Karakteristični HPLC–MS profil granula Cistanche Deserticola Formula

 

Autori: Mao Dan; Yu Hong; Mao Xiuhong; Hu Qing; Ji Shen*
Pripadnost: Šangajski institut za kontrolu hrane i lijekova; NMPA ključni laboratorij za kontrolu kvalitete tradicionalnih kineskih lijekova, Šangaj 201203, Kina

 

Sažetak

Karakteristična metoda kromatografskog profiliranja za granule formule Cistanche deserticola uspostavljena je na temelju HPLC-MS. Koristeći provjerene komadiće dekokcije Cistanche deserticola i referentnu tvar ehinakozida kao reference, deset serija uzoraka ekstrahirano je izravno s 50% metanolom i analizirano HPLC-om. Odvajanje je provedeno na koloni Phenomenex Luna C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) s gradijentom acetonitril–0,1% mravlje kiseline pri 1,0 mL/min, 30 stupnjeva i UV detekcijom pri 330 nm. Konstruiran je referentni karakteristični kromatogram s devet zajedničkih vrhova, među kojima je pet vrhova identificirano pomoću LC/Q‑TOF‑MS. Deset serija pokazalo je sličnost veću ili jednaku 0,981. Mjere preciznosti, stabilnosti i ponovljivosti karakterističnog profila bile su zadovoljavajuće. Metoda je jednostavna, učinkovito identificira granule formule Cistanche deserticola i može se koristiti za ocjenu kvalitete.

Ključne riječi: Cistanche deserticola; granule formule; karakteristični kromatogram; ehinakozid; verbaskozid (akteozid); HPLC; LC–Q‑TOF‑MS; cistanche koristi; najbolji cistanche za prodaju

 

Uvođenje Cistanche

Cistanche (Rou Cong Rong)je poznati tonik tradicionalne kineske medicine (TCM) s tonizirajućim učinkom na bubrege, hranjivim esencijama i laksativnim učincima. Prvi put je zabilježen u Shennongovom Classic of Materia Medica i naveden kao lijek vrhunske kvalitete. Izdanje Farmakopeje Narodne Republike Kine (I. dio) iz 2020. definira autentične izvore kao osušene, ljuskaste, mesnate stabljike Cistanche deserticola YC Ma ili Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, s metodama obrade koje uključuju sirovi proizvod i proizvod prerađen u vinu. Glavne kemijske komponente uključuju feniletanoidne glikozide (PhG), iridoide, lignane i šećere, koji podupiru farmakološke aktivnosti kao što su neuroprotekcija, usporavanje starenja, hepatoprotekcija i laksacija; izgledi za kliničku primjenu su široki. Među njima, PhG su najaktivniji sastojci.

Granule formule Cistanche deserticola su granule od jedne biljke pripremljene od prerađene C. deserticola korištenjem modernih proizvodnih tehnika za upotrebu u kliničkim receptima. Trenutno ne postoji nacionalni standard za njihovu kontrolu kvalitete. Prethodne studije su izvijestile o metodama određivanja sadržaja ili uzimanju otisaka prstiju za granule formule C. tubulosa, ali nije bilo literature o karakterističnim kromatogramima posebno za granule formule C. deserticola. U ovoj studiji prikupljeno je deset serija kako bi se po prvi put uspostavio HPLC karakteristični profil za granule formule C. deserticola, s pet vrhova identificiranih pomoću LC-MS. Ovaj profil pruža učinkovitu i znanstvenu osnovu za rigoroznu kontrolu kvalitete granula formule C. deserticola.

 

Pokus cistanche

 

1.1 Instrumenti i reagensi

 

Agilent 1100 HPLC s UV-Vis detektorom i ChemStation (Agilent, SAD)

Agilent 1290 Infinity HPLC i Agilent 6530 Q‑TOF MS s ESI izvorom (Agilent, SAD)

Sartorius elektronska vaga (Sartorius Scientific Instruments, Peking, Kina)

Elmasonic P ultrazvučni čistač (Elma, Njemačka)

Referentni komadići uvarka Cistanche deserticola i referentne tvari ehinakozida i verbaskozida (akteozida) kupljeni su od Nacionalnog instituta za kontrolu hrane i lijekova (serije br.. 121101-201603, 111670-201907, 111530-201914). Cistanosid A, tubulozid A i izoverbaskozid dobiveni su od Shanghai Tauto Biotech (serijski brojevi . 21040621, 20061231, 21040824). Acetonitril (HPLC stupanj) bio je od Mercka; ostali reagensi bili su analitičkog stupnja (Shanghai Lingfeng Chemical Reagents). Deset serija granula formule C. deserticola (PFKL1–PFKL10), tri serije komada dekokcija C. deserticola (YP1–YP3) i tri serije standardnih dekokcija C. deserticola (BZTJ1–BZTJ3) isporučio je Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd.

