Biokemijski i histopatološki odgovori Biomphalaria Alexandrina na RIPEX (regulator rasta biljaka)Ⅰ

Sažetak

Pozadina

Regulatori rasta biljaka naširoko se koriste u poljoprivredi za povećanje rasta i sazrijevanja biljaka, ali ugrožavaju vodeni ekosustav. Trenutna studija procijenila je učinak subletalne izloženosti koncentracijama RIPEX 48 posto EC (8 i 16 µL/L) na parametre oksidativnog stresa, spolne hormone, enzime imunološkog potencijala, različiti broj hemocita i histopatologiju probavnih žlijezda i ovotestisa u Biomphalaria alexandrina puževi.

Kliknite za cistanche herba za testosteron

Rezultati

Izloženost RIPEX-u uzrokovala je ukupni porast aktivnosti superoksid dismutaze i glutation-S-transferaze u B. Alexandrina. Međutim, ekstremna izloženost RIPEX-u inhibira aktivnost SOD u puževima. Aktivnost malondialdehida pokazala je povećanje B. Alexandrina izloženog objema koncentracijama nakon svih razdoblja izlaganja. RIPEX je također izazvao značajno povećanje testosterona u puževa izloženih 16 µL/L, međutim, smanjio je razinu hormona u puževa izloženih 8 µL/L nakon 7 dana. Što se tiče estradiola, došlo je do značajnog povećanja nakon 3 dana izlaganja na 16 µl/L i 7 dana izlaganja na 8 µL/L. Izloženost RIPEX-u također je povećala aktivnosti enzima mijeloperoksidaze i adenozin deaminaze u probavnim žlijezdama puževa. Povećao je ukupni broj hemocita izloženih puževa, kao i broj granulocita. Probavne žlijezde i ovotestisi puževa pokazali su patološke promjene nakon 7 dana izlaganja RIPEX-u.

Zaključci

Ovi nalazi sugeriraju da je RIPEX toksičan za B. Alexandrina i da se ovaj puž može koristiti kao bioindikator za onečišćenje okoliša regulatorima rasta biljaka.

Ključne riječi

Biomphalaria alexandrina, RIPEX, Testosteron, Estradiol, Mijeloperoksidaza, Adenozin deaminaza, Histopatologija

1 Pozadina

Agrokemijsko onečišćenje površinskih voda rastuća je globalna briga za okoliš, osobito u područjima gdje se poljoprivreda brzo širi i intenzivira. Razne sintetičke kemikalije, poput pesticida ili gnojiva, koriste se za modificiranje količine i kvalitete usjeva kako bi se zadovoljile potrebe kupaca [7, 40]. Promotori rasta biljaka uobičajene su agrokemikalije u mnogim zemljama [18].

Kada se te kemikalije izravno udišu ili konzumiraju s kontaminiranim povrćem, štete ljudskom zdravlju [39]. Organofosforni pesticid, etefon (2-kloroetil fosfonska kiselina) je sintetička kemikalija koja otpušta etilen i koja se obično koristi kao regulator rasta biljaka (PGR) za poticanje cvjetanja, sazrijevanja plodova i drugih fizioloških reakcija. Odobren je za upotrebu na raznim vrstama hrane, hrane za životinje, neprehrambenog materijala, rasadnika u staklenicima i ukrasnog bilja koje se uzgaja na otvorenom [3, 50]. Laboratorijska procjena toksičnosti etefona pokazala je da je etefon inducirao morfometrijske malformacije druge antene, osjetnih čekinja, repne bodlje i rostruma Daphnia magna što je dovelo do gubitka funkcije i smrti [54].

Abd-El Azeem [1] je zabilježio smanjenje brzine rasta, oštećenja DNA i apoptotičkih učinaka u stanicama probavnih žlijezda puža Deroceras reticulatum nakon izlaganja etefonu. Mnogi autori potvrdili su toksičnost Ethephona na štakore i ptice [2, 17, 55]. Nadalje, izloženost etefonu uzrokovala je genotoksičnost, oksidativni stres i reproduktivnu toksičnost kod miševa [16]. Teratogenost i disfunkcija gonadnog sustava kod miševa također su povezani s izloženošću etefonu [2, 16]. Također se pokazalo da je etefon imunotoksičan, ima mutagene učinke [26], povećava oksidativni stres i snižava koncentracije deoksiribonukleinske i ribonukleinske kiseline [4].

