Poglavlje 1: Bubrežni tubularni peroksisomi neophodni su za normalnu funkciju bubrega

Za više informacija kontaktirajtetina.xiang@wecistanche.com

Peroksisomi su specijalizirane stanične organele uključene u razne metaboličke procese. U ljudi, mutacije koje dovode do potpunog gubitka peroksisoma uzrokuju zatajenje više organa (poremećaji Zellwegerovog spektra, ZSD), uključujućioštećenje bubrega. Međutim, (pato)fiziološka uloga peroksisoma ububregostaje nepoznato. Bavili smo se ulogom peroksisoma ububrežna funkcijau miševa s uvjetnom ablacijom peroksisomalne biogeneze u bubrežnom tubulu (cKO miševi). Funkcionalne analize nisu otkrile nikakav očiti fenotip bubrega u cKO miševa. Međutim, dojenčad mužjaka cKO miševa imala je manju tjelesnu težinu i težinu bubrega, a odrasli mužjaci cKO miševa pokazali su značajno smanjenje težine bubrega i omjera težine bubrega/tjelesne težine. Stereološka analiza pokazala je povećanje gustoće mitohondrija u stanicama proksimalnih tubula cKO miševa. Integrirane analize transkriptoma i metaboloma otkrile su duboko reprogramiranje nekoliko metaboličkih putova, uključujući metabolizam glutationa i biosintezu/biotransformaciju nekoliko glavnih klasa lipida. Iako je ova analiza sugerirala kompenziranooksidativni stres, izazov hranjenjem s visokim udjelom masti nije izazvao značajna oštećenja bubrega u cKO miševa. Pokazali smo da su bubrežni tubularni peroksisomi nezamjenjivi za normalnu funkciju bubrega. Naši podaci također upućuju na to da su bubrežna oštećenja u bolesnika sa ZSD ekstrarenalnog podrijetla.

Kliknite ovdje da biste saznali više o prednostima ekstrakta cistanche tubulosa

Uvod

Peroksisomi su organele vezane s jednom membranom koje je Rhodin prvi pronašao u bubrezima miševa 1954. (1). Trenutne procjene sugeriraju da peroksisomi sadrže više od 50 enzima uključenih u razne stanične funkcije, uključujući -oksidaciju masnih kiselina vrlo dugog lanca (VLCFA), masnih kiselina dugog lanca (LCFA) i dikarboksilne kiseline dugog lanca; a-i -oksidacija masnih kiselina razgranatog lanca; oksidacija prostaglandina i leukotriena; metabolizam aminokiselina; biosinteza eter fosfolipida (uključujući plazmalogene) i žučnih kiselina; redoks homeostaza; detoksikacija glioksilata; i feroptoze. Peroksisomi su sveprisutno prisutni u gotovo svim stanicama sisavaca, s najvećim brojem u stanicama proksimalnih tubula bubrega i hepatocitima. U tim stanicama peroksisomi zauzimaju oko 3 posto volumena stanice, ali njihov broj, veličina i oblik značajno variraju tijekom embrionalnog i postembrionalnog razvoja (2); njihov broj može jako porasti u raznim stresnim uvjetima (3). Iako su mnogi peroksisomalni enzimi dobro karakterizirani, malo je studija koje se bave njihovom ekspresijom i funkcionalnom ulogom u bubrezima. Štoviše, ukupna funkcionalna važnost peroksisoma u bubrezima ostaje uglavnom nepoznata.

