Biokemijski i histopatološki odgovori Biomphalaria Alexandrina na RIPEX (regulator rasta biljaka)Ⅱ

3 Rezultati

3.1 RIPEX toksičnost

Rezultati toksičnosti RIPEX-a na Biomphalaria alexandrina nakon 1 dana pokazali su da su vrijednosti LC50 i LC90 bile 39.9 5 odnosno 73,6 µL/L. Subletalne koncentracije LC10 i LC20 bile su 8 odnosno 16 µL/L (Tablica 1 i Slika 1).

3.2 Učinak RIPEX-a na markere oksidativnog stresa

Izloženost RIPEX-u utjecala je na aktivnosti SOD i GST te razine MDA u probavnoj žlijezdi B. Alexandrina (Tablica 2). Puževi izloženi RIPEX-u od 8 µL/L pokazali su beznačajno povećanje (p=0.6) aktivnosti SOD u usporedbi s kontrolnim puževima. Međutim, puževi B. alexandrina izloženi 16 µL/L tijekom 7 dana pokazali su značajno smanjenje aktivnosti SOD (p=0.05). GST aktivnost se značajno povećala (p Manje od ili jednako 0,001) nakon izlaganja objema koncentracijama. Najveće povećanje zabilježeno je kod puževa izloženih 16 µL/L tijekom 1 dana (39,7±3,2 U/mg), a najveća vrijednost pri koncentraciji od 8 µL/L bila je (33,7±1,7 U/mg) 7 dana, u usporedbi s kontrole na 17,1±3,6 U/mg (nakon 1 dana) i 22,6±1,3 U/mg (nakon 7 dana).

Kliknite za cistanche beneficios za testosteron

Ovisno o vremenskim intervalima, izloženost tijekom 7 dana uzrokovala je značajan porast (p=0.0{{20}}3). Izloženost različitim koncentracijama RIPEX-a uzrokovala je značajno povećanje (p Manje od ili jednako 0,04) u razinama MDA. Koncentracija od 8 µL/L povećala je razinu MDA (45,06±4,1) u usporedbi s kontrolom (16,4±2,1). Ovisno o vremenu izlaganja, razine MDA bile su 45,06±4,1 i 56,1±0,7 nmol/g pri koncentracijama od 8 odnosno 16 µL/L, u usporedbi s 13,5±0,7 nmol/g za kontrolu (Tablica 2).

3.3 Učinak RIPEX-a na aktivnost steroidnih hormona

Izloženost dozi od 16 µL/L uzrokovala je značajno povećanje koncentracije testosterona (52,6±2,5 nmol/L) (p=0.002) u usporedbi s kontrolom (34,6±2,3 nmol/L). Dok je koncentracija od 8 µL/L RIPEX uzrokovala značajno povećanje (p=0.005) u testosteronu nakon 3 dana izlaganja u usporedbi sa 16 µL/L. Ovisno o vremenskim intervalima, nema značajnosti osim značajnog smanjenja koncentracije testosterona koje se dogodilo nakon 7 dana (19,6±2 nmol/L) izloženosti (p=0.003) u usporedbi s 3 dana (47,3± 6 nmol/L). Što se tiče estradiola, došlo je do značajnog povećanja (p=0.003) u koncentraciji hormona nakon 3 dana izlaganja 16 µl/L (73,6±3,5 pg/mL u usporedbi s kontrolom (43,3 pg/mL) i 7 dana izloženosti 8 µL/L (56,3±1,5 pg/mL u usporedbi s kontrolom (50,3±5,6 pg/mL) (slika 2, b).

