CaWRKY30 pozitivno regulira imunitet paprike ciljanjem CaWRKY40 protiv inokulacije Ralstonia Solanacearum kroz moduliranje gena povezanih s obranom, 2. dio

2.5. CaWRKY30 Prolazna prekomjerna ekspresija stimulirala smrt stanice sličnu HR-u, proizvodnju H2O2 i pojačanu regulaciju transkripcije markerskih gena povezanih s imunitetom

VIGS eksperimenti su pokazali da CaWRKY30 pozitivno regulira otpornost paprike na RSI. Provedeni su eksperimenti s prolaznom prekomjernom ekspresijom infiltracijom GV3101 stanica koje nose 35S:00 (EV) ili 35S: CaWRKY30 u listove paprike za daljnju potvrdu ove spekulacije. Proučavali smo ulogu prolazne prekomjerne ekspresije CaWRKY30 na indukciju stanične smrti slične HR-u i nakupljanje H2O2 u biljkama paprike. Ekspresija CaWRKY30 u biljkama papra utvrđena je Western blotting eksperimentima (Slika 5A).

Stanična smrt slična HR-u i nakupljanje H2O2 potvrđeni su tripan plavim i DAB bojanjem. Rezultati su otkrili da je prolazna prekomjerna ekspresija CaWRKY30 uzrokovala staničnu smrt sličnu HR-u i nakupljanje H2O2 u listovima paprike što se očituje tamnijim tripan plavim bojanjem i tamnosmeđim DAB bojanjem (Slika 5B). Provodljivost je provedena kako bi se proučio intenzitet stanične nekroze uzrokovane prolaznom prekomjernom ekspresijom CaWRKY30, a rezultati su pokazali da listovi paprike s prolaznom prekomjernom ekspresijom CaWRKY30 pokazuju više curenja iona 24 i 48 sati nakon agroinfiltracije u usporedbi s prekomjernom ekspresijom lišća paprike. izražavajući prazan vektor (slika 5C). Relativne razine transkripcijske ekspresije markerskih gena povezanih s obranom, kao što su CaPR1 povezani s ET-biosintezom, CaNPR1 povezani sa SA, CaABR1 koji reagira na ABA i markerski gen CaHIR1 povezan s HR-om detektirane su qRT-PCR analizom.

Naši rezultati su pokazali da je prolazna prekomjerna ekspresija CaWRKY30 u listovima paprike znatno pojačala transkripcijsku akumulaciju CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 i CaHIR1 u paprici u usporedbi s prolaznom prekomjernom ekspresijom praznih vektorskih biljaka paprike pri 48 dpi (Slika 5D). Ovi rezultati pokazuju da CaWRKY30 djeluje kao pozitivni regulator stanične smrti slične biljnoj HR, proizvodnje H2O2 i pojačane transkripcijske regulacije markerskih gena povezanih s imunitetom.

Slika 5. Prolazna prekomjerna ekspresija CaWRKY30 inducirana HR-slična stanična smrt, nakupljanje H2O2 i ekspresija marker gena povezanih s imunitetom u lišću paprike. Uspješna prekomjerna ekspresija CaWRKY30-Flag potvrđena je Western blotting eksperimentom (A), HR-slična stanična smrt izazvana prolaznom prekomjernom ekspresijom 35S: CaWRKY30, potvrđena detekcijom fenotipa, izlaganjem UV svjetlu i Bojanje DAB i Trypan Blue pri 48 hpi; Ljestvica=50 µm (B), Mjerenje istjecanja elektrolita (provodljivost iona) za procjenu reakcije stanične smrti u diskovima lista paprike 24 odnosno 48 h nakon agroinfiltracije (C), qRT-PCR test za provjerite razine transkripcijske ekspresije marker gena povezanih s imunitetom, uključujući CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 i CaHIR1 u 35S: CaWRKY30 eksprimira lišće paprike pri 48 dpi, redom (D). Relativna razina ekspresije poznatih obrambenih marker gena u listovima paprike koji prolazno prekomjerno izražavaju prazan vektor postavljen je na "1". Podaci koji predstavljaju srednje vrijednosti ± SE iz četiri biološka ponavljanja. Stupci pogrešaka standardne su pogreške srednjih vrijednosti. Različita slova iznad stupaca označavaju značajne razlike među srednjim vrijednostima.

2.6. Međuodnos između CaWRKY30 i CaWRKY40

Zabilježeno je da različiti WRKY TF-ovi zajedno tvore mreže, a prethodno smo izvijestili da su različiti članovi WRKY TF-ova, tj. CaWRKY6, CaWRKY22 i CaWRKY40, ekspresivno i funkcionalno povezani jedni s drugima. Stoga pretpostavljamo da bi se CaWRKY30 mogao odnositi na druge članove obitelji WRKY, uključujući CaWRKY40, koji je pozitivan regulator imuniteta paprike protiv RSI. Analiza qRT-PCR provedena je za daljnje ispitivanje moguće povratne regulacije CaWRKY40 pomoću CaWRKY30 i proučavanje potencijalne modulacije CaWRKY30 pomoću CaWRKY40 testa prolazne prekomjerne ekspresije ili utišavanjem CaWRKY40 pomoću VIGS-a.

