Sažetak:Fitokemijska istraživanja sjemenki egipatske mandarine (Citrus reticulata Blanco, F. Rutaceae) dala su trinaest poznatih spojeva, 1–13. Strukture izoliranih spojeva dodijeljene su pomoću 1D i 2D NMR i HRESIMS analiza. Kako bi se opisala farmakološka aktivnost ovih spojeva, primijenjeno je nekoliko integriranih eksperimenata temeljenih na virtualnom probiru i simulaciji molekularne dinamike. Kao rezultat, spojevi 2, 3 i 5 navodno su identificirani kao inhibitori hijaluronidaze, ksantin oksidaze i tirozinaze. Naknadno in vitro testiranje provedeno je kako bi se potvrdili pokusi temeljeni na siliciju kako bi se istaknuo potencijal ovih flavonoida kao obećavajućih inhibitora hijaluronidaze, ksantin oksidaze i tirozinaze s IC50 vrijednostima u rasponu od 6,39 ± 0,36 do 73,7 ± 2,33 µM . Ova studija rasvijetlila je potencijal otpadnih proizvoda egipatske mandarine (tj. njezinih sjemenki) kao prirodnog sredstva koje promiče zdravlje kože. Dodatno, otkrio je primjenjivost integriranog virtualnog skrininga temeljenog na inverznom spajanju i eksperimenata temeljenih na MDS-u u učinkovitom predviđanju biološkog potencijala prirodnih proizvoda.

Glikozid cistanhe također može povećati aktivnost SOD-a u tkivima srca i jetre, te značajno smanjiti sadržaj lipofuscina i MDA u svakom tkivu, učinkovito čisteći različite reaktivne kisikove radikale (OH-, H₂O₂, itd.) i štiteći od oštećenja DNA uzrokovanog pomoću OH-radikala. Cistanche feniletanoidni glikozidi imaju jaku sposobnost hvatanja slobodnih radikala, veću reducirajuću sposobnost od vitamina C, poboljšavaju aktivnost SOD u suspenziji spermija, smanjuju sadržaj MDA i imaju određeni zaštitni učinak na funkciju membrane spermija. Cistanche polisaharidi mogu pojačati aktivnost SOD i GSH-Px u eritrocitima i plućnom tkivu eksperimentalno starih miševa uzrokovanu D-galaktozom, kao i smanjiti sadržaj MDA i kolagena u plućima i plazmi, te povećati sadržaj elastina, imaju dobar učinak čišćenja na DPPH, produžiti vrijeme hipoksije u starim miševima, poboljšati aktivnost SOD u serumu i odgoditi fiziološku degeneraciju pluća u eksperimentalno starim miševima Uz stančnu morfološke degeneraciju, pokusi su pokazali da Cistanche ima dobru antioksidacijsku sposobnost i ima potencijal da bude lijek za prevenciju i liječenje bolesti starenja kože. U isto vrijeme, ehinakozid u Cistancheu ima značajnu sposobnost hvatanja slobodnih radikala DPPH i ima sposobnost hvatanja reaktivnih vrsta kisika i sprječavanja degradacije kolagena izazvane slobodnim radikalima, a također ima dobar učinak popravka na oštećenje aniona slobodnih radikala timina.

Kliknite na Prednosti Cistanche tableta

【Za više informacija: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

1. Uvod

Mandarine, C. reticulata, neke su od najznačajnijih citrusnih kultura za svježu upotrebu [1]. Često se predstavljaju kao 'mandarine'; međutim, 'mandarin' je popularniji naziv. U prirodi je rasprostranjeno nekoliko hibrida i sorti mandarina [1]. Najpoznatije, sofisticirane vrste sastoje se od C. unshiu Marcovitch, C. nobilis Loureiro, C. deliciosa Tenore i C. reticulata Blanco [1,2]. Mandarine su među glavnim agrumima koji se beru u mnogim zemljama. Iako se usjevi uglavnom koriste za slastice, imaju značajnu komercijalnu važnost zbog svojih eteričnih ulja [3]. Arome citrusa koriste se u pićima, slasticama, kolačićima i desertima [4]. Također, kora C. reticulata se koristi za aromatiziranje likera [4].

