Miševi s uvjetnim nokautom karboksipeptidaze E pokazuju nedostatke u učenju i pamćenju i neurodegeneraciju 1. dio
Nov 23, 2023
Karboksipeptidaza E (CPE) je multifunkcionalni protein s mnogo neenzimskih funkcija u različitim sustavima. Prethodne studije koje su koristile CPE nock-out miševe pokazale su da CPE ima neuroprotektivne učinke protiv stresa i da je uključen u učenje i pamćenje.
Otpornost na stres i pamćenje dva su neodvojiva aspekta. Bilo da se radi o poslu, studiju ili životu, suočit ćemo se sa svim vrstama pritiska. Ponekad nas ti stresovi mogu učiniti depresivnima, tjeskobnima, umornima, pa čak i utjecati na naše pamćenje. U ovom slučaju, moramo pronaći neke načine da poboljšamo otpornost na stres i pamćenje.
Prvo, poboljšanje tolerancije na stres može se postići vježbanjem. Istraživanja pokazuju da tjelovježba može pomoći ljudima u smanjenju tjeskobe i depresije. Osim toga, odgovarajuća tjelovježba također može pospješiti metabolizam, poboljšati san i poboljšati fizičku kondiciju. Sve to pomaže poboljšati našu toleranciju na stres i pamćenje.
Drugo, psihološko savjetovanje također je učinkovito sredstvo za poboljšanje otpornosti na stres. Kada naiđete na poteškoće i neuspjehe, odmah komunicirajte s obitelji ili prijateljima kako biste se oslobodili svojih unutarnjih loših emocija i smanjili psihičko opterećenje, kako biste se lakše mogli suočiti s pritiscima i izazovima.
Osim toga, dobre navike spavanja također su ključne za poboljšanje pamćenja i otpornosti na stres. Loš san može dovesti do fizičkog umora, depresije i gubitka pamćenja. Stoga moramo razviti dobre navike spavanja, osigurati dovoljno vremena za spavanje svake noći i osigurati kvalitetu sna.
Konačno, pozitivan stav je također ključan. Morate zadržati dobar stav, nastaviti učiti i poboljšavati svoje vještine, aktivno se suočavati s izazovima, zadržati optimističan stav kada se suočavate s poteškoćama i vjerovati da možete nadvladati pritisak i postići uspjeh.
Ukratko, otpornost na stres i pamćenje dva su blisko povezana aspekta. Vježbanjem, psihološkim savjetovanjem, dobrim navikama spavanja i pozitivnim stavom možemo učinkovito poboljšati sposobnost podnošenja stresa i pamćenja te se bolje nositi s raznim izazovima u životu i radu. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje jer je Cistanche deserticola tradicionalni kineski ljekoviti materijal koji ima mnogo jedinstvenih učinaka, a jedno od njih je i poboljšanje pamćenja. Djelotvornost mljevenog mesa dolazi od raznih aktivnih sastojaka koje sadrži, uključujući kiseline, polisaharide, flavonoide itd. Ovi sastojci mogu na različite načine promicati zdravlje mozga.
Kliknite na 10 načina za poboljšanje pamćenja
Međutim, funkcije CPE u neuronima još uvijek su uglavnom nepoznate. Ovdje smo koristili Camk2a-Cre sustav za uvjetno nokautiranje CPE neurona. Divlji tip, CPEflox/− i CPEflox/flox miševi odbijeni su od sise, označeni su im ušne markice i podrezani repovi za genotipizaciju u dobi od 3 tjedna, a podvrgnuti su testovima otvorenog polja, prepoznavanja objekata, Y-labirintu i testovima uvjetovanja straha u dobi od 8 godina tjedana stara.
CPEflox/flox miševi imali su normalnu tjelesnu težinu i metabolizam glukoze. Testovi ponašanja pokazali su da CPEflox/flox miševi imaju oslabljeno učenje i pamćenje u usporedbi s divljim tipom i CPEflox/- miševima. Iznenađujuće, subikulum (Sub) regija CPEflox/flox miševa bila je potpuno degenerirana, za razliku od CPE full knockout miševa, koji pokazuju neurodegeneraciju CA3 regije. Osim toga, imunološko bojenje dvostrukim kortinom sugeriralo je da je neurogeneza u dentatnom girusu hipokampusa značajno smanjena u CPEflox/flox miševa.
Zanimljivo je da je TrkBfosforilacija u hipokampusu bila smanjena u CPEflox/flox miševa, ali razine neurotrofnih faktora izvedenih iz mozga nisu. U hipokampusu i dorzalnom medijalnom prefrontalnom korteksu, primijetili smo smanjenu ekspresiju MAP2 i GFAP u CPEflox/flox miševa. Sve zajedno, rezultati ove studije pokazuju da specifični neuronski CPE nokaut dovodi do disfunkcije središnjeg živčanog sustava kod miševa, uključujući nedostatke učenja i pamćenja, subdegeneraciju hipokampusa i oslabljenu neurogenezu.