Dokazi o ulozi peroksisoma u (pato)fiziologiji bubrega uglavnom su proizašli iz studija ljudske genetike. Identificirane su dvije vrste mutacija koje dovode do peroksisomalnih poremećaja kod ljudi: (i) mutacije u takozvanim genima za peroksin (PEX) uključenim u biogenezu peroksisoma i (ii) mutacije u specifičnim peroksisomalnim enzimima. Prvi tip mutacije dovodi do generalizirane peroksisomalne disfunkcije koja uzrokuje poremećaje cerebrohepatorenalnog Zellwegerovog spektra (ZSD) (4). Dojenčad s teškim oblicima ZSD obično umiru tijekom prve godine života od multiorganskog zatajenja. Iako je prisutnost kortikalnih bubrežnih cista i/ili bubrežnih oksalatnih kamenaca u bolesnika sa ZSD-om dobro dokumentirana tijekom godina (5, 6), molekularni mehanizmi koji dovode do ovih oštećenja do sada su nepoznati. Druge moguće bubrežne abnormalnosti u ZSD-u nisu istražene jer bolešću dominiraju neurološke komplikacije. Utjecaj srednjih ili blažih oblika ZSD na funkciju bubrega nije sustavno procijenjen. Dokazi koji povezuju nedostatak jednog peroksisomalnog enzima s bubrežnom patofiziologijom također su ograničeni.

Mutacije u jetrenoj peroksisomalnoj alanin: glioksilat aminotransferazi kodirani AGXT genom dovode do primarne hiperoksalurije tipa I, bolesti karakterizirane taloženjem kristala kalcijevog oksalata u bubrezima (pregledano u ref. 7). Nedavno je identificirana autosomno dominantna mutacija koja dovodi do bubrežnog Fanconijevog sindroma ili generalizirane disfunkcije proksimalnog tubula u peroksisomskom enzimu enoil-CoA hidratazi i 3-hidroksi acil CoA dehidrogenazi (EHHADH)(8) . Ova mutacija uzrokuje pogrešno usmjeravanje EHHADH na mitohondrije i oštećenje mitohondrijske funkcije. Genetske studije provedene na kongenim sojevima štakora pokazale su da peroksisomski enzim oksidaza hidroksi kiselina 2 (HAO2) može igrati ulogu u kontroli krvnog tlaka (9,10). Međutim, ostaje nepoznato je li ovaj fenotip uzrokovan promijenjenom funkcijom HAO2 u bubrezima ili drugim tkivima. Općenito, još uvijek nedostaju podaci iz životinjskih modela s defektima biogeneze peroksisoma specifičnim za bubrege ili inaktivacijom jednog peroksisomalnog enzima specifičnom za bubrege. Ovdje smo se pozabavili ulogom peroksisoma u funkciji bubrega kod mužjaka i ženki miševa s uvjetnom ablacijom peroksisomalne biogeneze u bubrežnom tubulu.

Rezultati

Generacija i osnovna karakterizacija mladunaca muških i ženki miševa s uvjetnom ablacijom peroksisomalne biogeneze u bubrežnom tubulu. Biogeneza peroksisoma u bubrežnom tubulu bila je poremećena uvjetovanom inaktivacijom Pex5 koji kodira receptor citosolnog ciljanja peroksisoma 1 (PTS1), koji je neophodan za uvoz proteina koji sadrže motiv PTS1 u peroksisome (11,12). Uvjetna delecija Pex5 u bubrežnom tubulu postignuta je korištenjem doksiciklin-inducibilnog (DOX-inducibilnog) sustava (PexSanlo/Pax8-rtTA/LC1 miševi, ref.13). Budući da funkcionalna važnost peroksisoma može ovisiti o dobi (14), osnovna karakterizacija nedostatka Pex5 u bubrezima provedena je i kod dojenčadi i kod odraslih miševa. U pokusima s mladunčadi miševa, ekscizija floksiranog alela Pex5 postignuta je primjenom DOX-a (2 mg/mL u vodi za piće) trudnim ženkama na E14 i održavana do P7. Mladunci miševa su žrtvovani na P28. Kao kontrola korišteni su miševi s genotipom Pex5oilo. Kao što je prikazano na Dodatnoj slici 1A (dopunski materijal dostupan na mreži uz ovaj članak; https://doi.org/10.1172/jci.insight.155836DS1), tretman DOX-om rezultirao je gotovo potpunom ekscizijom floksiranog Pex5 alela u Pexswn/Pax{{ 29}}GTA/LC1 muški i ženski miševi. Analiza bubrežnih presjeka nije otkrila nikakve očite histološke abnormalnosti ili bubrežne kamence u mladunčadi miševa bez Pex.5 u bubrežnom tubulu (nije prikazano). Albuminurija je bila odsutna u točkastim uzorcima urina mladunaca miševa bez Pex5-obojicespolovi(Dodatna slika 1B). Tjelesna težina (BW) i težina bubrega (KW), ali ne i omjer KW/TT, bili su niži u muških miševa bez Pex5-mladunaca u usporedbi s kontrolama iz legla (dodatna slika 1C).