3.4 Učinak RIPEX-a na enzime imunološkog potencijala

Izlaganje B. Alexandrine dvjema koncentracijama RIPEX-a uzrokovalo je značajno povećanje aktivnosti enzima MPO (Slika 3a) ovisno o vremenu izlaganja nakon 3 dana (p=0.0{ {35}}4) i 7 dana (p=0.01). Izloženost RIPEX-u od 8 µL/L značajno je povećala aktivnost MPO (55,3±4,8 mU/mg proteina (p=0.004) u usporedbi s 15,4±1,2 mU/mg za kontrolu. Dok je izloženo 16 µL/L puževa aktivnost je bila (53,03±2,3 mU/mg proteina i 73,9±2,8 mU/mg proteina, p manje ili jednako 0,05). Također, koncentracija od 16 µL/L uzrokovala je značajan porast (p=0 .05) u aktivnosti u usporedbi s 8 µL. Obje koncentracije (8 i 16 µL/L) značajno su povećale (p Manje od ili jednako 0,009) aktivnost ADA u usporedbi s kontrolom (Sl. 3b) u cijelom vremenu bodova Povećanje aktivnosti pri koncentraciji od 16 µL/L. Ovisno o vremenskim intervalima, izloženost od 7 dana bilježi značajan porast u usporedbi s 1 danom i 3 dana (p Manje od ili jednako 0,05). aktivnost na 7 dana bila je 27,03±14 i 74,3±1,9 U/mg proteina

3.5 Diferencijalno brojanje hemocita

Ispitivanje uzoraka hemolimfe puževa B. alexandrina pokazalo je tri morfološki različite vrste hemocita; hijalinociti, okrugli mali i rašireni hemociti. Hijalinocite karakterizira njihov kružni oblik, čista, gusta stanična membrana i veliki omjer jezgre i citoplazme. Predstavljena je visokim brojem u kontroli (56,3±0,5, 1 dan). Male okrugle stanice su srednje stanice s nekoliko citoplazmatskih granula i bez pseudopodija. Hemociti koji se šire imaju različite veličine, s malom jezgrom i velikim citoplazmatskim granulama. One su fagocitne stanice jer mogu formirati malobrojne i kratko rasprostranjene pseudopodije. Izlaganje dvjema koncentracijama RIPEX-a povećalo je broj hemocita, a primijećeno je značajno povećanje granulocita puževa izloženih 8 µL/L (p=0.02) i 16 µL/L (p{{12 }}.006) za 1, 3 i 7 dana u usporedbi s kontrolom. (Tablica 3). Tretman je uzrokovao neke morfološke abnormalnosti u hemocitima kao što su hijalinociti s filopodijalnom elongacijom, deformirani granulociti s vakuolama i filopodije koji se šire (slika 4).

3.6 Učinak RIPEX-a na histopatologiju probavnih žlijezda i ovotestisa

Probavne žlijezde B. Alexandrina sastoje se od tubula, a svaki se tubul sastoji od jednog sloja stupčastih epitelnih stanica diferenciranih u probavne i sekretorne stanice, koje su raspoređene oko središnjeg lumena (slika 5a). Tubuli su međusobno povezani vezivnim tkivom. Izlaganje RIPEX-u uzrokovalo je neke promjene, poput degeneracije vezivnog tkiva. Puževi izloženi 8 µL/L pokazali su prisutnost staničnih mjehurića koji ukazuju na smrt stanica i začepljenje lumena. Uočena je neprobavljena hrana (sl. 5b–d). Puževi izloženi 16 µL/L pokazali su degeneraciju obrubljenih stanica s nekim patološkim znakovima kao što su vakuolizacija i širenje lumena. Tubul je postao oštećen, deformiran i nekrotičan (sl. 5e, f).

Ovotestisi kontrolnih puževa B. alexandrina sastoje se od nekoliko acinusa spojenih vezivnim tkivom. Svaki acinus obložen je germinativnim epitelom koji se sastoji od različitih stadija spermatogonija i oogonija. Diferenciraju se na primarne, sekundarne i jednu ili dvije zrele jajne stanice (oogonije). Sazreli spermiji nalaze se u skupinama unutar acinusa (slika 6a). Histološka struktura ovotestisa izloženih puževa promijenila se nakon 7 dana izlaganja RIPEX-u. Kod puževa izloženih dozi od 8 µL/L uočen je povećan broj spermija, nekrotični spermiji i atrofija. Deformacija muških ili ženskih gametocita i degeneracija acinusa također su bile obilne. Također, izloženost 16 µL/L dovela je do veće degeneracije acinusa i povećane nekroze (Slika 6b–e).

