Primjena aptamera u neuroznanosti, 2. dio

Drugi neurotransmiter, serotonin, igra ulogu u neuromodulacijskim aktivnostima koje utječu na san, agresiju, apetit i seksualnu aktivnost. Proizvodi se u različitim dijelovima tijela, kao što su mozak, leđna moždina, trombociti i crijeva [81-84].

Serotonin je neurotransmiter koji ima važnu ulogu u ljudskom fizičkom i mentalnom zdravlju. U ljudskom tijelu serotonin regulira raspoloženje, kontrolira apetit i spavanje te potiče osjećaj tjelesnog zadovoljstva i blagostanja. Međutim, serotonin također igra važnu ulogu u utjecaju na pamćenje.

Istraživanja su otkrila da serotonin može poboljšati pamćenje reguliranjem signalizacije između neurona. Kada su ljudi pozitivno stimulirani, tijelo oslobađa serotonin, koji pomaže u jačanju veza između neurona i poboljšava učinkovitost pamćenja. Serotonin također može učiniti ljude kreativnijima, poboljšati mentalnu agilnost i potaknuti ljude da brže uče i razmišljaju.

Osim toga, serotonin može pomoći u smanjenju simptoma tjeskobe i depresije, problema s raspoloženjem koji mogu negativno utjecati na koncentraciju i pamćenje ljudi. Sretno raspoloženje i mentalno stanje često mogu pospješiti prepoznavanje novih stvari i njihovu sposobnost učenja.

Ukratko, serotonin igra neizostavnu ulogu u našem fizičkom i mentalnom zdravlju, učenju i pamćenju. Možemo povećati oslobađanje serotonina i [poboljšati pamćenje] promjenom prehrambenih navika, količine tjelovježbe, metoda učenja itd., njegovanjem pozitivnog i zdravog mentaliteta i stalnim izazivanjem sebe da kontinuirano promičemo poboljšanje pamćenja. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje, jer Cistanche deserticola ima antioksidativno, protuupalno i anti-age djelovanje, što može pomoći u smanjenju oksidacije i upalnih reakcija u mozgu, čime štiti zdravlje živčanog sustava. Osim toga, Cistanche deserticola također može potaknuti rast i popravak živčanih stanica, čime se poboljšava povezanost i funkcija neuronskih mreža. Ovi učinci mogu poboljšati pamćenje, učenje i brzinu razmišljanja, a također mogu spriječiti razvoj kognitivne disfunkcije i neurodegenerativnih bolesti.

Kliknite znajte dodatke za jačanje pamćenja

Neuravnoteženost perifernih razina serotonina povezana je s nekoliko bolesti, uključujući hipertenziju, bolest bubrega i depresiju. Prema tome, korištenje serotonina za predviđanje stanja bolesti i započinjanje pravilnog liječenja ima kliničku važnost.

Razvijen je plazmonični test za serotonin s konjugatom aptamer-AuNP čija se agregacija mijenja u prisutnosti serotonina. Promjena u agregaciji čestica može se mjeriti kao pomak u vršnoj valnoj duljini apsorpcije.

Test je pokazao specifičan odgovor na serotonin i nije dao statistički značajan signal s njegovim metabolitima, 5-hidroksiindooctenom kiselinom (5-HIAA), epinefrinom ili norepinefrinom kada je svaki testiran na 1 µM.

Fetalni goveđi serum, kao mimik ljudskog seruma, također nije pokrenuo nikakav signal [85]. Nedavno su razvijene neurosonde implantabilnog aptamera i tranzistora s efektom polja (FET) za praćenje razine serotonina u moždanom tkivu. Ultratanke In2O3 površine FET-ova na nanomjeri modificirane su aptamerima i te su neurosonde omogućile fM granice detekcije serotonina in vivo s minimalnim biološkim obraštanjem [86].

S dodatnim neuro sondama bit će moguća prostorno-vremenska snimanja neuralaktivnosti kako bi se moždane funkcije mogle razumjeti na mnogo dubljoj razini. Epinefrin je kateholaminski neurotransmiter sa širokim rasponom fizioloških funkcija čije abnormalne razine mogu uzrokovati zdravstvene probleme poput aritmije, infarkta miokarda, krvi povećanje tlaka i plućni edem.

Važno je kvantificirati cirkulirajući epinefrin za promatranje ovih povezanih bolesnih stanja. S tim ciljem razvijena je kolorimetrijska metoda detekcije koja se temelji na interakciji epinefrina s aptamerom funkcionaliziranim Au-NP. Sustav je jeftiniji i specifičniji od drugih tehnika za kvantificiranje epinefrina, poput tekućinske kromatografije i spektrofotometrije.

Također, granica detekcije od 0,9 nM određena je UV-vidljivom spektroskopijom, što je najniža granica detekcije zabilježena za epinefrin korištenjem bilo koje kolorimetrijske metode. Analozi epinefrina, 3,4-dihidroksifeniloctene kiseline (DOPAC), triptofana, askorbinske kiseline, dopamina, tirozina i homovanilne kiseline, pokazali su vrlo slab ili nikakav odgovor, što ukazuje na visoku specifičnost aptasenzora [87].