Ethephon u vodenim tijelima može ugroziti vodenu faunu; međutim, podaci o njegovom utjecaju na vodene organizme su rijetki. Nekoliko vodenih vrsta korišteno je za otkrivanje hormona rasta biljaka u vodenim sustavima. Međutim, nekima od tih organizama teško je manipulirati i održavati ih u laboratoriju, što ih čini težim za korištenje u ekotoksikološkim procjenama [54]. Vodeni mekušci, uključujući puževe, nedavno su privukli pozornost kao testni organizmi zbog potrebe za razvojem modela beskralješnjaka za praćenje okoliša vodenih kontaminanata [21, 45]. Puževi su najzastupljenija skupina mekušaca u vodenim sustavima. Puževi predstavljaju manje eksploatatorsku alternativu višim kralježnjacima kao bioindikatorima jer se mogu koristiti u raznim pokusima bez traženja etičkog odobrenja, a njihovo nabavljanje i održavanje su jeftini [13].

U tom smislu, puž Biomphalaria alexandrina naširoko se koristi kao indikatorski organizam onečišćenja slatke vode pesticidima [29, 30]. Osim svog potencijala kao bioindikatora, ovaj puž djeluje kao posredni domaćin za prijenos Schistosoma mansoni [35]. Stoga koncentracije agrokemikalija u okolišu mogu utjecati na prijenos shistosomijaze putem izravnih i neizravnih učinaka na srednjeg domaćina i gustoću parazita [27]. Ovo istraživanje imalo je za cilj istražiti utjecaj subletalne izloženosti regulatoru rasta biljaka, RIPEX 48 posto EC (trgovački naziv etefona, 2-kloroetil fosfonske kiseline) na različite biokemijske, imunološke i histološke aspekte B. alexandrina puževa kao bioindikatorskog organizma.

2 Metode

2.1 Testni organizam

Puževi Biomphalaria alexandrina prikupljeni su iz jezera Manzalah koje se nalazi u El-Matareya, Dakahlia Governorate, Egipat (31 stupanj 11′ N 32 stupanj 2′ E) i držani u dobro prozračenoj vodi iz slavine na konstantnoj temperaturi od 20 stupnjeva. Svakodnevno su hranjeni svježim listovima salate. Nakon održavanja tijekom 4 tjedna u laboratorijskim uvjetima, zdravi zreli puževi (10-12 mm u promjeru ljušture) korišteni su u sljedećim pokusima.

2.2 Eksperimentalni materijal i uvjeti izlaganja

Regulator rasta biljaka, RIPEX (oblik otopine koji sadrži 48 posto etefona [2- kloroetil fosfonske kiseline (C2H6ClO3P)] i 52 posto inertnih sastojaka) kupljen je od Chema Industries (grad New Nubaria, Behira, Egipat; registarska dozvola br. 1840). Pripremljen je niz koncentracija. Izložene su replike stabala s po deset puževa. Nakon 1- dana izlaganja, mrtvi puževi su izbrojani i uklonjeni, a LC50 i LC90 izračunati su statističkim softverom društvenih znanosti (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, SAD).

2.3 Eksperimentalni dizajn

Korištene su dvije subletalne koncentracije koje predstavljaju LC10 i LC20 (8 i 16 µL/L). 90 puževa podijeljeno je u tri skupine, svaka skupina s tri ponavljanja (deset puževa po ponavljanju): kontrolna skupina, skupina izložena 8 µL/L i skupina izložena 16 µL/L. U intervalima od 1-, 3- i 7- dana, biomarkeri oksidativnog stresa i imunološki potencijalni enzimi procijenjeni su u probavnoj žlijezdi. steroidni hormoni procijenjeni su u Ovotestisu. Procijenjen je diferencijalni broj hemocita te histologija probavnih žlijezda i ovotestisa. Za biokemijska ispitivanja, 0,5 g tkiva (probavne žlijezde ili ovotestis) iz svake skupine homogenizirano je u 0,5 mL fosfatnog pufera (pH 6,5) pomoću staklenog homogenizatora i centrifugirano na 10,000×g, 4 stupnja tijekom 10 minuta . Rezultirajući supernatanti korišteni su za daljnje testove.

2.4 Određivanje markera oksidativnog stresa

2.4.1 Superoksid dismutaza (SOD, EC 1.15.1.1)

Aktivnost SOD određena je pomoću EnzyChrom™ Superoxide Dismutase Assay Kit (kat. br.: ESOD{{0}}; BioAssay Systems, Hayward, CA, SAD) prema uputama proizvođača. Homogenat tkiva upotrebom hladnog pufera za lizu (50 mM kalijevog fosfata, 0,1 mM EDTA i 0,5 posto Tritona X-100) centrifugiran je na 12,000g 5 minuta na 4 stupnja , a supernatant je sakupljen za određivanje SOD [43]. Aktivnost SOD je mjerena pri optičkoj gustoći (OD) na 440 nm.