UVOD
Karboksipeptidaza E (CPE), također poznata kao neurotrofni faktor- 1, višenamjenski je protein s mnogim bitnim neenzimskim funkcijama u endokrinom i živčanom sustavu [1]. CPE je obogaćen zrelim sekretornim vezikulama i igra ključnu ulogu u biosintezi peptidnih hormona i neuropeptida [2]. CPE također djeluje kao receptor za razvrstavanje mnogih proproteina, uključujući proinzulin, proenkefalin, proopiomelanokortin i pro-moždani neurotrofni faktor (pro-BDNF) [3].
Prirodna mutacija fenotipa pretilosti kod miša, nazvana "masno", mapirana je na CPE gen [4]. Naknadna studija pokazala je da CPEfat/fat i CPE-nockout (KO) miševi pokazuju slične fenotipove, uključujući neplodnost i pretilost kod odraslih [5]. Zabilježeno je da ljudski CPE gen ima mutacije, uključujući nulte mutacije, mutacije koje daju skraćene proteine i one s eliminiranim ključnim katalitičkim ostacima [6].
Homozigotne osobe s teškim mutacijama su morbidno pretile i imaju hipogonadizam. Osim toga, CPE missense polimorfizam je pronađen u pacijenata s dijabetesom tipa 2. Mutacija mijenja aktivnost enzima CPE, a pacijenti pokazuju rani početak dijabetesa tipa 2 [7]. Nadalje, CPE igra važnu ulogu u vezikularnom transportu, kao što je prikazano u hipokampalnim neuronima i sinapsama [8].
Prethodne studije pokazale su da su visoke razine CPE-a izražene u hipokampusu i imaju neurotrofičku ulogu neovisno o njegovoj enzimskoj aktivnosti u zaštiti od smrti piramidalnih neurona izazvanih stresom i kognitivnog oštećenja [9, 10]. Stres narušava strukturu i funkciju niza područja mozga [11].
Prefrontalni korteks (PFC) glavna je neuropatološka meta stresa, koji je povezan s brojnim kortikalnim i subkortikalnim regijama i doprinosi kognitivnim funkcijama [12, 13]. Dorzalni medijalni PFC (dmPFC) uključuje rostralanteriorni cingularni korteks i prelimbički korteks, koji su regije uključene u modulaciju boli, emocija i kognicije. Pokazalo se da funkcionalna inaktivacija dmPFC-a izaziva negativne emocije i smanjuje kognitivne sposobnosti [14]. Aktivnost dmPFC neurona prenosi informacije o prošlim izborima i ishodima, a dmPFC uklanjanje ili inaktivacija oštećuje smjernice [15].
Uz to, stres dovodi do oštećenja neuronskih mreža, kognitivne disfunkcije, degeneracije hipokampusa i smanjene neurogeneze [10]. Piramidni neuroni u dmPFC-u i hipokampusu pokazuju atrofiju pod stresom, a psihosocijalni stres i stres sputavanja proizvode atrofiju unutar otprilike 3-4 tjedna [11, 16]. Morfološke promjene variraju ovisno o regiji mozga. Kronični stres dovodi do retrakcije dendrita i smanjuje spinalnu gustoću u prelimbičkom području dmPFC-a i hipokampusa [17].
Smanjenje složenosti apikalnog dendrita hipokampusa izazvano stresom u skladu je s oštećenim funkcijama hipokampusa, poput učenja i pamćenja [18]. Osim toga, ozljeda neurona i apoptoza u CA3 regiji dovode do manjka prostornog pamćenja [19]. S obzirom na ponašanje, utvrđeno je da stres oštećuje različite funkcije ovisne o hipokampusu, kao što je pamćenje [20].
CPE se modulira pod različitim vrstama stresa i važan je u zaštiti neurona. Neuroni u hipokampusu i korteksu pojačavaju ekspresiju CPE nakon ishemijskog stresa, što je povezano s preživljavanjem neurona [21].
Osim toga, nakon CPEknockout (KO) miševi su primili paradigmu stresa kada su odbijeni od sise u dobi od 3 tjedna, pokazali su degeneraciju CA3 regije i smanjenu neurogenezu u dentatnom girusu (DG) [1, 22].
U ovoj studiji koristili smo uobičajeni Camk2aCre sustav specifičan za neurone za brisanje CPE neurona. Generirali smo CPE uvjetni KO (cKO) mišji model za proučavanje fenotipa gubitka funkcije CPE u neuronima mozga. Procijenili smo učinak paradigme stresa (odbijen od sise, obilježen ušima i podrezan rep) u dobi od 3 tjedna na CPE-cKO miševima. Koristili smo testove prepoznavanja predmeta, Y labirinta i testove kondicioniranja straha u dobi od 8-10 tjedana kako bismo procijenili kognitivne performanse. Osim toga, analizirali smo fenotipove neurona i astrocita, kao i neurogenezu u hipokampusu.