 

1.2 Priprema otopina

1.2.1 Referentna rješenja

 

Referentna biljna otopina: izvažite 1 g provjerenih komadića dekokcije C. deserticola u konusnu tikvicu s čepom, dodajte 25 mL 50% metanola, sonikirajte (250 W, 35 kHz) 30 minuta, ohladite, promiješajte i centrifugirajte. Upotrijebite supernatant kao referentnu otopinu biljaka.

Otopina poredbene tvari: Pripremite ehinakozid od 0,2 mg/mL u 50% metanolu.

 

1.2.2 Otopina ispitivanja

Samljeti uzorak; točno odvažite oko 1 g u jantarnu odmjernu tikvicu od 100 mL. Dodajte 50 mL 50% metanola, začepite, protresite, izvažite, namačite 30 minuta i sonicirajte 40 minuta (250 W, 35 kHz). Ostavite da se ohladi, ponovno izvažite i nadoknadite izgubljenu težinu s 50% metanola. Pomiješajte, odstojite, filtrirajte i prikupite naknadni filtrat za analizu.

 

1.3 Instrumentalni uvjeti

Kromatografski uvjeti: Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobilna faza A: acetonitril; mobilna faza B: 0,1% mravlja kiselina u vodi; elucija gradijenta: 0–5 min, 12% A; 5-15 min, 12%→20% A; 15–30 min, 20%→30% A. Brzina protoka 1,0 mL/min; valna duljina detekcije 330 nm; temperatura stupca 30 stupnjeva; volumen injekcije 10 μL. Teoretske ploče, izračunate na vrhuncu ehinakozida, trebale bi biti veće ili jednake 5000.
Napomena: izvorni tekst dvaput navodi "15–30 min, 20%→30% A"; ovo se tumači kao jedan korak.

Uvjeti masene spektrometrije: ESI u načinu rada pozitivnih iona; raspon skeniranja m/z 50–1200. Postavke izvora: nebulizator (N2) 35 psi; plin za sušenje (N2) 15 L/min na 200 stupnjeva; plašni plin (N2) 12 L/min na 350 stupnjeva; kapilarni 3,5 kV; fragmentor 125 V; MS/MS kolizijske energije (CID) na 10, 20 i 40 eV.

Rezultati i rasprava

 

2.1 Predobrada uzorka i valna duljina detekcije

Otapala za ekstrakciju (metanol, 75% metanol, 50% metanol, 25% metanol), načini ekstrakcije (ultrasonizacija, refluks) i vremena (10, 20, 40, 60 min) su uspoređeni. Optimalni predtretman bio je 50% metanol uz 40 min ultrazvučne obrade. Kako PhG u C. deserticola pokazuje maksimalnu UV apsorpciju na 330 nm, 330 nm je odabrano za detekciju.

 

2.2 Odabir kromatografskih uvjeta

2.2.1 Stupci

Zorbax SB‑C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), Kromasil 100‑5‑C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) i Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) pružili su odgovarajuće odvajanje i prikladnost met sustava; relativna vremena zadržavanja (RRTs) karakterističnih vrhova bila su unutar ±10% specificiranih vrijednosti. Laboratoriji mogu birati među njima.

 

2.2.2 Mobilna faza

Metanol–0,1% mravlja kiselina dala je loše odvajanje za većinu vršnih vrijednosti osim za ehinakozid; stoga je usvojen acetonitril – 0,1% mravlja kiselina i optimiziran na gradijent u odjeljku 1.3, čime se postiže optimalna rezolucija, brojevi ploča i stabilna osnovna linija. Budući da nakon 30 minuta nije bilo eluiranja daljnjih vršnih vrijednosti, ponovno ekvilibriranje je započeto na početnom sastavu.

 

2.3 Preciznost, ponovljivost i stabilnost

Koristeći seriju PFKL1, ispitna otopina pripremljena prema Odjeljku 1.2.2 ubrizgana je šest puta pod uvjetima iz Odjeljka 1.3. RSD RRT-a i relativne površine vrhova za devet karakterističnih vrhova bili su svi<1%, indicating good instrumental precision. Six independently prepared test solutions of PFKL1 yielded RSDs <1% for both RRTs and relative peak areas, demonstrating repeatability. Stability testing at 0, 3, 9, 14, 21, and 28 h showed RSDs <1% for RRTs and relative peak areas, indicating the test solution was stable within 0–28 h.