Generacija i temeljna karakterizacija odraslih mužjaka i ženki miševa s uvjetnom ablacijom peroksisomalne biogeneze u bubrežnom tubulu. Delecija Pex5 u bubrežnom tubulu odraslih miševa izazvana je 2-tjednim tretmanom DOX-om 8-tjedno starih Pex5xio/Pax8-ntTA/LC1 muških i ženki miševa, u daljnjem tekstu kao cKOm i cKOf miševi, redom (vidi Metode). Paralelno, isti DOX tretman je dat njihovim kontrolama iz legla (Pex5a/lx miševi, u daljnjem tekstu Ctrlm odnosno Ctrlf miševi). Svi pokusi na odraslim miševima izvedeni su 4 tjedna nakon završetka liječenja DOX-om. Kao što je prikazano na slici 1A, ekspresija Pex5 mRNA značajno je smanjena u bubrezima cKOm i cKOf miševa. Međutim, u cKOf miševa također se moglo detektirati nešto rezidualne Pex5 mRNA pune duljine, što ukazuje na nepotpunu eksciziju floksiranog alela. Slično, PEX5 protein je bio praktički odsutan u bubrezima cKOm miševa, ali se još uvijek mogao otkriti u cKOf miševa, iako na znatno nižoj razini. Ova je razlika bila vidljiva kada su bubrežni ekstrakti iz cKOm i cKOf miševa stavljeni na isti SDS-PAGE gel i imunoblotirani zajedno (Slika 1B). I Kim i cKOf miševi bili su sposobni za život, nisu pokazivali očigledne abnormalnosti i imali su normalnu BW u usporedbi s kontrolnim miševima (dodatna tablica 1). Omjeri KW i KW/BW bili su znatno niži kod cKOm miševa u usporedbi s Ctrl miševima, ali ne i kod cKOf miševa u usporedbi s Ctrlf miševima (slike 1, C, odnosno D). Analiza 24--satnih uzoraka urina i plazme nije otkrila učinak genotipa kod miševa oba spola, osim niže razine kalija u plazmi kod cKOm miševa u usporedbi s Ctrl miševima (dodatna tablica 1). Albuminurija je bila odsutna u urinu i cKOm i cKOf miševa (dodatna slika 2A). Nisu primijećene velike morfološke promjene, naslage kalcijevog oksalata ili nakupljanje lipida u bubrezima cKOm miševa (dodatna slika 2, BD).

Elektronska mikroskopska procjena stanica proksimalnih tubula u odraslih cKO miševa. Elektronska mikroskopska procjena kore bubrega otkrila je veliki broj peroksisoma u stanicama proksimalnih tubula Ctrlm i Ctrlf miševa (Slika 2, A, odnosno B). Peroksisomi su bili praktički odsutni u proksimalnim tubulima cKOm i cKOf miševa (Slika 2, Kand D). Stereološki alati korišteni su za kvantitativnu analizu stanica

organele i stanične dimenzije u proksimalnim tubulima Ctrlm i cKOm miševa. Volumna gustoća peroksisoma（broj/μm² citoplazme） i postotak citoplazme koji peroksisomi zauzimaju u stanicama proksimalnih tubula bili su dramatično smanjeni u cKOm miševa (Slika 3, A i B), obrnuto, volumen mitohondrijske gustoće, kao i postotak citoplazme koju zauzimaju mitohondriji u stanicama proksimalnih tubula, bio je povećan u cKOm miševa u usporedbi s Ctrl miševima (Slika 3, C i D, redom). Volumna gustoća i postotak citoplazme koju zauzimaju lizosomi u stanicama proksimalnih tubula nisu se razlikovali između Kim i Ctrlm miševa (Slika 3, E i F, redom). Kao što je prikazano na slici 3G, stanice proksimalnih tubula iz cKOm miševa imale su tendenciju smanjene širine stanica (P= 0.083).