Inverzno spajanje je vrsta metode virtualnog pregleda kojom se može manipulirati da se predvidi potencijalna molekularna meta za danu strukturu spoja. Prethodno smo koristili ovu učinkovitu virtualnu metodu probira kako bismo odredili najbolje proteinske ciljeve za nekoliko izoliranih prirodnih proizvoda [5]. Međutim, rezultati spajanja koji su rezultat ovog preliminarnog koraka probira daju samo neke informacije o strukturnoj komplementarnosti između ciljeva proteina i strukture upitnog spoja [6]. Sukladno tome, eksperimenti simulacije molekularne dinamike (MDS), uključujući apsolutnu slobodnu energiju vezanja (∆Gbinding), daju rigoroznije i pouzdanije rezultate koji se mogu odabrati za in vitro testiranje. Ovdje smo podvrgnuli sjemenke C. reticulata postupnoj kromatografskoj izolaciji kako bismo dobili neku ideju o glavnoj fitokemikaliji u ovom otpadnom proizvodu. Naknadno smo istražili imaju li te fitokemikalije određene farmakološke učinke podvrgavajući ih postupnoj analizi temeljenoj na siliciju koja je započeta sveobuhvatnim inverznim spajanjem i završila s nekoliko MDS eksperimenata. Potencijal bioaktivnih fitokemikalija izvedenih iz sjemenki C. reticulata rasvjetljava veliki kapacitet otpadnih proizvoda jestivog voća kao golemog rezervoara za tvari koje promiču zdravlje.

2. Materijali i metode

2.1. Biljni materijal

Plodovi C. reticulata sakupljeni su u siječnju 2021. iz lokalne regije u Beni-Suefu u Egiptu, a autentičnost ih je potvrdio viši botaničar, prof. dr. Abd El-Halim A. Mohammed, Odjel za istraživanje flore i fitotaksonomije; Hortikulturni istraživački institut; Dokki; Kairo; Egipat). Uzorak plodova čuvan je pod brojem kupona 2021-BuPD 80 na Zavodu za farmakognoziju; Farmaceutski fakultet; Sveučilište Beni-Suef; Egipat).

2.2. Kemikalije i reagensi

Etil acetat (EtOAc), metanol (MeOH), n-Heksan (n-Hex), etanol (EtOH), diklorometan (DCM) i n-butanol (n-BuOH) nabavljeni su od El-Nasr Company, Egipat. Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, SAD, osigurala je deuterirana otapala za NMR analizu kao i otapala visoke čistoće za HPLC, spektroskopske i kromatografske analize (npr. metanol-d4 (CD3OD), dimetil sulfoksid-d6 (DMSO), kloroform -d (CDCl3), metanol za HPLC, voda HPLC stupnja i acetonitril HPLC stupnja). Za kromatografsku izolaciju, Sephadex LH20 (0.25–0.1 mm, GE Healthcare, Sigma-Aldrich; CA, SAD) i silikagel (E-Merck, Sigma-Aldrich, CA, SAD) korišteni su. Za vakuumsku tekućinsku kromatografiju korišten je silikagel za TLC (Pharmaceuticals and Chemicals; El-Nasr Company; Kairo, Egipat) (VLC). Prethodno obloženi silikagel (E-Merck, Darmstadt, Njemačka) korišten je za TLC studije. Proizvedene mrlje identificirane su para anisaldehidom nakon zagrijavanja na 110 ◦C [7]. Svi materijali za biološka ispitivanja došli su iz Sigma Chemical Company (SCC; CA, SAD).

2.3. Spektralne analize

NMR signali su dobiveni na 400 za 1H-NMR i 100 MHz za 13C-NMR. Vršne vrijednosti CDCl3-d, CD3OD-d4 i DMSO-d6 otapala korištene su kao referentni signali. NMR signal je dobiven korištenjem NMR uređaja Bruker Advance-III 400 MHz (Bruker AG-Billerica, California, MA, USA).

Podaci o masi visoke rezolucije prikupljeni su korištenjem Acquity-Ultra-Performance-LiquidChromatography-stroja povezanog s Quadrupole-Time-of-Flight-Hybrid-Mass-Spectrometrom (Waters, Milford, MA, SAD). Agilent/1260-Infinity-preparative-HPLC korišten je za postizanje HPLC kromatografskih odvajanja.