2.4 Određivanje karakterističnog kromatograma i tehničkih parametara

2.4.1 Referentni karakteristični kromatogram

Deset serija granula formule C. deserticola dosljedno je pokazivalo devet karakterističnih vrhova koji su u vremenu zadržavanja odgovarali devet vrhova u otopini referentne biljke (slike 1-2). Pet vrhova je dodijeljeno standardima kao ehinakozid, cistanozid A, tubulozid A, verbaskozid (akteozid) i izoverbaskozid. Vrh ehinakozida pridonio je velikom i stabilnom udjelu ukupne površine vrha i odabran je kao referentna tvar. Kromatografsko ponašanje u deset serija bilo je u biti dosljedno.

A.Slijepa otopina;B.Echinacoside;C.Test otopina;D.Cistanchedeserticola;E.Kromatogram referentnih karakteristika.

 

Popis specifikacija Cistanche Tubulosa

 

Kontaktirajte nas i kupite sada

 

 

 

 

2.4.2 Identifikacija vrha

Ispitne otopine (odjeljak 1.2.2) analizirane su pomoću LC-MS u pozitivnom i negativnom ESI načinu rada; pozitivni način dao je bogatije informacije o vrhuncu i korišten je (Slika 3). Ukupno je identificirano devet spojeva; pet je potvrđeno točnom masom, vremenom zadržavanja i MS/MS fragmentima korištenjem standarda (Tablica 1). S obzirom da su PhG glavni aktivni sastojci u C. deserticola i da se granule formule pripremaju vodenom ekstrakcijom, LC/Q-TOF-MS potvrdio je PhG kao glavne sastojke. U skladu s tim, devet karakterističnih pikova je katalogizirano, a pet pikova s ​​relativno jakim odgovorima označeno je u referentnom kromatogramu.

Slika 2 HPLC referentni karakteristični kromatogram 3(S):Ehinakozid;4:CistanozidA;5:TubulozidA; 6: Akteozid; 7: Izoakteozid.

Slika 3 Strujni kromatogram ekstrakcije ispitne otopine 3(S):Ehinakozid;4:CistanozidA;5:TubulozidA;6:Akteozid;7:Izoakteozid.

 

2.4.3 Specificirana relativna vremena zadržavanja

Na temelju deset serija, srednji RRT (u odnosu na S pik, tj. ehinakozid) bili su: 0,77 (Pik 1), 0,86 (Pik 2), 1,00 (Pik 3, S), 1,17 (Pik 4), 1,27 (Pik 5), 1,32 (Pik 6), 1,44 (Pik 7), 1,67 (vrh 8) i 1,81 (vrh 9). RRT svakog vrha trebao bi biti unutar ±10% svoje specificirane vrijednosti.

Tablica 1. Parametri kromatografske vršne masene spektrometrije koji se odnose naCistanche deserticolaFormula Granule

Vrh	Ime	Molekularna formula	m/z	Vrijeme zadržavanja (min)
1	Nepoznato	C₅₁H₃₆O₁₁	824.2258	6.123
2	Nepoznato	C₃₆H₃₀O₈	590.1941	6.876
3	Ehinakozid	C₃₅H₄₆O₂₀	809.2467	13.646
4	cistanozid A	C₃₆H₄₈O₂₀	823.2642	16.285
5	Tubulozid A	C₃₇H₄₈O₂₁	851.2570	17.947
6	Akteozid	C₂₉H₃₆O₁₅	647.1931	18.464
7	Izoakteozid	C₂₉H₃₆O₁₅	647.1956	20.083
8	Nepoznato	C₃₁H₃₈O₁₆	689.2044	23.446
9	Nepoznato	C₃₁H₃₈O₁₆	689.2041	25.883

2.5 Procjena sličnosti

Kromatogrami iz deset serija uvezeni su u "Sustav procjene sličnosti za kromatografski otisak TCM-a (2012A)." Koristeći uzorak S1 kao referencu, metoda medijana, vremenski prozor od 0,5 min, kalibracija u više točaka i podudaranje podataka generirali su referentni otisak prsta (Slika 4) s devet uobičajenih vrhova. Vrijednosti sličnosti za svih deset serija bile su veće ili jednake 0,981 (0,981–0,999), što ukazuje na visoku sličnost među serijama.