Integrirane transkriptomske i metabolomičke analize sugeriraju duboko reprogramiranje metaboličkih, antioksidativnih i putova sinteze lipida u bubrezima cKO miševa. Integrirano dubinsko sekvenciranje transkriptoma i analiza metaboloma provedeni su kako bi se identificirale molekularne promjene u bubrezima cKO miševa (GSE179202). Usporedbe transkriptoma otkrile su 1350 transkripata različito izraženih u bubrezima Ctrlm i cKOm miševa (Slika 4A i Dodatna tablica 2, FDR< 5%)and="" 121="" transcripts="" differentially="" expressed="" in="" kidneys="" of="" ctrlf="" and="" ckof="" mice="" (figure="" 4b="" and="" supplemental="" table="" 3,="">< 5%).="" 61="" differentially="" expressed="" transcripts="" were="" present="" in="" both="" sexes(figure="" 4c="" and="" supplemental="" figure="" 3).="" enrichment="" analysis="" of="" 100="" genes="" encoding="" proteins="" related="" to="" peroxisomal="" function(kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes="" [kegg]="" pathway="" hsa04146)performed="" on="" transcriptomes="" of="" ctrlm="" and="" ckom="" mice="" revealed="" 52="" transcripts="" either="" up-or="" downregulated="" in="" kidneys="" of="" ckom="" mice="" (figure="" 4d="" and="" supplemental="" figure="" 4).="" gene="" set="" enrichment="" analysis(gsea)="" performed="" on="" the="" kegg="" pathway="" database="" (release="" on="" december="" 11,="" 2020)showed="" downregulation="" of="" pathways="" related="" to="" the="" metabolism="" of="" pyruvate,="" glyoxylate="" and="" dicarboxylate,="" amino="" acids="" (arginine,="" proline,="" cysteine,="" methionine,="" tryptophan,="" alanine,="" and="" histidine),="" or="" glutathione(figure="" 4e="" and="" supplemental="" figure="" 5)="" and="" upregulation="" of="" pathways="" related="" to="" fatty="" acid="" synthesis="" and="" degradation,="" ppar="" signaling,="" and="" abc="" transporters="" (figure="" 4f="" and="" supplemental="" figure="" 6).="" no="" enrichment="" was="" found="" in="" pathways="" linked="" to="" inflammation="" or="" fibrosis.="" targeted="" analysis="" of="" several="" groups="" of="" functionally="" related="" genes="" that="" are="" not="" represented="" in="" kegg="" pathways="" revealed="" substantial="" changes="" in="" the="" expression="" of="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" the="" peroxisomal="" metabolism="" of="" fatty="" acids="" (acsl1/3/4/6,="" acsvl1,="" acot3/4,="" acnat1,="" acox3,="" abcd3,="" ehhadh,="" and="" acaa1b),="" plasmalogen="" biosynthesis="" (far1="" and="" agps),="" bile="" acid="" synthesis(amacr="" and="" hsd17b4),="" and="" reactive="" oxygen="" species="" (ros)="" detoxification(cat="" and="" sod1)="" (supplemental="" figure="" 3).="" alterations="" were="" also="" noted="" in="" the="" expression="" of="" a="" large="" number="" of="" genes="" critical="" for="" membrane="" transport="" processes="" in="" the="" proximal="" tubule,="" thick="" ascending="" limb="" (tal),="" and="" distal="" nephron(supplemental="" figure="" 7="" and="" supplemental="" table="" 4).="" for="" instance,="" in="" the="" proximal="" tubule,="" we="" found="" a="" reduction="" in="" the="" expression="" of="" an="" aquaporin-1="" water="" channel(agp1);="" megalin="" (lrp2);="" phosphate="" transporter="" napi-2a="" (slc34al);="" urate="" transporters="" uratl="" (slc22a12),="" npt1/4="" (sic17al/3),="" and="" oat1="" (slc22a6);="" and="" numerous="" other="" organic="" anion="" and="" amino="" acid="" transporters.="" in="" the="" tal="" and="" distal="" nephron,="" there="" was="" a="" substantial="" increase="" in="" the="" expression="" of="" genes="" encoding="" proteins="" involved="" in="" sodium="" reabsorption:="" nkcc2="" (slc12a1),="" clc-kb="" (clcnkb),="" βenac="" (scnn1b)=""><0.05), and="" ncc="" (slc12a3)(fdr="">