4 Rasprava

PGR se široko koriste u poljoprivrednim praksama. Ove tvari imaju brojne štetne učinke na žive organizme. Ova je studija imala za cilj procijeniti toksikološke učinke RIPEX-a (organofosforni pesticid koji sadrži etefon koji sadrži 48 posto etefona kao aktivnog sastojka plus 52 posto inertnih sastojaka). Testovi toksičnosti RIPEX-a s B. Alexandrinom pokazali su da su 1-dnevne vrijednosti LC50 i -LC90 bile 39,95 odnosno 73,6 µl/L.

Ove rezultate je podržao [54] koji je pokazao vrijednost EC50 za etefon protiv embrija Daphnia magna (125 mg/L nakon 48 sati izlaganja). Čini se da je ovaj pesticid toksičniji za Biomphalaria nego druge formulacije organofosfornih spojeva kao što je klorpirifos (LC50 9.6 mg/L; [30] i profenofos (LC50 1.10 mg/L; [10]) .

Postoji homeostaza između stvaranja slobodnih radikala kisika i proizvodnje antioksidativnih molekula u normalnim fiziološkim uvjetima [23]. Neravnoteža između antioksidativnog i oksidativnog sustava poznata je kao oksidativni stres [32]. I kod eukariota i kod prokariota, superoksid dismutaza (SOD) i glutation S-transferaze su ključni antioksidativni enzimi koji mogu ukloniti previše kisika iz slobodnih radikala i zaštititi organizam od oksidativnog oštećenja [34, 38].

Također sudjeluju u detoksikaciji nekoliko ksenobiotika [8, 15]. Ova studija otkrila je da je izloženost puževa B. alexandrina subletalnim koncentracijama RIPEX 48 posto EC poremetila antioksidacijsku aktivnost izloženih puževa. Akutna izloženost (24 h) ima tendenciju smanjenja ukupnih aktivnosti SOD i GST u puževa, nakon čega slijedi povećanje nakon 3 dana izlaganja i oštra inhibicija nakon 7 dana izlaganja.

Razine MDA bile su značajno više u izloženih puževa u usporedbi s kontrolama nakon svih razdoblja izlaganja. Ovi rezultati sugeriraju stanje oksidativnog stresa u puževa izazvanog izloženošću RIPEX-u. Puževi su doživjeli naglo smanjenje aktivnosti enzima nakon 1 dana izlaganja i pokušali su to nadoknaditi prekomjernom proizvodnjom enzima nakon 3 dana izlaganja. Međutim, do 7. dana izlaganja, puževi nisu bili u stanju nadvladati prekomjernu proizvodnju reaktivnih kisikovih vrsta, što se očituje povećanjem razine MDA (lipidna peroksidacija), što dovodi do inhibicije proizvodnje antioksidativnih enzima. MDA je jedan od glavnih učinaka peroksidacije lipida i ima moć poremetiti ionsku izmjenu u staničnoj membrani, modificirati propusnost iona i utjecati na funkciju enzima [9].

Mehanizam RIPEX 48 posto EC-induciranog oksidativnog stresa kod biomfalarije može se razlikovati od ostalih organofosfornih pesticida. Izazvao je inhibiciju enzima tek nakon 7 dana izlaganja. Međutim, klorpirifos je, na primjer, izazvao povećanje aktivnosti SOD i smanjenje aktivnosti GST u B. Alexandrina ubrzo nakon 1 dana izlaganja [30]. Testosteron i estradiol igraju ključnu ulogu u reprodukciji puževa B. alexandrina [20, 45]. Promjene u tim hormonima mogu se koristiti kao krajnja točka kemijske toksičnosti [14]. RIPEX 48 posto EC izazvao je hormonalni poremećaj kod puževa B. alexandrina.