CaWRKY40 je transkripcijski faktor WRKY uključen u odgovor biljaka na različite biotičke i abiotičke stresove. Studije su pokazale da se CaWRKY40 inducira u rajčicama i može povećati otpornost biljaka na sušu i tretmane na niskim temperaturama. Osim toga, studija je također otkrila da prekomjerna ekspresija CaWRKY40 može poboljšati otpornost rajčica na sušu i ublažiti inhibiciju rasta uzrokovanu stresom od soli, ali otpornost na patogene treba dalje proučavati. Stoga CaWRKY40 igra važnu ulogu u imunološkom odgovoru biljaka i ima određeni potencijal za povećanje poljoprivrednih prinosa. Istovremeno, trebamo paziti i na svoj imunitet. Imunitet našeg tijela je vrlo važan. Cistanche značajno utječe na jačanje imuniteta. Cistanche je bogata raznim antioksidativnim tvarima, kao što su vitamin C, vitamin C, karotenoidi itd. Ovi sastojci mogu hvatati slobodne radikale, smanjiti oksidativni stres i poboljšati otpornost imunološkog sustava.

Click cistanche deserticola dodatak

Naši rezultati pokazuju da su transkripcijske razine CaWRKY30 u listovima paprike s prolaznom prekomjernom ekspresijom CaWRKY40 porasle za 24 i 48 hp u usporedbi s biljkama s prolaznom prekomjernom ekspresijom praznog vektora (EV) (Slika 6A), dok su transkripcijske razine CaWRKY40 u tim biljkama prolazno porasle s prekomjernom ekspresijom CaWRKY30 u usporedbi s biljkama s prolaznom prekomjernom ekspresijom EV (Slika 6B). Nasuprot tome, naši su rezultati pokazali da je transkripcijska akumulacija CaWRKY40 znatno smanjena u CaWRKY30-utišanim biljkama zaraženim Ralstonia u usporedbi s biljkama bez utišavanja (Slika 6C). Osim toga, transkripcijska akumulacija poznatih marker gena povezanih s imunitetom, npr. CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 i CaHIR1, bila je potpuno ili djelomično potisnuta u biljkama utišanim CaWRKY30 koje je pokrenuo CaWRK40 (Slika 6D).

Ovi podaci ukazuju na regulaciju transkripcije CaWRKY40 pomoću CaWRKY30 i prisutnost pozitivne regulacijske petlje koja uključuje CaWRKY30 i CaWRKY40.

Slika 6. Međuodnos između CaWRKY30 i CaWRKY40. Transkripcijski izraz lev. količine CaWRKY40 u listovima paprike s prolaznom prekomjernom ekspresijom CaWRKY30 u vremenskom intervalu od 24 i 48 dpi (A), transkripcijske razine ekspresije CaWRKY30 u listovima paprike s prolaznom prekomjernom ekspresijom CaWRKY40 u vremenskom intervalu od 24 i 48 dpi (B), gRT-PCR analiza razina ekspresije transkripcije CaWRKY40 u CaWRKY30-utišanim i neutišanim biljkama paprike pri 48 dpi (C)gRT-PCR analiza transkripcijskih razina marker gena povezanih s obranom u CaWRKY30-utišanim i neutišane biljke paprike koje prolazno prekomjerno izražavaju 35S: CaWRKY40-HA i 35S:00na 48 hpi (D). Srednja vrijednost podataka plus SE iz četiri biološka ponavljanja. Stupci pogrešaka standardne su pogreške srednjih vrijednosti. Različita slova iznad traka pokazuju značajne razlike među sredstvima.

2.7. Međuodnos između CaWRY30 i CaWRKY6, CaWRKY22 i CaWRKY27

U našim prethodnim studijama otkriveno je da je CaWRKY40 ekspresijsko i funkcionalno povezan s različitim WRKY TF-ovima, kao što su CaWRKY6 i CaWRKY22. Odnos između CaWRKY30 i CaWRKY40 ukazuje na to da je CaWRKY30 moguće povezan s različitim WRKY TF-ovima koji su uključeni u otpornost paprike na RSI. Kako bi se potvrdila ova pretpostavka, provedena je analiza qRT-PCR kako bi se proučio odnos između CaWRKY30 i različitih WRKY TF-ova za koje je ranije objavljeno da sudjeluju u imunitetu paprike protiv RSI, uključujući CaWRKY6, CaWRKY22 i CaWRKY27. Naši rezultati pokazuju da je transkripcijska akumulacija CaWRKY30 pojačana u CaWRKY6, CaWRKY22 i CaWRKY27 s prolazno prekomjernom ekspresijom biljaka paprike pri 48 dpi (Slika 7A), dok je transkripcijska akumulacija CaWRKY6, CaWRKY22 i CaWRKY27 također povećana u listovima paprike s prolaznom prekomjernom ekspresijom CaWRKY30 pri 48 dpi (slika 7B). Naši rezultati qRT-PCR testa upućuju na to da su CaWRKY30 i CaWRKY6, CaWRKY22 i CaWRKY27 ekspresijski i funkcionalno međusobno povezani.

