HMQC, HMBC, usp. sliku SI-20–SI-23) i identificiran kao florin (8) i izobiflorin (9), dva kromanon-Cglukozida novoopisana u propolisu, prethodno opisana u Pancratium biflorum64 odnosno klinčićima Eugenia caryophyllata.65

Što se tiče derivata flavanona, među 688 NP u DB3, MixONat je predložio 6-prenilnaringenin (10, rang 1, rezultat 0.95, slike SI- 24 i SI{{8 }}) već opisan u nigerijskom crvenom propolisu66 u pr. Kr{{10}}F7-1. 6,8-diprenilaromadendrin (12, rang 1, rezultat 1.0, slike SI-28 i SI-29) i 6,8-diprenilnaringenin (lonhokarpol A ) (13, rang 10, rezultat 0,84, slike SI-30 i SI-31), prethodno pronađeni u kamerunskim uzorcima propolisa,42 potvrđeni su u BC2_F{ {30}} odnosno BC2_F5. 6-Geranylnaringenin (14, rang 1, rezultat 0,84, slike SI-32 i SI-33), prethodno opisan u propolisu sa Salomonskih Otoka,67 pretpostavljena je i potvrđena u pr. Kr. {{41 }}F7-5. Konačno, 6-dimetilalil naringenin (11) predložio je MixONat na drugom mjestu u BC2_F6 (rang 2, rezultat 0,65, slike SI-26 i SI- 27). Izomer na poziciji 8 predložen je na prvoj poziciji, no usporedba s literaturnim podacima 68,69 pokazala je da se radi o izomeru na poziciji 6. Spoj 11 bio je nov u propolisu, ali je već opisan u organskim ekstraktima Monotes africanus. 70 1 H i 13C NMR podaci od 8–14 dostupni su u popratnim informacijama.

【Za više informacija: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】