<0.05. (d)="" enrichment="" analysis="" of="" a="" homemade="" gene="" set="" (based="" on="" the="" kegg="" pathway="" mmu04146)="" targeting="" 100="" transcripts="" related="" to="" peroxisomal="" functions,="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" scatter="" plot="" of="" the="" top="" 25="" most="" downregulated="" (e)="" or="" upregulated="" (f)="" metabolic="" pathways="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice,="" based="" on="" an="" untargeted="" gsea="" using="" a="" database="" of="" 543="" kegg="" metabolic="" pathways.="" pathways="" are="" sorted="" by="" their="" absolute="" normalized="" enrichment="" score.="" a="" significant="" pathway="" regulation="" can="" be="" considered="" when="" adjusted="" p="" value="" referred="" to="" as="" "q="" value"="" is=""><0.2" alt="Figure 4. Transcriptional reprogramming in the kidneys of cKO mice. (A and B) Volcano plot representing the relative transcriptional expression of all renal transcripts in cKOm versus Ctrlm (A) or cKOf versus Ctrlf (B). Transcripts depicted in blue are significantly downregulated while transcripts depicted in red are significantly upregulated. (C) Venn diagrams showing the number of transcripts significantly downregulated or upregulated in cKOm (in blue) or cKOf (in pink) mice versus Ctrl mice of the same sex. A significant transcript regulation is considered when the adjusted P value referred to as " fdr"="" is=""><0.05. (d)="" enrichment="" analysis="" of="" a="" homemade="" gene="" set="" (based="" on="" the="" kegg="" pathway="" mmu04146)="" targeting="" 100="" transcripts="" related="" to="" peroxisomal="" functions,="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" scatter="" plot="" of="" the="" top="" 25="" most="" downregulated="" (e)="" or="" upregulated="" (f)="" metabolic="" pathways="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice,="" based="" on="" an="" untargeted="" gsea="" using="" a="" database="" of="" 543="" kegg="" metabolic="" pathways.="" pathways="" are="" sorted="" by="" their="" absolute="" normalized="" enrichment="" score.="" a="" significant="" pathway="" regulation="" can="" be="" considered="" when="" adjusted="" p="" value="" referred="" to="" as="" "q="" value"="" is=""><0.2" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Od ukupno 852 otkrivena metabolita, 207 je pokazalo različitu zastupljenost u bubrezima Ctrlm i cKOm miševa, a 118 je pokazalo različitu zastupljenost u bubrezima Ctrlf i cKOf miševa (dodatna tablica 5, FDR<5%). seventy-nine="" metabolites="" demonstrating="" differential="" abundance="" were="" common="" in="" both="" comparisons(figure="" 5a="" and="" supplemental="" table="" 6).among="" metabolites="" showing="" the="" most="" significant="" differences="" were="" plasmalogens="" and="" sphingomyelins(decreased="" abundance)and="" glutathione-related="" metabolites="" and="" dicarboxylic="" acids="" (increased="" abundance)="" in="" kidneys="" of="" both="" ckom="" and="" ckof="" mice="" (figure="" 5b="" and="" supplemental="" figure="" 8,="" respectively).="" global="" analysis="" of="" metabolome="" confirmed="" that="" plasmalogens="" and="" sphingomyelins="" constituted="" a="" majority="" of="" metabolites="" showing="" a="" decreased="" abundance="" in="" kidneys="" of="" both="" ckom="" and="" ckof="" mice="" (figure="" 5c).lcfa="" dicarboxylates,="" very="" long-chain="" fatty="" acyl-carnitines,="" phosphatidylcholines,="" and="" phosphatidylethanolamines="" were="" present="" among="" metabolites="" with="" increased="" abundance,="" in="" addition="" to="" glutathione-related="" metabolites="" and="" dicarboxylic="" acids(figure="">