3. Rasprava

Protein WRKY jedna je od najvećih obitelji biljnih transkripcijskih faktora (TF). Poznato je da skupina članova obitelji WRKY TFs, prijavljenih iz Arabidopsis thaliana i Oryza sativa, sudjeluje i igra ključnu ulogu u regulaciji imuniteta biljaka. Zabilježene su značajne funkcionalne varijacije među blisko strukturnim homolozima WRKY [17,48], a funkcije WRKY TF u imunitetu nemodelnih biljaka, kao što je paprika, nedovoljno su istražene.

CaWRKY30, WRKY gen skupine III, funkcionalno je karakteriziran u trenutnoj studiji. Rezultati su pokazali da CaWRKY30 pozitivno regulira imunitet paprike protiv RSl, te je vitalni sastojak WRKY mreže koja se sastoji od CaWRKY6, CaWRKY22CaWRKY27 i CaWRKY40. Upletenost CaWRKY30 u imunitet paprike potvrđuju cis-elementi koji reagiraju na patogene, uključujući TGA element, TGACG-motifIATC-box, TATA-box i W-box koji su prisutni u promotorskoj regiji CaWRKY30. Ova pretpostavka je bila u skladu s regulacijom transkripcijskih razina CaWRKY30 nakon i nakon egzogeno opskrbljenog ETH, ABA i SA [49,50].

Budući da je poznato da su geni potaknuti izloženošću određenom faktoru stresa često uključeni u odgovor na taj stres [51], nagađali smo da bi CaWRKY30 mogao pozitivno regulirati imunitet paprike na RSI. Ovu su spekulaciju poduprli podaci o utišavanju CaWRKY30 od strane VIGS-a i ispitivanje prolazne prekomjerne ekspresije CaWRKY30. Taj smanjeni imunitet zbog gubitka funkcije CaWRKY30 bio je popraćen pojačanim rastom RSI i nižom regulacijom markerskih gena povezanih s imunitetom kao što je CaPR1 ovisan o SA (52CaNPR1 [53], CaDEF1 povezan s JA (54], CaABR1 povezan s ABA [55] ], i HR-povezani CaHIR1 (561. S druge strane, HR-slična stanična smrt i izlučivanje HO potaknuti su prolaznom prekomjernom ekspresijom CaWRKY30 popraćenom transkripcijskom regulacijom markerskih gena povezanih s imunitetom kao što su CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 i CaHIR1. Ovo sugerira ulogu CaWRKY30 kao pozitivnog regulatora stanične smrti slične HR-u i imuniteta paprike protiv RSI. Isto tako, primijećeno je u prethodnim studijama da AtWRKY30, homolog CaWRKY30 u Arabidopsisu, pozitivno regulira im -munitv protiv biotičkih i abiotskih stresova 157, 581. To se može sugerirati da je CaWRKY30 reguliran prema gore nakon infekcije Ralstonia, što dovodi do smanjene osjetljivosti paprike na infekciju bakterijskim patogenom.

Fitohormoni kao što su ET, ABA i SA bitne su signalne molekule uključene u odgovor biljaka na napade patogena i stres visoke temperature. Oni su također uključeni u preslušavanje odgovora biljaka na biotičke i abiotičke stresove [59]. SA potiče otpornost protiv biotrofnih patogena, dok ET igra vitalnu ulogu u imunitetu biljaka protiv nekrotrofnih patogena [60]. Općenito, sinteza SA, ET i JA povezana je s imunitetom izazvanim PAMP-om (PTI) ili imunitetom izazvanim efektorom (ETI). Ovi fitohormoni mogu odigrati svoju ulogu i sinergistički i antagonistički na temelju svojih koncentracija tijekom obrambenog signaliziranja [61]. Sinergistička povezanost između ova tri signalna elementa otkrivena je u PTI, dok je kompenzacijska povezanost otkrivena u ETI [62]. CaWRKY30 je konstantno induciran egzogeno opskrbljenim fitohormonima. Poznati SA, ET i ABA ovisni markerski geni povezani s imunitetom, kao što su CaPR1, CaNPR1, CaDEF1 i CaABR1, smanjeni su utišavanjem CaWRK30; međutim, oni su pojačani prolaznom prekomjernom ekspresijom CaWRKY30 u biljkama papra, pokazujući da CaWRKY30 sudjeluje u sinergistički posredovanoj obrambenoj signalizaciji SA, ET i ABA, što dovodi do PTI.

Analiza cijelog genoma pokazala je uključenost nekoliko WRKY TF-ova u imunitet biljaka [63-65]. Studijama funkcionalne genomike, WRKY1 [66], -11 [67], -17 [67], -18 [68], -22 [69], {{13} } [70], -28 [71], -33 [72], -38 [73], -40 [68], -45 [74], -46 [75], -53 [76], -54 [75], -60 [68], -62 [77], -70 [75] i -75 [78] funkcionalno su karakterizirani u imunitetu Arabidopsis, pozitivno ili negativno regulirajući imunitet. Predloženo je da se ovi WRKY TF-ovi organiziraju u WRKY transkripcijsku mrežu, koja se sastoji od plus ve i –ve povratnih petlji i modula za prosljeđivanje [12]. Međutim, konfiguracija ovih WRKY mreža i dalje je slabo shvaćena.