Promjena razine jednog neurotransmitera može ukazivati ​​na bilo koju od nekoliko bolesti, zbog čega je vrlo malo vjerojatno da se dijagnoza bolesti može postaviti na temelju mjerenja jednog neurotransmitera. Stoga će sposobnost većine aptasenzora da se integriraju u multipleksnu platformu rezultirati dijagnostičkim alatima koji su bolje prilagođeni klinikama i s potencijalom da podrže točniju identifikaciju bolesti.

2.3. Detekcija biomarkera
Biomarker je svaka tvar, struktura ili proces u tijelu koji ili rezultira ishodom ili ukazuje na prisutnost određene bolesti. Mnogi biomarkeri su tvari koje se mogu mjeriti u biotekućinama kao što su krv, slina i urin.

Glavni problem karakterizacije biomarkera za neurološke bolesti je krvno-moždana barijera (BBB) ​​kroz koju mnoge molekule, uključujući mnoge proteine, ne mogu proći. Iako su proteini dominantni biomarkeri za određene bolesti, vjerojatnije je da će mali peptidi, kao što je neuropeptid Y ili fragmenti proteina, proći kroz BBB i biti otkriveni u cirkulaciji.

Metaboliti su još jedna važna skupina biomarkera za neurološke poremećaje. NeoVentures Biotechnology Inc. razvila je pristup odabiru aptamera nazvan FRELEX, koji omogućuje odabir aptamera na temelju natjecanja između kratkog oligonukleotida pričvršćenog na površinu i mete. Kao i za stanični SELEX i druge oblike SELEX-a s promjenom strukture, ovaj se protokol može izvesti s uzorkom koji sadrži mješavinu komponenata bez prethodnog znanja o meti (ciljama) za koju će se odabrati aptameri.

S ovim oblicima SELEX-a, kontra selekcije se izvode s određenim podskupovima komponenti kako bi se potaknuo odabir aptamera koji ispunjavaju željene specifičnosti. Korištenjem FRELEX-a, aptameri su odabrani u odnosu na serum transgenih miševa koji su prekomjerno eksprimirali ljudski tau protein.

Kako bi se potaknuo odabir aptamera prema ljudskom tau i posljedicama prekomjerne ekspresije taua, u protuselekciji je korišten serum miševa divljeg tipa. Grupa je identificirala obogaćene sekvence aptamera pomoću NGS-a i karakterizirala određene aptamere za transgene miševe u kasnom stadiju i miševe divljeg tipa uspoređujući njihovu relativnu zastupljenost.

Pretpostavili su da razlika u obilju odražava odgovarajuću koncentraciju epitopa (povećanih kao odgovor na prekomjernu ekspresiju tau) s kojima aptameri mogu djelovati [29].

3. Dijagnostičke i terapijske primjene

Neurodegenerativne bolesti (ND) uključuju degeneraciju neurona u mozgu što rezultira gubitkom struktura i funkcija središnjeg živčanog sustava. ND može biti uzrokovan starenjem, genetskim i okolišnim čimbenicima.

Demencija je jedna od najčešćih bolesti povezanih sa starenjem kao i Alzheimerova bolest (AD). Parkinsonova bolest (PD) može biti posljedica genetskih mutacija i/ili toksina iz okoliša. Amiotrofična lateralna skleroza (ALS), multipla skleroza (MS), Huntingtonova bolest (HD) i prionske bolesti druge su česte ND s genetskim vezama.

Nažalost, za ove bolesti nisu dostupni niti učinkoviti lijekovi niti strategije ranog otkrivanja. Poput naširoko korištenih protutijela, aptameri su postali atraktivni agensi za primjenu u razvoju novih biosenzora za ranu dijagnozu ND-a i liječenje ovih bolesti [88].

3.1. Alzheimerova bolest

Kao progresivni poremećaj mozga povezan sa starenjem koji rezultira mentalnim nedostacima, AD je najčešći oblik demencije. Njegovu patologiju karakterizira agregacija amiloida- (A) koja potječe iz proteina prekursora amiloida (APP) i inicirana je u području mozga hipokampusa.

Iako su znanstvenici pretpostavili da je neurotoksičnost izazvana A povezana s netopivim A plakovima (AP) i fibrilima (AF), noviji dokazi pokazuju da su topljivi A oligomeri (AO) također povezani s pojavom AD.
Stoga je AO identificiran kao atraktivan biomarker za ranu dijagnozu AD, a A i tau se smatraju značajnim terapijskim ciljevima za liječenje AD [89].

3.1.1. AD dijagnostika

Rano opisani aptameri protiv AO imali su niske afinitete i specifičnosti, no kasnije su studije bile uspješnije u identificiranju aptamera koji su selektivno prepoznavali fibrile 40-rezidualnog oblika A (A 40), ali ne i A 40 polimera [90].