<0.05. metabolites="" are="" identified="" by="" their="" biochemical="" name="" and="" sorted="" by="" related="" metabolisms="" and="" subclasses="" of="" metabolites.="" for="" each="" metabolite,="" the="" individual="" expression="" of="" 6="" ctrl="" and="" 6="" cko="" mice="" normalized="" between="" 0="" and="" 1="" and="" the="" log2="" -transformed="" mean="" fold="" change="" of="" expression="" (log2fc)="" in="" cko="" versus="" ctrl="" mice="" are="" given,="" for="" both="" sexes.="" for="" calculation="" of="" the="" mean="" fc="" of="" expression,="" missing="" values="" (depicted="" in="" gray)="" have="" been="" replaced="" by="" the="" minimum="" value="" of="" both="" genotypes="" from="" the="" same="" sex."="" alt="Figure 5. Remodeling of the renal metabolome in cKO mice. (A) Venn diagrams representing the number of detected renal metabolites showing a significantly decreased or increased abundance in cKOm (in blue) or cKOf (in pink) mice versus Ctrl mice of the same sex. (B) Volcano plot representing the relative abundance of all detected metabolites in kidneys of cKOm versus Ctrlm. Metabolites depicted with blue dots are significantly less abundant, and transcripts depicted with red dots are significantly more abundant in kidneys of cKOm mice as compared with Ctrlm mice. The names of some representative metabolites are depicted using colors shared for related metabolites. (C and D) Heatmaps of metabolites showing a significantly decreased (C) or increased (D) abundance in cKO mice of both sexes as compared with Ctrl mice. A significant difference of abundance is considered when adjusted P value from a 2-way ANOVA referred to as " fdr"="" is=""><0.05. metabolites="" are="" identified="" by="" their="" biochemical="" name="" and="" sorted="" by="" related="" metabolisms="" and="" subclasses="" of="" metabolites.="" for="" each="" metabolite,="" the="" individual="" expression="" of="" 6="" ctrl="" and="" 6="" cko="" mice="" normalized="" between="" 0="" and="" 1="" and="" the="" log2="" -transformed="" mean="" fold="" change="" of="" expression="" (log2fc)="" in="" cko="" versus="" ctrl="" mice="" are="" given,="" for="" both="" sexes.="" for="" calculation="" of="" the="" mean="" fc="" of="" expression,="" missing="" values="" (depicted="" in="" gray)="" have="" been="" replaced="" by="" the="" minimum="" value="" of="" both="" genotypes="" from="" the="" same="" sex."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Analiza zajedničkog puta (MetaboAnalyst 5.0) transkripata i metabolita koji pokazuju povećanu ili smanjenu zastupljenost u bubrezima cKOm miševa u usporedbi s Ctrl miševima identificirala je 22 puta reguliranih prema dolje i 7 puta prema gore (Slika 6, A i B, respektivno; FDR<0.1; supplemental="" table="" 7).="" nitrogen="" metabolism,="" pyruvate="" metabolism,="" glycolysis,="" and="" gluconeogenesis="" were="" identified="" among="" the="" downregulated="" pathways="" while="" fatty="" acid="" degradation="" was="" identified="" among="" the="" upregulated="" pathways="" (figure="" 6,="" a="" and="" b,="" respectively).="" glutathione="" metabolism="" and="" retinol="" metabolism="" were="" present="" among="" both="" up-and="" downregulated="" pathways="" (figure="" 6,="" a="" and="" b).="" detailed="" analysis="" of="" transcripts="" and="" metabolites="" related="" to="" glutathione="" metabolism="" identified="" 16="" transcripts="" and="" 3="" metabolites="" with="" decreased="" abundance="" in="" kidneys="" of="" ckom="" mice="" (figure="" 6,="" c="" and="" d,="" respectively),="" along="" with="" 6="" transcripts="" and="" 8="" metabolites="" exhibiting="" increased="" abundance(figure="" 6,="" e="" and="" f,="" respectively).="" the="" oxidized="" form="" of="" glutathione(gssg)was="" present="" in="" ckom="" but="" not="" in="" ctrlm="" mice,="" thereby="" suggesting="" oxidative="" stress="" in="" ckom="" mice(figure="">