2.4. Priprema ekstrakta sjemena C. reticulata

Sjeme C. reticulata (1 kilogram) kupljeno je svježe i potom osušeno na zraku u hladu. Nakon toga, sjeme je naribano uz pomoć stroja za mljevenje (Henan, kontinentalna Kina). Praškasti proizvod je zatim temeljito ekstrahiran sa 70 posto EtOH (1 L × 5). Dobiveni tekući ekstrakt je koncentriran pomoću rotacijskog isparivača (Buchi-Rotavapor-R-300, ColeParmer, Vernon Hills, IL, SAD) pod vakuumom na 45 ◦C kako bi se dobilo 100 g sirovog suhog ekstrakta, koji je zatim razdijeljen korištenjem niza otapala s rastućom polarnošću: n-Hex-DCMEtOAc-n-BuOH. Frakcije I (24.0 g), II (5,0 g), III (3,0 g) i IV (6,0 g) dobivene su isparavanjem odvojene organske faze pri sniženom tlaku. Svi ekstrakti i frakcije pohranjeni su na 4 ◦C za kasniju fitokemijsku i biokemijsku analizu.

2.5. Izolacija glavnih prirodnih proizvoda sjemenki C. reticulata 

Kolona TLC-silika gela korištena je za izlaganje frakcije I (20 g) normalnom VLC. Korišteni su EtOAc i n-Hex uzastopno ispiranje (0–100 posto, 5 posto u porastu). Tri podfrakcije (I1–I3) dobivene su skupljanjem identičnih frakcija i njihovim isparavanjem pod smanjenim tlakom. Na drugoj koloni silikagela, podfrakcija Il (1,0 g) je opsežno frakcionirana. Kromatografsko eluiranje je provedeno s n-Hex u EtOAc, gradijentnim smjesama (0-10 posto, 1 posto u porastu, 100 mL svaki) da se dobije spoj 13. (10 mg).

Podfrakcija I2 (50 mg) je dalje kromatografirana na silikagelu-60 (100 × 1 cm, 20 g). Kromatografski postupak je proveden upotrebom DCM:MeOH, izokratske smjese (0,5 posto, 500 mL) da se dobiju spojevi 8 (20 mg) i 9 (15 mg). Podfrakcija I3 donekle je frakcionirana na silika gelu 60 (100 × 1 cm, 20 g). Elucija je proizvedena korištenjem DCM:MeOH, izokratske smjese (0,5 posto, 500 mL) da se dobije 10 (20 mg).

TLC kolona silika gela korištena je za izlaganje frakcije II (2,5 g). DCM: EtOAc (0–100 posto, uz porast od 5 posto) korišten je za eluiranje uzoraka. Proizvedeni efluenti su primljeni u dijelovima od 250 mL. Dobivene su identične frakcije i reducirane u dvije podfrakcije (II1–II2) pri smanjenom tlaku. Na drugoj koloni silikagela, podfrakcija Il (1,0 g) je opsežno frakcionirana. Spoj 5 je eluiran pomoću DCM: EtOAc (0-10 posto, 1 posto raste, 100 mL svaki) (10 mg).

Podfrakcija I2 (50 mg) je dalje kromatografirana na silika gelu60 (100 × 1 cm, 20 g). Kromatografsko eluiranje je primijenjeno upotrebom DCM na MeOH, (izokratsko eluiranje; 0,5 posto, 500 mL) da se dobiju spojevi 11 (20 mg) i 12 (15 mg).

Na normalnoj VLC, frakcija IV (60 g) je odvojena korištenjem silikagela. DCM: EtOAc (0–100 posto, 5 posto u porastu, 250 mL svaki) korišten je za eluiranje uzoraka. Kromatografski efluenti su primljeni u inkrementima od 250 mL.

Identične frakcije su grupirane i reducirane pod smanjenim tlakom da bi se dobilo pet podfrakcija (IV1–V5); podfrakcije IV1, IV2, IV3 i IV4 samo su malo kromatografirane na koloni Sephadex-LH20 eluirane s MeOH da bi se dobilo 4 (30 mg), 6 (50 mg), 7 (70 mg) i 1 (15 mg, respektivno, dok je subfrakcija IV5 bila značajno čista (10 mg).