U ranijim studijama otkrili smo da su CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 i CaWRKY40 pozitivni regulatori imuniteta paprike na RSI [9,44,45], dok je CaWRKY58 negativni regulator [46]. Trenutna studija zaključuje da CaWRKY30 djeluje kao pozitivan regulator u staničnoj smrti paprike sličnoj HR-u i odgovoru paprike na infekciju R. solanacearum. Razine transkripcijske ekspresije CaWRKY30 bile su regulirane prema gore nakon prolazne prekomjerne ekspresije CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 i CaWRKY40. Nasuprot tome, prolazna prekomjerna ekspresija CaWRKY30 povećala je transkripcijsku akumulaciju CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 i CaWRKY40, sugerirajući prisutnost WRKY TF mreža i plus pet povratnih petlji između CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 i CaWRKY40. Pretpostavlja se da su slične plus pet povratne sprege uključene u imunitet biljaka [47]. Ista vrsta plus ve povratne sprege prisutna je među CaWRKY40 i CaWRKY6, CaWRKY40 i CabZIP63, CaWRKY40 i CaCDPK15. U prethodnim studijama, CaWRKY6 [44] i CabZIP63 [16] također je otkriveno da su izravno i transkripcijski uključeni u regulaciju ekspresije CaWRKY40 protiv RSI. Imajući u vidu ove rezultate, može se predložiti da CaWRKY40 mogu koordinirati različiti TF-ovi. Zaključno, ekspresiju CaWRKY40 koreguliraju CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY30 i CabZIP63 nakon RSI, a ekspresiju CaWRKY40 reguliraju CaWRKY6 i CabZIP63, ali ne i CaWRKY30 u papru nakon izlaganja visokoj temperaturi.

4. Materijali i metode

4.1. Biljni materijali i uvjeti rasta

Sjeme paprike sorte 'Mexi' i Nicotiana benthamiana dobiveno je iz Ayub Agriculture Research Institute, Faisalabad, Pakistan. Sjeme paprike i N. benthamiana posađeno je u plastične posude s mješavinom tla [tresetna mahovina i perlit; 2/1 (v/v)] i držan u prostoriji za uzgoj pod kontroliranim uvjetima, tj. temperatura od 25 ◦C, intenzitet svjetlosti 60–70 µmol fotona m−2 s −1 i 70 posto relativne vlažnosti pod 16 sati svjetla/8 h tamni fotoperiod.

4.2. Generiranje vektora

Za generiranje vektora korištena je tehnika kloniranja prolaza. Za konstruiranje satelitskih vektora, CaWRKY30 ORF pune duljine (s terminalnim kodonom ili bez terminalnog kodona) je kloniran u ulazni vektor pDONR207 korištenjem BP reakcije. Nakon toga, ovaj je konstrukt prebačen u odredišne ​​vektore pMDC83, CD3687 (HA-tag), CD3688 (Flag-tag) i Pk7WG2 izvođenjem LR reakcije da se generiraju vektori za substaničnu lokalizaciju, odnosno prekomjernu ekspresiju.

Za konstrukciju vektora za VIGS odabran je fragment od 364 bps u 30 -neprevedenoj regiji (UTR) CaWRKY30, a specifičnost je potvrđena BLAST-om u odnosu na sekvencu genoma u bazi podataka CM334 (http://peppergenome.snu. ac.kr/ (pristupljeno 29. listopada 2021.)) i Zunla-1 (http://peppersequence.genomics.cn/page/species/blast. jsp (pristupljeno 29. listopada 2021.)). Zatim je izvedena BP reakcija da se ovaj fragment klonira u pDONR207/201, nakon što je ovaj konstrukt prenesen u vektor PYL279 izvođenjem LR reakcije.

4.3. Postupci rasta i inokulacije patogena

Izolirali smo kompatibilni virulentni soj R. solanacearum iz biljaka paprike zaraženih Ralstonia iz Dera Ghazi Khana, Pakistan. Metoda s tetrazolijevim kloridom korištena je za pročišćavanje eksudata nadzemnih dijelova vaskularnog tkiva biljaka zaraženih patogenom [9,45]. Izolirani R. solanacearum uzgojen je u SPA mediju u termokontrolnoj tresilici (200 g krumpira, 20 g saharoze, 3 g goveđeg ekstrakta, 5 g triptona i 1 L dvostruko destilirane H2O) pri 200 okretaja u minuti i 28 ◦C za preko noći. Zatim je uzgojeni soj R. solanacearum centrifugiran na 6500 pm i 28 ◦C 10 minuta. Tekući supernatant nakon centrifugiranja je izliven, a peleti na dnu epruvete centrifuge razrijeđeni su u steriliziranoj 10 mM otopini MgCl2. Gustoća bakterijskih stanica podešena je na 108 cfu ml-1 (OD600=0.8).