METODE
Životinje
Camk2a-Cre miševi i CPEflox/flox miševi dobiveni su od CyagenBiosciences (Suzhou, Kina). Sve su životinje bile smještene na sobnoj temperaturi (22 stupnja ± 2 stupnja) s ciklusom prirodnog svjetla/tame i omogućen je slobodan pristup čistoj vodi i standardnoj hrani za glodavce. Camk2a-Cre i CPEflox/flox miševi nazivaju se CPE-cKO miševi. U dobi od 3 tjedna, miševi su odbijeni od sise, stavljene su im ušne markice i podrezani su im repovi radi genotipizacije, što je izazvalo paradigmu emocionalnog i fizičkog stresa. Pozivamo se na Camk2a-Cre; CPEflox/flox miševi kao CPEcKO, Camk2a-Cre; CPEflox/− miševi kao heterozigoti (HE), a CPE−/− miševi kao divlji tip (WT). Sve eksperimentalne postupke na životinjama odobrio je Odbor za etiku eksperimentalnih životinja na Sveučilištu Minzu u Kini.
Lančana reakcija polimerazom (PCR)
Odrezani repovi su prikupljeni da se izolira DNK za PCR da se identificira genotip. Nizovi primera su sljedeći:
Tjelesna težina
WT, CPEflox/− i CPEflox/flox miševi (1-20 tjedana starosti; n=10 za svaki genotip) vagani su svaki tjedan, što je korišteno za određivanje promjena težine. Težina svakog miša je prosječna za svaku skupinu.
Glukoza u plazmi
Venska krv iz mišjih repova prikupljena je i otkrivena sustavom za praćenje glukoze u krvi (Yuwell, Kina) nakon 12 sati natašte. Uzorci krvi izvađeni su iz kaudalne vene na 0 min za glukozu u plazmi natašte. Zatim je svakom mišu intraperitonealno ubrizgana otopina glukoze od 1 g/kg. Zatim smo odredili glukozu u plazmi za 15, 30, 60, 90 i 120 minuta kako bismo izmjerili razinu glukoze u krvi.
Testovi ponašanja
Kako bi se procijenilo ponašanje WT, CPEflox/− i CPEflox/flox miševa, životinje stare 8–10- tjedana podvrgnute su testovima otvorenog polja, prepoznavanja objekata, Y labirintu i testovima kondicioniranja straha.
Otvoreno polje
Istraživačko ponašanje mjereno je pomoću aparata otvorenog polja (50 × 50 × 40 cm). Svaka životinja je postavljena u jedan kut aparata i mjerena 7 minuta. Prijeđena udaljenost zabilježena je zadnjih 5 minuta pomoću sustava za video snimanje (Taimeng, Chengdu, Kina).
Prepoznavanje predmeta
Test prepoznavanja objekata korišten je za testiranje učenja i pamćenja kod miševa. Na dan treninga dva identična objekta postavljena su na dijagonalu aparata (50 × 50 × 40 cm). Životinje su puštene da slobodno istražuju 7 minuta. Za postupak testiranja, jedan objekt je zamijenjen novim objektom na istoj dijagonali kao dan obuke. Životinjama je dopušteno slobodno istraživati 7 minuta. Vrijeme istraživanja na 2-3 cm oko novog objekta zabilježeno je zadnjih 5 minuta.
Y labirint
Istraživačka aktivnost i radna memorija mjereni su Y-labirintom (duljina kraka: 30 cm, širina kraka: 6 cm, visina stijenke: 15 cm). Svaka životinja je postavljena u središnje područje. Broj i promjene ulazaka u krakove bilježeni su 7 minuta pomoću sustava za video snimanje (Taimeng, Chengdu, Kina). Rezultat je izračunat kao ispravan broj alteracije/ukupni ulazni broj kraka.
Uvjetovanje straha
Kondicioniranje straha sastojalo se od dvije komore, a zamrzivač (23 × 23 × 30 cm) postavljen je u veću zvučno izoliranu prostoriju (30 × 30 × 37 cm). Kutija za praćenje zamrzavanja sadržavala je metalnu rešetku za šok stopala, a zabilježeni su okomiti i vodoravni pokreti životinja. Prvi dan je bio trening uvjetnih refleksa. Postupak je bio sljedeći: mirovanje 60 s, a zatim stimulacija 12 puta.
Sadržaj stimulacije uključivao je uvjetovani podražaj od 30 s (75 dB), nakon kojeg je slijedio interval traga (30 s), a završavao je udarom stopala od 2 s (30 mA) i 15 s mirovanja. Šest sati kasnije, proveden je test kratkoročnog pamćenja, a broj podražaja smanjen je na 6. Tijekom procesa stimulacije, svaki pokušaj se sastojao od uvjetovanog podražaja nakon kojeg je slijedio interval traga (30 sekundi) i završio je bez isporuke šoka stopala.
Ispitivanje dugoročnog pamćenja obavljeno je sljedeći dan u razmaku od jednog dana. Metoda je bila ista kao ona za kratkoročno pamćenje za mjerenje kvalitete dugoročnog pamćenja.
For more information:1950477648nn@gmail.com