<0.1. the="" size="" of="" each="" dot="" depends="" on="" the="" percentage="" of="" all="" transcripts="" and="" metabolites="" ("compounds")="" of="" the="" pathway="" that="" are="" significantly="" affected="" in="" ckom="" mice.="" (c="" and="" d)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (c)="" and="" metabolites="" (d)="" significantly="" less="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (e)="" and="" metabolites="" (f)="" significantly="" more="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" individual="" values="" from="" 6="" ckom="" and="" 6="" ctrlm="" mice="" are="" depicted="" after="" transformation="" from="" raw="" individual="" data:="" values="" of="" metabolite="" abundance="" have="" been="" divided="" by="" the="" median="" value="" of="" both="" genotypes,="" while="" values="" of="" transcript="" expression="" from="" both="" genotypes="" have="" been="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" box="" and="" whiskers="" represent="" the="" mean="" and="" the="" sem,="" respectively.="" nd,="" not="" detected."="" alt="Figure 6. Joint analysis of transcriptional and metabolic changes in cKOm mice. (A and B) Scatter plot of significantly downregulated (A) or upregulated (B) metabolic pathways, based on a joint pathway analysis of both regulated transcripts and modulated metabolites in kidneys of cKOm versus Ctrlm mice. Pathways are sorted by their absolute impact, and a significant pathway regulation is considered when adjusted P value referred to as " fdr"="" is=""><0.1. the="" size="" of="" each="" dot="" depends="" on="" the="" percentage="" of="" all="" transcripts="" and="" metabolites="" ("compounds")="" of="" the="" pathway="" that="" are="" significantly="" affected="" in="" ckom="" mice.="" (c="" and="" d)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (c)="" and="" metabolites="" (d)="" significantly="" less="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (e)="" and="" metabolites="" (f)="" significantly="" more="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" individual="" values="" from="" 6="" ckom="" and="" 6="" ctrlm="" mice="" are="" depicted="" after="" transformation="" from="" raw="" individual="" data:="" values="" of="" metabolite="" abundance="" have="" been="" divided="" by="" the="" median="" value="" of="" both="" genotypes,="" while="" values="" of="" transcript="" expression="" from="" both="" genotypes="" have="" been="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" box="" and="" whiskers="" represent="" the="" mean="" and="" the="" sem,="" respectively.="" nd,="" not="" detected."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Izazov hranjenja bogatim mastima ne dovodi do dodatnog oksidativnog stresa kod ckKO miševa. Promjene u putevima povezanim s glutationom, smanjenje plazmalogena i smanjena ekspresija katalaze upućuju na oksidativni stres i/ili preuređenje različitih antioksidativnih obrambenih sustava u bubrezima cKOm miševa. Kako bismo testirali ove hipoteze, izložili smo cKOm miševe dijetom s visokim udjelom masti (HFD) tijekom 4 tjedna. Ovaj izazov nije rezultirao albuminurijom, već povećanim volumenom mokraće i izlučivanjem kalcija i urata mokraćom. Nije primijećena razlika u testiranim parametrima plazme, uključujući kalcemiju i uricemiju (dodatna tablica 8). Nisu otkrivene velike morfološke promjene ili nakupljanje lipida u bubrezima Ctrlm i cKOm miševa izazvanih HFD-om (Slika 7A). Ukupni i neenzimski antioksidativni kapacitet procijenjen Trolox testom (Slika 7B), kao i razine malondialdehida u tkivu, marker peroksidacije višestruko nezasićenih masnih kiselina (Slika 7C), nisu se razlikovali između tretmana i genotipova. Obilje proizvoda lipidne peroksidacije 4-hidroksinonenala (4-HNE) povećano je u Ctrlm miševa tretiranih HFD-om u usporedbi s Ctrl miševima na kontrolnoj dijeti, ali nije primijećena razlika u cKOm miševima tretiranim s 2 dijete (Slika 7D).