Za proučavanje učinaka RSI na transkripcijske razine CaWRKY30 i na otpornost biljaka paprike na napad R. solanacearum, gornji treći list biljaka paprike infiltriran je s 10 µL otopine bakterije R. solanacearum štrcaljkom bez igle. Uzorci lišća tretiranog patogenom sakupljeni su u određenim vremenskim točkama za pokuse histokemijskog bojenja (npr. bojanje DAB ili bojenje tripan plavim), električnu vodljivost, cfu i ekstrakciju RNA za više pokusa. Za eksperiment fenotipizacije CaWRKY30-utišanih i neutišanih biljaka, korijenje je ozlijeđeno staklenim štapićem i infiltrirano kompatibilnom virulentnom bakterijom R. solanacearum. Biljke su držane u komori za rast u kontrolnim uvjetima na temperaturi od 28 ± 2 ◦C, intenzitetu svjetlosti 60–70 µmol fotona m−2 s −1, 70 posto relativne vlažnosti i pod 16-svjetlom/{{12 }}h tamni fotoperiod nakon inokulacije R. solanacearum. Slike fenotipa su snimljene nakon RSI u određenim vremenskim intervalima.

4.4. Folijarna primjena fitohormona

Kako bi se proučili učinci fitohormona, zdrave biljke paprike prskane su sa 100 µM ETH, 100 µM ABA i 1 mM SA u četiri faze lista. Lažne (kontrolne) biljke tretirane su sterilnom ddH2O. Uzorci tretirani fitohormonima prikupljeni su u željenim vremenskim točkama za ekstrakciju RNK i daljnje istraživanje.

4.5. Ispitivanje substanične lokalizacije CaWRKY30

Stanice Agrobacterium koje imaju 35S: CaWRKY30-GFP ili 35S: GFP (kontrola) su kultivirane preko noći u LB mediju koji sadrži odgovarajuće antibiotike. Uzgajani medij je centrifugiran na 6500 okretaja u minuti, tekući supernatant je izliven, a talog na dnu je razrijeđen u indukcijskom mediju (10 mM MES, 10 mM MgCl2, pH 5,7 i 150 µM acetosiringona) i podešen na OD{{ 10}}.8. Agrobakterije koje sadrže 35S: CaWRKY30-GFP i 35S: GFP ubrizgane su u lišće N. benthamiana pomoću šprice bez igle. Prethodno opisana metoda korištena je za bojenje 4,6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI) [9]. Na 48 hpt, promatrani su GFP i DAPI fluorescentni signali, a slike su snimljene laserskim skenirajućim konfokalnim mikroskopom (TCS SP8, Leica, Solms, Njemačka), s valnom duljinom ekscitacije od 488 nm i 505-530 nm emisijom pojasa filtar.

4.6. Histokemijsko bojenje

Histokemijsko bojenje (Trypan blue i 3, 30 -diaminobenzidin) provedeno je kako je prethodno opisano [9,11,79]. Za izvođenje testa bojenja tripan plavim, listovi paprike su kuhani u otopini tripan plavog (10 mL mliječne kiseline, 10 mL glicerola, 10 mL fenola, 40 mL etanola, 10 mL ddH2O i 1 mL tripan plavog) 30 minuta. Nakon toga, listovi su držani na sobnoj temperaturi 8 h, uronjeni u otopinu kloral hidrata (2,5 g kloral hidrata otopljeno u 1 mL destilirane vode) i obojeni kuhanjem 30 min. Otopina kloral hidrata promijenjena je više puta kako bi se smanjila pozadina, a zatim su uzorci postavljeni u 70-postotni glicerol. Listovi su stavljeni u 1 mg/mL otopine DAB-a preko noći za DAB test bojenja. Lišće obojeno DAB-om kuhano je u smjesi mliječna kiselina:glicerol:apsolutni etanol [1:1:3 (v/v/v)] i zatim uklonjeno bojanje u apsolutnom etanolu preko noći [80]. Slike lišća obojenog tripan plavim i DAB-om snimljene su kamerom i svjetlosnim mikroskopom (Leica, Wetzlar, Njemačka).

4.7. Utišavanje CaWRKY30 putem utišavanja gena izazvanog virusom (VIGS)

Prethodno opisan sustav utišavanja gena (VIGS) temeljen na virusu duhanske čegrtaljke (TRV) proveden je za utišavanje CaWRKY30 u biljkama paprike [47,81,82]. Agrobacterium GV3101 koji sadrži konstrukte PYL192, PYL279-CaWRKY30, PYL279 i PYL279-PDS (OD600=0.8) pomiješani su u omjeru 1:1. Ova je mješavina infiltrirana u 2-supke biljaka paprike stare tjedan dana štrcaljkom bez igle. Infiltrirane biljke su inkubirane u komori za rast 56 h u mraku na temperaturi od 16 ◦C i 45 posto relativne vlažnosti, a zatim su prebačene u prostoriju za rast u kontroliranim uvjetima na 25 ± 2 ◦C, 60-70 µmol fotona m-2 s −1 i relativnom vlagom od 70 posto u fotoperiodu od 16 h svjetla/8 h mraka.

4.8. CaWRKY30 Prolazna prekomjerna ekspresija u lišću paprike

Stanice Agrobacterium GV3101 koje sadrže CaWRKY30-Flag i EV kultivirane su u LB mediju u termokontrolnoj mućkalici, uz odgovarajuće antibiotike preko noći do OD600=1.0. Nakon toga, ove Agrobacterium GV3101 su centrifugirane na 6000 pm i 28 ◦C tijekom 10 minuta. Nakon centrifugiranja, tekući supernatant je uklonjen i kruti talog na dnu je razrijeđen do OD600=0.8 u indukcijskom mediju (10 mM MES, pH5.4, 10 mM MgCl2, 200 µM acetosiringona). Ova smjesa je infiltrirana u listove štrcaljkom bez igle. Ovi prolazno prekomjerno eksprimirani listovi promatrani su za staničnu smrt sličnu HR-u ili su prikupljeni uzorci za izvođenje pokusa bojenja DAB i tripan plavim, te za izolaciju RNA za više pokusa.