2.6. Studija In Silico

2.6.1. Obrnuto spajanje

Vjerojatne molekularne mete za odvojene flavonoide zaključene su podvrgavanjem njihovih struktura virtualnom pregledu ovisno o inverznom spajanju s gotovo svim proteinima predanim u Protein-Data-Bank; PDB.

Za ovaj korak korištena je internetska platforma IdTarget. Ovaj program skrininga male virtualne strukture koristi posebnu inverznu metodu spajanja, naime DivideConquer-Docking, koja konstruira ograničene mreže koje se preklapaju, čineći istraživanje proteina ograničenijim. Kao rezultat toga, može izvesti velik broj pristajanja u kratkom vremenu [8]. Dobiveni rezultati opisani su kao popis ocjena u rasponu od najgorih do najboljih. Kako bismo identificirali optimalne ciljeve proteina za svaku danu strukturu, upotrijebili smo ocjenu afiniteta od -10 kcal/mol kao graničnu vrijednost (Tablica 1).

Eksperimenti simulacije molekularne dinamike (MDS) provedeni su kako su ranije izvijestili Alhadrami et al. 2021 [6]. MDS stroj softvera Maestro (tj. Desmond v. 2.2; Hamburg, Njemačka) korišten je za rad s MDS eksperimentima [9-11]. OPLS-Force-Field korišten je za simulacije.

Priprema proteinskih struktura izvedena je algoritmom System-Builder, u kojem su one pakirane unutar ortorombske vodene kutije (20 Å3 ) korištenjem vodenog modela TIP3P zajedno s Na plus i Cl− ionima, {{ 16}}.15 M za svaki od njih. Zatim su optimizirane modelirane strukture podvrgnute preliminarnom ekvilibriranju tijekom 10 ns. Strukture liganda automatski su parametrizirane tijekom koraka pripreme strukture prema OPLSForce-Field. Proteini koji sadrže metal poput MMP-a koji uključuju kompleks histidin-Zn plus 2 na učinkovitom mjestu trebaju biti parametrizirani tijekom koraka stvaranja proteina. Da nastavimo, treba postaviti hetero stanje za hetero atome kao što je Zn (Generate Hetero States). Ova je funkcija dio maestrovog čarobnjaka za stvaranje proteina. Ovaj korak će olakšati razvoj odgovarajućeg hetero stanja ili koordiniranog kovalentnog stanja za heteroatom (tj. Zn plus 2) u mreži s proteinom tako da polja sile poput OPLS mogu brzo promatrati atom cinka. Za reprodukcije učinjene softverom Nano-scale Molecular Dynamics (NAMD 3.0) [12], topologije i parametri modeliranih struktura određeni su online platformom Ligand Reader and Modeler. Korištene su harmonijske Tcl sile da zadrže Zn plus 2 na mjestu.

Izračun slobodne energije vezanja (∆Gbinding) izveden je kako su prethodno opisali Alhadrami et al. 2021 [6]. ∆Mljevenje je provedeno pomoću postupka perturbacije slobodne energije (FEP) [12], koji je detaljno opisan u publikaciji Kim et al. Ukratko, ova tehnika izračunava potrebnu dostupnu energiju ∆Gbinding pomoću jednadžbe ∆Gbinding=∆GComplex − ∆GLigand. Vrijednost svakog ∆Grinding izračunava se pomoću programa NAMD u zasebnim eksperimentima.

Sve ulazne datoteke mogu se pripremiti putem web stranice CharmmGUI. Datoteke su zatim korištene za izradu planiranih kalkulacija vezanja ∆G korištenjem FEP protokola u NAMD-u. Ravnoteža je kasnije postavljena u NPT (300 K, 1 atm, Langevin-Piston-Pressure "Complex"-"Ligand") u postojanju modela vode TIP3P. Kasnije su napravljene FEP simulacije od 10 ns za svaku strukturu, a zadnjih 5 ns dostupnih količina energije izračunato je za gotove brzine slobodne energije [12]. U konačnici, poze vezanja su predviđene i evaluirane korištenjem VMD programa [13].