2.4.2 Glutation-S-transferaza (GST, EC 2.5.1.18)

Ovaj enzim katalizira GSH konjugaciju s {{0}}kloro-2,4-dinitrobenzenom (CDNB). Mjeri se spektrofotometrijski na 340 nm. Reakcijska smjesa sadrži kalijev fosfatni pufer 0,1 M, pH 6,5, GSH otopljen u kalijev fosfatni pufer (140 mg/100 mL) i CDNB 4 mg/ml u etilnom alkoholu. Jedna jedinica aktivnosti enzima definirana je kao količina enzima koja katalizira stvaranje 1 μmola S-konjugata u minuti [11].

2.4.3 Malondialdehid (MDA)

Malondialdehid u cijelim homogenatima određen je kao reaktivne tvari na tiobarbiturnu kiselinu (TBARS) prema standardnoj metodi Ohkawa et al. [37]. Reakcijska smjesa uključivala je 0.1 mL homogenata tkiva, jednak volumen otopine natrijevog dodecil sulfata, 0.75 mL octene kiseline, 0.75 mL tiobarbiturne kiseline, i 0.3 mL destilirane vode. Ove komponente su pomiješane u vorteksu i inkubirane u kipućoj vodenoj kupelji 1 sat, zatim ohlađene na sobnu temperaturu. Deset 0,5 mL destilirane vode i 2,5 mL n-butanola dodano je u svaku epruvetu i snažno miješano s vorteksom, a zatim rotirano u centrifugi na 2500 × g 10 minuta. Apsorbancija je očitana na 532 nm.

2.5 Određivanje hormona

2.5.1 Testosteron

Testosteron je određen korištenjem kompleta ELISA (kataloški broj: ADI-900-065; Enzo Life Sciences, NY, SAD). Testosteron je glavni androgen koji utječe na primarni i sekundarni spolni razvoj kao spolni nagon. 100 µL standardnog razrjeđivača (testni pufer 3 ili medij kulture tkiva) pipetirano je u jažice za nespecifično vezanje i maksimalno vezanje (0 pg/mL standard). Nakon toga 100 µL standarda #1 do #5 u odgovarajuće jažice. Uzorak (100 µL) je pipetiran u odgovarajuće jažice i 50 µL pufera za ispitivanje 3 u jažice za nespecifično vezanje. Također, 50 µL žutog antitijela dodano je u svaku jažicu, osim u jažice s slijepom probom, ukupnom aktivnošću i nespecifičnim vezanjem. Inkubacija ploče na sobnoj temperaturi na mućkalici za ploče tijekom 1 sata pri 500 okretaja u minuti. Nakon toga, 50 µL plavog konjugata je dodano u svaku jažicu, osim za ukupnu aktivnost i slijepe jažice. Nakon pražnjenja jažica od sadržaja, izvršeno je ispiranje dodavanjem 400 µL otopine za ispiranje u svaku jažicu 3 puta. Plavi konjugat (5 µL) dodan je u jažice s ukupnom aktivnošću i 200 µL otopine p-nitrofenil fosfata dodano je u svaku jažicu i inkubirano na 37 stupnjeva 1 h bez mućkanja. Očitavanje ploče pri 405 nm provedeno je nakon dodavanja 50 µL stop otopine u svaku jažicu [12, 48].

2.5.2 Estradiol

Estradiol je određen korištenjem estradiol ELIZA kita (kat. br.: 501890; Cayman Chemical, Michigan, SAD) prema protokolima proizvođača. Princip ove reakcije temelji se na tome da je koncentracija traga estradiol acetilkolinesteraze (AChE) konstantna, ali koncentracija nativnog estradiola varira, stoga je količina traga estradiol acetilkolinesteraze (AChE) koja se veže na estradiol antiserum obrnuto proporcionalna koncentraciji nativnog estradiola. u bunaru. 100 µL ELISA pufera dodano je u jažice za nespecifično vezanje i maksimalno vezanje. Dodavanje 50 µL iz epruvete #8 u obje najniže standardne jažice (Standard 8) i 50 µL iz epruvete #7 u svaku od sljedećih standardnih jažica (Standard 7). Uzorak (50 µL) je dodan u svaku jažicu. Estradiol AChE Tracer (50 µL) je dodan u svaku ukupnu aktivnost i prazne jažice. Nakon toga je u svaku jažicu dodan Estradiol ELISA antiserum (50 µL) osim za ukupnu aktivnost, nespecifično vezanje i slijepe jažice. Nakon inkubacije u orbitalnoj mućkalici (2 h na sobnoj temperaturi), apsorbancija je izmjerena na 414 nm [52].