4.9. Ekstrakcija RNA i kvantitativna RT-PCR u stvarnom vremenu

Metoda TRIzol reagensa (Invitrogen) korištena je za ekstrahiranje ukupne RNA iz uzoraka lišća tretiranih biljaka paprike i lažnih sadnica. Nakon toga, Prime Script RT-PCR kit (TaKaRa, Dalian, Kina) korišten je za reverznu transkripciju ekstrahirane RNA. Provedena je qRT-PCR analiza u stvarnom vremenu kako bi se proučile relativne razine transkripcije ciljanih marker gena. Obrada podataka učinjena je prema prethodno opisanim metodama [45,82], sa specifičnim početnicama (dodatna tablica S3), korištenjem uputa proizvođača za Bio-Rad Real-time PCR sustav (Bio-Rad, Foster City, CA, SAD) i SYBR premix Ex Taq II sustav (TaKaRa Perfect Real Time).

4.10. Procjena ELEKTRIČNE vodljivosti

Električna vodljivost (curenje iona) izračunata je pomoću prethodno opisane metode s malim promjenama [44,83]. Šest diskova s ​​listovima (širine 4 mm) dobiveno je pomoću bušilice. Diskovi su isprani tri puta sa steriliziranom ddH2O i trenutno inkubirani u 10 mL ddH2O. Nakon toga, ovi lisni diskovi su držani u tresilici (60 okretaja u minuti) na sobnoj temperaturi 1 h. Konduktometar (Mettler Toledo 326 Mettler, Zurich, Švicarska) korišten je za bilježenje podataka o električnoj vodljivosti.

4.11. Imunološko upijanje

Prethodno opisani postupak pufera za ekstrakciju proteina korišten je za ekstrakciju proteina iz listova paprike [3]. Ekstrahirani protein je inkubiran preko noći s antiHA agarozom na 4 ◦C (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Magnetic crack korišten je za prikupljanje kuglica i ispran tri puta s Tris puferom fiziološkom otopinom (TBS) i tweenom 20 (0,05 posto). Eluirani protein promatran je korištenjem imunoblotinga i anti-HA-peroksidaze (Abcam, Cambridge, UK).

5. Zaključci

Zaključno, mišljenja smo da CaWRKY30 transkripcijski aktivira imunitet paprike protiv RSI. Utišavanje CaWRKY30 pomoću VIGS-a smanjilo je imunitet biljaka paprike na infekciju bakterijskim patogenom, dok je prolazna prekomjerna ekspresija CaWRKY30 izazvala otpornost na R. solanacearum. Zajedno, formiranje pozitivne povratne sprege i njezina funkcija paralelna s drugim TF-ovima dovoljan je dokaz njegove aktivacije pod biotičkim stresom. Dodatno, predlažemo stvaranje CaWRKY30 stabilnih transgenih biljaka paprike i ciljnog proteina CaWRKY30 kako bi se sveobuhvatno objasnila uloga ovog gena protiv bakterijskih patogena i također u različitim metaboličkim putevima.

Doprinosi autora:

Konceptualizacija, AH, MIK, MA, BSA, ZL i ATKZ; Održavanje podataka, AH, MIK i AME-S.; Formalna analiza, ZL i SF; Prikupljanje sredstava, AH, MIK, MAAA, MA, BSA, AME-S. i ATKZ; Administracija projekta, AH i MIK; Resursi, AH; Validacija, SM; Vizualizacija, SM i SF; Pisanje—izvorni nacrt, AH i MIK; Pisanje—recenzija i uređivanje, IRN, MAAA, MA, BSA, AME-S., ZL, SF i ATKZ Svi su autori pročitali i složili se s objavljenom verzijom rukopisa.

Financiranje:

Glavni autor je duboko zahvalan Pakistanskoj komisiji za visoko obrazovanje na financijskoj pomoći za završetak ove studije u okviru SRGP potpore br. 21-2651/SRGP/HRD/HEC/2020. Trenutačni rad financirao je projekt podrške istraživača Sveučilišta Taif broj (TURSP2020/245), Sveučilište Taif, Taif, Saudijska Arabija. Studiju je također podržao Projekt razvojnog fonda Sveučilišta za poljoprivredu i šumarstvo Fujian (CXZX2018114, CXZX2020008A i CXZX2019024G).

Izjava institucionalnog odbora za reviziju: Nije primjenjivo.

Izjava o informiranom pristanku: Nije primjenjivo.

Izjava o dostupnosti podataka: Svi podaci nalaze se u rukopisu i njegovim dopunskim datotekama.4

Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Reference

1. Arif, M.; Atta, S.; Bashir, MA; Khan, MI; Hussain, A.; Shahjahan, M.; Alwahibi, MS; Elshikh, MS Utjecaj vremena primjene FosetylAluminiuma na suzbijanje karnal bunta i ekonomske povrate krušne pšenice (Triticum aestivum L.). PLoS ONE 2021, 16, e0244931.