2.7. In vitro ispitivanje aktivnosti hijaluronidaze

Inhibicijska aktivnost hijaluronidaze formirana je prema ranije utvrđenoj proceduri koju su odobrili Chaiyana i sur. 2019 [14]. Inhibicijski učinak na aktivnost hijaluronidaze procijenjen je iz sljedeće jednadžbe: inhibicija hijaluronidaze ( postotak )=(1 − A/B) × 100, gdje su A i B karakter hijaluronske kiseline nakon tretmana u postojanju ili nedostatku uzorak, zasebno. Kao pozitivna kontrola primijenjena je 6-O-palmitoil-laskorbinska kiselina. Eksperiment je izveden u tri primjerka.

2.8. In vitro ispitivanje aktivnosti ksantin oksidaze

Inhibicijski potencijal ksantin-oksidaze (XO) proveden je prema prethodno opisanoj metodi [15]. Boja nastala zbog oslobađanja vodikovog peroksida tijekom procesa oksidacije XO mjerena je na 570 nm pomoću čitača ploča EPOCH™ "MICROPLATE READER (BIOTEK)". Četrdeset četiri mikrolitra pufera ksantin oksidaze pomiješano je s 2 µL otopine ksantinskog supstrata i 2 µL XO. L-mimozin je primijenjen kao pozitivna kontrola. Ovaj eksperiment je izveden u tri primjerka.

2.9. In vitro ispitivanje aktivnosti tirozinaze

Inhibicijska aktivnost tirozinaze svakog flavonoida opažena je primjenom DOPAkromskog procesa u skladu sa shemom Momtaza i sur. 2008 [16], koji je modificiran iz Nerya et al. 2003 [17], i Curto et al. 1999 [18]. Inhibicijska aktivnost tirozinaze mjerena je iz sljedeće jednadžbe: inhibicijska aktivnost ( postoci )=(1 − A/B) × 100, (9) gdje su A i B apsorbancije smjese u prisutnosti ili odsutnosti ispitni flavonoid, respektivno. Svaki eksperiment je napravljen u tri primjerka.

3. Rezultati i rasprava

3.1. Fitokemijsko ispitivanje sjemena C. reticulata

Korištenjem UV, 1H i DEPT-Q NMR, osim usporedbe s literaturom i korištenjem nekih autentičnih uzoraka, poznati spojevi kaempferol 1 [19], kaempferol-40 -O- -Dglucopyranoside 2 [19], kaempferol -7-O- -D-glukopiranozid 3 [19], 2-hidroksi genistein 4 [19], hesperetin 5 [19], 3000 (1000-O- - D-glukopiranozil)-saharoza 6 [20], 6(1000 -O- -Dfruktofuranoza)-30 (1"-O- -D-glukopiranozil)-saharoza 7 [20 ], 1-O-elaidoil-glicerol 8 [21], 1- O-oleoil-2-palmitoil-glicerol 9 [22], 1-O-oleoil-glicerol 10 [ 21], (E)-3-((4-metil heptil oksi) karbonil)akrilna kiselina 11 [23], (E)-3-((6-metil nonil oksi) karbonil)akrilna kiselina 12 [23] i -sitosterol 13 [24] (Slika 1) identificirani su iz sirovog etanolnog ekstrakta sjemenki C. reticulata. Svi identificirani spojevi 11 i 12 ovdje su po prvi put odvojeni od roda Citrus ( Slike 1 i S1–S28).Vrijedi napomenuti da su, za razliku od široko rasprostranjenih flavanona i flavona u nadzemnim dijelovima C. reticulata, uključujući plodove, flavonoli izgleda prevladavajući tip flavonoida u sjemenkama.

3.2. In Silico istraga

Kako bismo karakterizirali biološku aktivnost izoliranih spojeva, podvrgli smo ih nizu analiza temeljenih na siliciju. Prvo smo se usredotočili na izolirane flavonoide (1-5) za naš početni virtualni korak probira jer su flavonoidi dobro poznati bioaktivni biljni sekundarni metaboliti. Dodatno, preostali izolirani spojevi (6-13) uobičajeni su primarni metaboliti koji vjerojatno nemaju terapijsku učinkovitost.