2.6 Određivanje enzima imunološkog potencijala

2.6.1 Mijeloperoksidaza (MPO, EC 1.11.2.2)

Jedna jedinica aktivnosti MPO definirana je kao količina enzima koji hidrolizira supstrat i stvara taurin kloramin za potrošnju 1.0 μmola TNB-a po minuti na 25 stupnjeva. MPO je određen korištenjem kompleta za analizu kolorimetrijske aktivnosti mijeloperoksidaze (kat. br.: MAK068; Sigma-Aldrich, MO, SAD). Apsorpcija je izmjerena na 412 nm.

2.6.2 Adenozin deaminaza (ADA, EC 3.5.4.4)

ADA je enzim koji katalizira pretvorbu adenozina i 2'-deoksiadenozina u inozin i 2'-deoksiinozin. ADA je određena u skladu s načelima kompleta za analizu aktivnosti adenozin deaminaze iz tehničkog biltena (kat. br.: MAK400; Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka). Jedna jedinica adenozin deaminaze je količina enzima koji hidrolizira adenozin da bi se dobio 1,0 μmol inozina po minuti na 37 stupnjeva. Reagensi su 1×ADA pufer za ispitivanje (41 μL), ADA pretvarač (2 μL), ADA razvijač (2 μL) i ADA supstrat (5 μL).

2.7 Diferencijalno brojanje hemocita

Hemolimfa je sakupljena od puža (kontrola, izložena) prema Sminia [47]. Nakon što ga je Pasteurova pipeta dodirnula po glavi i stopalu, puž je bio prisiljen duboko se povući u svoju ljušturu i istisnuti hemolimfu, koja je prikupljena za diferencijalni broj hemocita. Hemolimfa je razmazana na stakalcu mikroskopa za širenje. Nakon fiksacije u 99,8 postotnom metanolu tijekom 5 minuta, predmetno staklo je okrenuto pod kutom od 45 stupnjeva radi sušenja na sobnoj temperaturi i obojeno Giemsa bojom 20 minuta. Utvrđeno je da je diferencijacija hemocita proporcionalna brojanju 100.

2.8 Histološka ispitivanja

Histološka ispitivanja provedena su nakon 7 dana izlaganja 8 i 16 µL/L RIPEX-u. Probavne žlijezde i ovotestis su secirani i odmah fiksirani u Bouinovoj tekućini. Nakon 1 dana fiksacije, uzorci su zatim dehidrirani kroz niz alkohola i pročišćeni u ksilenu. Izrađeni su blokovi od parafinskog voska [42]. Deset sekti. (5–7 μm debljine) izrezani su i obojeni hematoksilinom i eozinom (Mayerov H i E). Nakon bojenja slijedilo je dobro pranje vodom iz slavine. Histološki rezovi fotografirani su foto-automatiziranom kamerom (Optika, Italija).

2.9 Statistička analiza

Podaci su izraženi kao srednja vrijednost±standardna devijacija i analizirani statističkim softverom društvenih znanosti (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, SAD). Dvosmjerna ANOVA analiza varijance korištena je za utvrđivanje razlika između kontrolne i izložene skupine, između različitih koncentracija i vremenskih točaka izloženosti. Razina značajnosti postavljena je na p Manje od ili jednako 0.05.

Mehanizam Cistanchea pojačava učinak testosterona

Utvrđeno je da Cistanche podiže razinu testosterona na nekoliko načina. Prvo, sadrži spojeve poznate kao ehinakozid i akteozid, za koje se pokazalo da pospješuju proizvodnju luteinizirajućeg hormona (LH) u hipofizi. LH stimulira Leydigove stanice u testisima da proizvode testosteron. Cistanche također sadrži polisaharide i feniletanoidne glikozide, za koje se pokazalo da imaju antioksidativna i protuupalna svojstva. To može pomoći u smanjenju oksidativnog stresa i upale u testisima, što može oslabiti proizvodnju testosterona. Osim toga, otkriveno je da Cistanche povećava ekspresiju gena uključenih u sintezu testosterona i smanjuje aktivnost enzima koji razgrađuju testosteron, kao što je {{1} }alfa-reduktaza. Sve u svemu, smatra se da kombinacija ovih mehanizama doprinosi učincima Cistanchea na povećanje testosterona.

Hoda H. Abdel‑Azeem1*, Azza H. Mohamed1 i Mohamed R. Habib2