Puževi izloženi 16 µL/L pokazali su značajan porast testosterona nakon 3 dana izlaganja. Međutim, RIPEX je smanjio razinu hormona u puževa izloženih 8 µL/L nakon 1 i 3 dana izlaganja. Što se tiče estradiola, hormon ima tendenciju povećanja kod izloženih puževa. Međutim, najizrazitije povećanje primijećeno je kod puževa izloženih 16 µL/L nakon 3 dana izlaganja. RIPEX stoga može djelovati na endokrini poremećaj na puževe B. alexandrina. Slična otkrića također su izvijestili Ibrahim i Hussein [30], koji su izvijestili o značajnom povećanju razine testosterona i estradiola nakon izlaganja B. Alexandrina subletalnim koncentracijama klorpirifosa od 48 posto EC. Međutim, druge agrokemikalije, poput herbicida oksifluorfena (24 posto EC), smanjile su razine testosterona i 17-estradiola u B. Alexandrina nakon dva tjedna izlaganja [31]. Mijeloperoksidaza (MPO), koja pretvara H2O2 u hipokloričnu kiselinu (HOCl), snažan antibiotik, često se smatra kamenom temeljcem citotoksičnosti posredovane ROS-om, a postoje snažni dokazi da hemociti mekušaca imaju MPO aktivnost usporedivu s onom fagocita sisavaca [22]. , 44, 49]. Adenozin deaminaza (ADA) igra važnu ulogu u imunološkom sustavu kralješnjaka i beskralježnjaka, uključujući puževe Biomphalaria [51].

Njegov nedostatak povezan je s bolešću kombinirane imunodeficijencije [25]. Izloženost B. Alexandrina RIPEX-u od 8 i 16 µL/L uzrokovala je značajno povećanje aktivnosti enzima MPO i ADA u probavnim žlijezdama puževa nakon 3 i 7 dana izlaganja. Čini se da povećanje aktivnosti enzima ovisi o vremenu i koncentraciji. Probavne žlijezde primarno su mjesto za metabolizam kemijskih kontaminanata kod puževa [46]. Povećanje ovih enzima sugerira imunološki odgovor B. Alexandrina na toksičnost RIPEX-a jer MPO, na primjer, može pretvoriti zagađivače u slobodne radikale putem apstrakcije jednog elektrona [41], što može rezultirati događajima redoks-cikliranja koji proizvode oksiradikale i moguće iniciraju lipidna peroksidacija [36].

Puževi se primarno oslanjaju na citotoksičnost posredovanu stanicama kako bi se riješili invazivnih objekata [5, 53]. Najbolje proučene obrambene stanice puževa su hemociti. Hemociti napreduju od malih, zaobljenih, agranularnih stanica do velikih, granularnih stanica koje se šire preko međufaza [6, 53]. Zrnati hemociti uglavnom fagocitiraju strane tvari [28]. Izloženost dvjema koncentracijama RIPEX 48 posto EC povećala je broj hemocita. Hijalinociti su se pojavili s vakuolama u uzorcima prikupljenim od izloženih puževa. Primijećen je značajan porast granulocita, što ukazuje na povećanje stanične imunološke reakcije puža na izazov toksičnosti RIPEX-a. Ibrahim i Hussein [30] su pokazali da izloženost B. Alexandrina klorpirifosu ima negativan učinak na morfologiju i ukupni broj hemocita izloženih puževa.