2. Khalofah, A.; Khan, MI; Arif, M.; Hussain, A.; Ullah, R.; Irfan, M.; Mahpara, S.; Shah, RU; Ansari, MJ; Kintl, A. Duboko unošenje dušikovih gnojiva poboljšava prinos, učinkovitost korištenja dušika i ekonomske povrate presađene fine riže. PLoS ONE 2021, 16, e0247529. [CrossRef] [PubMed]

3. Noman, A.; Hussain, A.; Adnan, M.; Khan, MI; Ashraf, MF; Zainab, M.; Khan, KA; Ghramh, HA; He, S. Novi transkripcijski faktor MYB CaPHL8 daje naznake o evoluciji imuniteta paprike protiv patogena koji se prenose iz tla. Microb. Pathog. 2019, 137, 103758. [CrossRef] [PubMed]

4. Hussain, A.; Noman, A.; Khan, MI; Zaynab, M.; Aqeel, M.; Anwar, M.; Ashraf, MF; Liu, Z.; Raza, A.; Mahpara, S. Molekularna regulacija urođenog imuniteta papra i tolerancije na stres: Pregled WRKY TF-ova. Microb. Pathog. 2019, 135, 103610. [CrossRef] [PubMed]

5. Reboledo, G.; Agorio, Ad; Vignale, L.; Batista-García, RA; de León, IP Transkripcijsko profiliranje otkriva očuvane obrambene reakcije biljaka specifične za vrstu tijekom interakcije Physcomitrium patens s Botrytis cinerea. Biljka Mol. Biol. 2021., 1–21. [CrossRef]

6. Aerts, N.; Mendes, MP; van Wees, SC Višestruke razine preslušavanja u hormonskim mrežama koje reguliraju obranu biljaka. Plant J. 2021, 105, 489–504. [CrossRef] [PubMed]

7. Liu, Z.; Shi, L.; Weng, Y.; Zou, H.; Li, X.; Yang, S.; Qiu, S.; Huang, X.; Huang, J.; Hussain, A. ChiIV3 djeluje kao nova meta WRKY40 za posredovanje imuniteta paprike protiv infekcije Ralstonia solanacearum. Mol. Interakcija biljaka i mikroba. 2019, 32, 1121–1133. [CrossRef] [PubMed]

8. ul Haq, MI; Maqbool, MM; Ali, A.; Farooq, S.; Khan, S.; Saddiq, MS; Khan, KA; Ali, S.; Khan, MI; Hussain, A. Optimiziranje geometrije sadnje za sustav međuusjeva ječma i egipatske djeteline u polusušnoj suptropskoj klimi. PLoS ONE 2020, 15, e0233171.

9. Hussain, A.; Li, X.; Weng, Y.; Liu, Z.; Ashraf, MF; Noman, A.; Yang, S.; Ifnan, M.; Qiu, S.; Yang, Y. CaWRKY22 djeluje kao pozitivan regulator u odgovoru paprike na Ralstonia solanacearum stvarajući mreže s CaWRKY6, CaWRKY27, CaWRKY40 i CaWRKY58. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1426. [CrossRef] [PubMed]

10. Mukhtar, MS; Liu, X.; Somssich, IE Razjašnjavanje uloge WRKY27 u muškoj sterilnosti kod Arabidopsis. Biljni signal. ponašaj se 2018, 13, e1363945. [CrossRef] [PubMed]

11. Khan, MI; Zhang, Y.; Liu, Z.; Hu, J.; Liu, C.; Yang, S.; Hussain, A.; Ashraf, MF; Noman, A.; Shen, L. CaWRKY40b u papru djeluje kao negativni regulator u odgovoru na Ralstonia solanacearum izravno modulirajući obrambene gene uključujući CaWRKY40. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1403. [CrossRef] [PubMed]

12. Eulgem, T.; Somssich, IE Mreže WRKY faktora transkripcije u obrambenoj signalizaciji. Curr. Opin. Plant Biol. 2007., 10, 366–371. [CrossRef] [PubMed]

13. Bakshi, M.; Oelmüller, R. WRKY transkripcijski faktori: majstor mnogih zanata u biljkama. Biljni signal. ponašaj se 2014, 9, e27700. [CrossRef] [PubMed]

14. Xu, Y.-P.; Xu, H.; Wang, B.; Su, X.-D. Kristalne strukture N-terminalnih WRKY transkripcijskih faktora i DNA kompleksa. Protein Cell 2020, 11, 208–213. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, X.; Li, C.; Wang, H.; Guo, Z. WRKY faktori transkripcije: Evolucija, vezanje i djelovanje. Phytopathol. Res. 2019, 1, 13. [CrossRef]

16. Shen, L.; Liu, Z.; Yang, S.; Yang, T.; Liang, J.; Wen, J.; Liu, Y.; Li, J.; Shi, L.; Tang, Q. Pepper CabZIP63 djeluje kao pozitivni regulator tijekom Ralstonia solanacearum ili izazova visoke temperature – visoke vlažnosti u petlji pozitivne povratne sprege s CaWRKY40. J. Exp. Bot. 2016, 67, 2439–2451. [CrossRef] [PubMed]