 

2.6 Prijenos kvantitete i kvalitete s komadića decoctiona na standardne granule decoctiona i formule

Podudaranje vrhova pokazalo je da komadići dekokta C. deserticola, standardni dekokt i granule formule dijele devet karakterističnih vrhova, uključujući pet dodijeljenih vrhova (ehinakozid, cistanozid A, tubulozid A, verbaskozid i izoverbaskozid) (Slika 5). Karakteristični profili bili su u visokoj korelaciji, a pravila prijenosa iz komada dekokcija → standardni dekokt → granule formule bila su jasna. Od komada uvarka do standardnog uvarka, područje vrha 6 (verbaskozid) značajno se smanjilo, u skladu s toplinskom nestabilnošću verbaskozida.

Slika 4 Prekrivanje HPLC karakterističnog kromatograma granula Cistanche deserticola Formula

2.7 Usporedba karakterističnih kromatograma između granula formule C. deserticola i C. tubulosa

I C. deserticola i C. tubulosa sadrže ehinakozid, cistanozid A, verbaskozid, izoverbaskozid i tubulozid A. Međutim, dvije se vrste značajno razlikuju u sadržaju ehinakozida, a cistanozid A je prisutan samo u tragovima u C. tubulosa. Stoga ehinakozid i cistanozid A mogu poslužiti kao diskriminirajući markeri za razlikovanje botaničkog podrijetla (C. deserticola vs. C. tubulosa).

Slika 5. Usporedba karakterističnih kromatograma komadića dekokcije Cistanchedeserticolade (A), standardne dekokcije (B) i formula granula (C) 3(S):Ehinakozid;4:CistanozidA;5:TubulozidA;6:Akteozid;7:Izoakteozid.

 

Zaključak (izmijenjen prema zahtjevu: koja vrsta ima "bolji" sadržaj)

U okviru utvrđenog HPLC–MS karakterističnog profila zaCistanche deserticolagranule formule i s obzirom na usporedbu među vrstama,C. deserticolapokazuje bogatiji i uravnoteženiji profil feniletanoidnog glikozida: cistanozid A se lako otkriva u C. deserticola, ali samo u tragovimaC. tubulosa, dokehinakozidpokazuje izražene razlike među vrstama. Stoga se za formulacije koje ciljaju na više agregatne razine ključnih PhG-ova i snažnije ukupne koristi od cistanche, Cistanche deserticola preporučuje kao bolja vrsta u smislu sadržaja. Ako proizvod posebno ciljamaksimalni ehinakozid, odabrane serije C. tubulosa ćeuzeti u obzir ovisno o opskrbi i ispitivanju serije. U praksi, "najbolji cistanche za prodaju" trebao bi se odrediti kvantitativnim testiranjem ehinakozida, verbaskozida (akteozida) i cistanozida A specifičnim za seriju prema validiranoj metodi opisanoj ovdje.

 

 

Reference

[1] Tang SW. Klasificirana Materia Medica. Peking: Huaxia Publishing House, 1993:192.
[2] Komisija kineske farmakopeje. Farmakopeja Narodne Republike Kine (svezak . 1). Peking: China Medicine Science and Technology Press, 2020:140.
[3] Zhi YJ, Zhen YQ, Tian W, et al. Kineski tradicionalni i biljni lijekovi, 2021., 52(9):2758.
[4] Zhen YQ, Tian W, Wang XG, et al. Moderna tradicionalna kineska medicina, 2019, 39(1):83.
[5] Jing H, Zuo JF, Li JS. Lishizhen Medicine and Materia Medica, 2006, 17(3):440.
[6] Han GQ, Li CF, Wang XQ, et al. China Journal of Chinese Materia Medica, 2015., 40(21):4218.
[7] Lei L, Jiang Y, Liu X, et al. Helv Chim Acta, 2010, 90(1):79.
[8] Liu XM, Li J, Jiang Y, et al. Biochem Syst Ecol, 2013, 47(8):21.
[9] Gong HM, Hu H, Liu YC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 2018., 33(6):623.
[10] Gao Y, Guo LN, Ma SC, et al. China Journal of Chinese Materia Medica, 2019, 44(17):3749.
[11] Lu YH, Pi WM, Zhang Y, et al. Moderna kineska medicina, 2019, 21(8):999.
[12] Wang LW, Cao R, Fang YY, et al. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2017, 40(2):295.

Bilješke

Nazivi spojeva: ehinakozid; cistanozid A; tubulozid A; verbaskozid (akteozid); izoverbaskozid.

Očigledne tipografske greške koje se odnose na "muškatni oraščić" u izvoru prevedene su kao "Cistanche" u prijevodu na temelju konteksta.