Nadalje, svjetlosna mikroskopija otkrila je da neki hijalinociti imaju smanjene jezgre, nepotpunu diobu stanica i stvaranje pseudopodija. Ovi učinci na broj hemocita i morfologiju B. Alexandrina imaju negativne implikacije na imunitet puževa, budući da ti organizmi uvelike ovise o hemocitima za svoju zaštitu od stranih susreta. Histopatološka istraživanja probavnih žlijezda B. Alexandrina pokazala su da je izlaganje RIPEX-u tijekom 7 dana uzrokovalo neke patološke promjene kao što su degeneracija vezivnog tkiva, mjehurići u stanicama i degeneracija obrubljenih stanica u lumenu. Probavni kanalići su postali oštećeni, deformirani i nekrotični. Histopatologija je važna krajnja točka u procjeni patoloških promjena u vodenih životinja izloženih kontaminantima [33].

Visoka osjetljivost probavnih žlijezda izravno se pripisuje njihovoj ulozi u homeostazi, unosu zagađivača, probavi, metabolizmu i procesu detoksikacije [24]. Opaženi učinci mogu biti posljedica izravnog nakupljanja RIPEX-a u stanicama probavnih žlijezda ili neizravno putem oksidativnog oštećenja uzrokovanog proizvodnjom reaktivnih kisikovih vrsta (ROS). Doista, ekstremni oksidativni stres povezan je s oštećenjem tkiva koje uključuje razne fiziološke procese i varijable okoliša, uključujući nekrotičnu i apoptotičku staničnu smrt [19]. Štoviše, izloženost dvjema različitim koncentracijama RIPEX-a tijekom 7 dana promijenila je histološku strukturu ovotestisa s povećanjem broja nekrotičnih spermija, atrofijom, deformacijom muških ili ženskih gametocita i degeneracijom acinusa. Te će promjene vjerojatno smanjiti reproduktivni potencijal puževa, a time i njihovu sposobnost u vodenom sustavu.

5. Zaključak

Subletalne koncentracije RIPEX 48 posto EC imale su višestruk učinak na puževe Biomphalaria alexandrina. Kod puževa je kronična izloženost RIPEX-u smanjila proizvodnju antioksidativnih enzima SOD i GST dok je povećala proizvodnju MDA, što ukazuje na stanje oksidativnog stresa. Nadalje, imao je učinak na endokrini poremećaj na puževe, što je dokazano ukupnim povećanjem razine steroidnih hormona. Čini se da je pužev imunološki sustav osjetljiv na izloženost RIPEX-u. Izazvao je značajan porast aktivnosti enzima MPO i ADA u probavnim žlijezdama puževa nakon 3 i 7 dana izlaganja, kao i značajan porast granulocita u izloženim skupinama puževa. Patološke abnormalnosti u probavnim žlijezdama i ovotestisu izloženih puževa također su bili znakovi histopatoloških promjena uzrokovanih izlaganjem RIPEX-u. Ovi nalazi pokazuju da RIPEX šteti vodenoj fauni, uključujući B. Alexandrina. Dakle, puževi Biomphalaria mogu se koristiti kao bioindikatori onečišćenja okoliša s regulatorima rasta biljaka.

Mehanizam Cistanchea pojačava učinak testosterona

Utvrđeno je da Cistanche podiže razinu testosterona na nekoliko načina. Prvo, sadrži spojeve poznate kao ehinakozid i akteozid, za koje se pokazalo da pojačavaju proizvodnju luteinizirajućeg hormona (LH) u hipofizi. LH stimulira Leydigove stanice u testisima da proizvode testosteron. Cistanche također sadrži polisaharide i feniletanoidne glikozide, za koje se pokazalo da imaju antioksidativna i protuupalna svojstva. To može pomoći u smanjenju oksidativnog stresa i upale u testisima, što može oslabiti proizvodnju testosterona. Osim toga, otkriveno je da Cistanche povećava ekspresiju gena uključenih u sintezu testosterona i smanjuje aktivnost enzima koji razgrađuju testosteron, kao što je {{1} }alfa-reduktaza. Sve u svemu, smatra se da kombinacija ovih mehanizama doprinosi učincima Cistanchea na povećanje testosterona.