17. Schluttenhofer, C.; Yuan, L. Regulacija specijaliziranog metabolizma WRKY transkripcijskim faktorima. Plant Physiol. 2015, 167, 295–306. [CrossRef] [PubMed]

18. Jiang, J.; Ma, S.; Da, N.; Jiang, M.; Cao, J.; Zhang, J. WRKY transkripcijski faktori u odgovorima biljaka na stres. J. Integr. Plant Biol. 2017., 59, 86–101. [CrossRef]

19. Yu, K.; Pieterse, CM; Bakker, PA; Berendsen, RL Korisni mikrobi koji idu pod zemlju imuniteta korijena. Okruženje biljnih stanica. 2019, 42, 2860–2870. [CrossRef]

20. Noman, A.; Liu, Z.; Yang, S.; Shen, L.; Hussain, A.; Ashraf, MF; Khan, MI; He, S. Ekspresija i funkcionalna procjena CaZNF830 tijekom reakcije paprike na Ralstonia solanacearum ili visoke temperature i vlažnosti. Microb. Pathog. 2018, 118, 336–346. [CrossRef] [PubMed]

22. Noman, A.; Hussain, A.; Ashraf, MF; Khan, MI; Liu, Z.; He, S. CabZIP53 je meta CaWRKY40 i djeluje kao pozitivan regulator u obrani paprike od Ralstonia solanacearum i termotolerancije. Okolina. Exp. Bot. 2019, 159, 138–148. [CrossRef]

22. Ashraf, MF; Yang, S.; Wu, R.; Wang, Y.; Hussain, A.; Noman, A.; Khan, MI; Liu, Z.; Qiu, A.; Guan, D.; et al. Capsicum annuum HsfB2a pozitivno regulira odgovor na infekciju Ralstonia solanacearum ili visoku temperaturu i visoku vlažnost stvarajući transkripcijsku kaskadu s CaWRKY6 i CaWRKY40. Plant Cell Physiol. 2018, 59, 2608–2623. [CrossRef] [PubMed]

23. Wang, L.; Dossa, K.; Ti, J.; Zhang, Y.; Li, D.; Zhou, R.; Yu, J.; Wei, X.; Zhu, X.; Jiang, S.; et al. Sekvenciranje vremenskog transkriptoma visoke razlučivosti razotkriva ERF i WRKY kao glavne igrače u regulatornim mrežama na kojima se temelji odgovor sezama na natapanje i oporavak. Genomika 2021, 113, 276–290. [CrossRef]

24. Yang, X.; Zhou, Z.; Fu, M.; Han, M.; Liu, Z.; Zhu, C.; Wang, L.; Zheng, J.; Liao, Y.; Zhang, W.; et al. Identifikacija gena obitelji WRKY na cijelom transkriptomu i profiliranje njihove ekspresije prema salicilnoj kiselini u Camellia japonica. Biljni signal. ponašaj se 2021, 16, 1844508. [CrossRef] [PubMed]

26. Pervez, M.; Babar, M.; Iqbal, J.; Hasnain, M.; Abbas, S.; Shah, S.; Ashraf, M. In Silico strukturna i funkcionalna analiza gena Wrky1 i Wrky3 u odabranim usjevima žitarica. J. Anim. Plant Sci.-JAPS 2021, 31, 322–341.

26. Liu, Z.-Q.; Liu, Y.-Y.; Shi, L.-P.; Yang, S.; Shen, L.; Yu, H.-X.; Wang, R.-Z.; Wen, J.-Y.; Tang, Q.; Hussain, A.; et al. SGT1 je potreban u PcINF1/SRC2-1-induciranom obrambenom odgovoru papra interakcijom sa SRC2-1. Sci. Rep. 2016, 6, 21651. [CrossRef] [PubMed]

27. Srinivasan, K. Biološke aktivnosti crvene paprike (Capsicum annuum) i njezinog ljutog principa kapsaicina: pregled. krit. Rev. Food Sci. Nutr. 2016, 56, 1488–1500. [CrossRef] [PubMed]

29. Liu, Z.; Shi, L.; Yang, S.; Lin, Y.; Weng, Y.; Li, X.; Hussain, A.; Noman, A.; He, S. Funkcionalna i promotorska analiza ChiIV3, kitinaze biljke papra, kao odgovor na infekciju Phytophthora capsici. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 1661. [CrossRef] [PubMed]

30. Ali, M.; Luo, D.-X.; Khan, A.; Haq, SU; Gai, W.-X.; Zhang, H.-X.; Cheng, G.-X.; Muhamed, I.; Gong, Z.-H. Klasifikacija i genomska analiza obitelji gena za proteine ​​koji vežu hitin u papru (Capsicum annuum L.) i regulacija transkripcije na Phytophthora capsici, abiotski stresovi i hormonske primjene. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 2216. [CrossRef] [PubMed]

30. Noman, A.; Liu, Z.; Aqeel, M.; Zainab, M.; Khan, MI; Hussain, A.; Ashraf, MF; Li, X.; Weng, Y.; He, S. Osnovni faktori transkripcije leucinske zipper domene: Predvodnici u biljnom imunitetu. biotehnologija. Lett. 2017., 39, 1779–1791. [CrossRef] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com