Strukture flavonoida 1-5 podvrgnute su virtualnom pregledu temeljenom na pristajanju protiv gotovo svih proteina koji se nalaze u PDB-u. Za ovaj preliminarni zadatak virtualnog pregleda korištena je mrežna platforma idTarget [8]. Dobiveni rezultati dohvaćeni su kao popis od najveće negativne vrijednosti do najmanje. Postavili smo konačnu ocjenu afiniteta od -10 kcal/mol kao graničnu vrijednost kako bismo izdvojili dobre mete za svaki izolirani flavonoid (1-5). Utvrđeno je da su nekoliko zanimljivih molekularnih meta vjerojatno dobre mete za te srodne spojeve, uključujući protein kinaze i sintaze (Tablica 1).

Zanimljivo je da su tri uobičajene molekularne mete prijavljene između ovih enzima flavonoida, hijaluronidaze, ksantin oksidaze i tirozinaze. Ovi enzimi povezani su s održavanjem zdrave kože [25-30], pa je stoga preliminarni korak virtualnog probira navodno identificirao te flavonoide kao vjerojatne agense za promicanje njege kože.

3.3. Simulacija molekularne dinamike i izračun slobodne energije apsolutnog vezivanja

Kako bismo dodatno podržali preliminarni korak probira temeljen na pristajanju, procijenili smo apsolutne slobodne energije vezanja (∆G vezanje) spojeva 1-5 s enzimima hijaluronidazom, ksantin oksidazom i tirozinazom koristeći metodu ovisnu o MDS-u, odnosno metodu perturbacije slobodne energije ( FEP) [26,31].

Kao što je prikazano u tablici 2, samo su spojevi 2, 3 i 5 uspjeli postići najveći afinitet prema enzimima hijaluronidazi, ksantin oksidazi i tirozinazi s vrijednostima ∆Grinding u rasponu od -8,1 do -9,9 kcal/mol. Preostali spojevi imaju vrijednosti ∆Gvezivanja veće od -6 kcal/mol.

Daljnji 50 ns MDS eksperimenti su izvedeni da se ispitaju interakcije i stabilnost vezivanja spojeva 2, 3 i 5 s enzimima hijaluronidazom, ksantin oksidazom i tirozinazom. Kao što je prikazano na slici 2, i spoj 3 i ko-kristalizirani ligand postigli su sličnu stabilnost vezanja unutar veznog mjesta enzima kroz MDS s RMSD od ~2,8 Å od početnih poza spajanja. RMSD spoja 2 0 također je bio sličan onom spoja 3 do 28,7 ns kada počinje malo više odstupati od spoja 3 i ko-kristaliziranog liganda da bi se postigao prosječni RMSD od 3,8 Å kroz MDS. Posljednja snimka izvedena iz MDS-a spojeva 2 i 3 i kokristaliziranog liganda pokazala je da su TYR-75, ASP-129 i GLU-131 uobičajeni aminokiselinski ostaci u interakciji preko H- vezivanje.

Što se tiče ksantin oksidaze, spoj 3 postigao je stabilno vezanje unutar svog aktivnog mjesta kroz MDS, bilježeći prosječni RMSD od 2,6 Å koji je konvergentan onom ko-kristaliziranog inhibitora (RMSD ~2,4 Å). Do takvog stabilnog vezanja spoja 3 očito je došlo zbog mreže H-veza koju je uspostavio s LYS-771, PHE-798, GLU-802, SER-876, ARG{{ 12}}, PHE-911, ARG-912 i THR-1010 (Slika 3).

Konačno, spoj 5 je također bio stabilan unutar aktivnog mjesta tirozinaze tijekom 50 ns MDS s prosječnom RMSD vrijednošću od 4,9 Å, što je bilo više od vrijednosti ko-kristaliziranog inhibitora (RMSD ~3,8 Å). Kao što je prikazano na posljednjoj snimci dobivenoj iz MDS-a, spoj 5 je mogao djelovati u interakciju s dva Zn2 plus iona slično ko-kristaliziranom inhibitoru. Osim toga, stabiliziran je s nekoliko H-veza s LYS-198, GLY-209, TYR-362, ARG-374 i THR-391 (Slika 4 ).

【Za više informacija: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】