Međutim, aptamerima je nedostajala visoka specifičnost za fibrile A 40 u odnosu na fibrile nekoliko drugih amiloidogenih proteina koji su testirani. DNA aptamer odabran za interakciju s -sinukleinskim (-syn) oligomerom s 68-nM afinitetom također se pokazao da veže AO s 25-nM afinitetom [91]. U 2019., korištenjem istih aptamera koje su dobili Tsukakoshi i dr., razvijen je elektrokemijski aptasenzor bez oznaka za specifičnije prepoznavanje AO [92].

Aptamer sam sastavlja elektrode od zlatne šipke putem tiolne (-S) interakcije i sustav ima granicu detekcije od 30 ppm, koju određuje EIS. Ovo je bio prvi aptamer koji se uspješno koristio za praćenje agregacije proteina A na temelju EIS-a, što je bilo moguće zbog visoke selektivnosti aptamera među vrstama A. Uz jednostavnu izradu i učinkovitu regeneraciju, ovaj aptasenzor bi mogao biti obećavajući dijagnostički alat za rano otkrivanje AD i za demonstraciju nakupljanja proteina A [92].

Aptasenzor za otkrivanje A oligomera razvijen je korištenjem -syn DNA aptamera [91] u kompleksu s metilen plavim (MB) i pričvršćen na nanoporozni anodikalluminij. Visoki koeficijent apsorpcije MB za bijelu svjetlost rezultirao je niskim intenzitetom reflektirane bijele svjetlosti.

U prisutnosti A oligomera, kompleks aptamer/MB disocira i povećanje reflektirane svjetlosti detektirano je interferometrijskom reflektacijskom spektroskopijom (IRS) [93]. Aptasenzor je imao granicu detekcije od 8 pM i dobar odgovor na A oligomere, u rasponu koncentracija od 0.5 do 50 nM. Neurofibrilarni čvorovi (NFT) patološki su znakovi AD.

Stvaranje NFT-a započinje u hipokampusu, a opseg stvaranja NFT-a povezan je s težinom demencije u AD-u. Hiperfosforilacija proteina povezanog s mikrotubulama, tau, potiče njegovu sposobnost regrutiranja i organiziranja normalnog tau u filamente, koji postaju NFT. Stoga je hiperfosforilacija tau predložena kao jedan od glavnih uzroka AD.

Osim svoje normalne uloge u promicanju sastavljanja mikrotubula i stabilizaciji okupljenih mikrotubula, neravnotežnom kapilarnom elektroforezom (CE) uočeno je da tau veže tri nasumično odabrana ssDNA oligonukleotida, od kojih je jedan, ssDNA1, vezan za tau381 s visokim afinitetom (Kd {{ 3}} nM) [94].

Aptamer/antitijela sendvič analiza razvijena je korištenjem ssDNA1 za otkrivanje femtomolarne koncentracije tau proteina u ljudskoj plazmi površinskom plazmonskom rezonancijom (SPR) [95].

U drugoj studiji, DNA aptameri su odabrani u odnosu na cijeli tau protein od 441 aminokiseline (tau441) tehnikom brze selekcije koja se temelji na dijeljenju kapilarne elektroforeze s tri runde selekcije dovršene u jednom danu. Pet aptamera odabranih iz rezultata sekvenciranja visoke propusnosti ocijenjeni su od strane SPR-a za njihovu sposobnost prepoznavanja tau.

Analitički potencijal aptamera s višim afinitetom pokazan je testom anizotropije fluorescentne homogene faze. Ovaj aptamer visokog afiniteta vezao je protein tau441 i kraće izoforme, tau352, tau381 i tau383 s granicama detekcije od 28 nM, 6,3 nM, 3,2 nM i 22 nM, redom, u ovom testu [96].

3.1.2. AD Therapeutics

Kao jedna od potencijalnih terapija, RNA aptameri su odabrani za inhibiciju A 40 agregacije. Tijekom selekcije, A oligomer je konjugiran s nanočesticama zlata (A -AuNPs) i dva aptamera su identificirana kao aptamer kandidati nakon SELEX-a.

Djeca od 10–20 nM. Ovi aptameri su inhibirali stvaranje A plaka i fibrila kao što je otkriveno transmisijskom elektronskom mikroskopijom i A 40 enzimski vezanim imunosorbentnim testom (ELISA) [97].

Peptid mamac (DP) alkohol dehidrogenaze (ABAD), koji stupa u interakciju s A, antagonizira citotoksičnost A peptida. ABAD-DP sekvenca umetnuta je između dva tiola koji tvore disulfidnu vezu u tioredoksinu (TRX) kako bi se stvorio TRX1-ABAD-DP-TRX2peptidni aptamer. Njegova stabilna ekspresija u NIH 3T3 stanicama korištenjem adeno-povezanih virusa potvrđena je imunofluorescentnim bojenjem.

Eksprimirani aptamer mogao bi vezati peptid A i poboljšati vitalnost stanica. Ovo istraživanje potvrdilo je učinkovitu inhibiciju citotoksičnog učinka peptida A pomoću peptidnih aptamera [98]. Tau proteini se normalno povezuju s mikrotubulima i stabiliziraju ih, ali njihova hiperfosforilacija može rezultirati proteinskim nakupinama koje se nazivaju "tauopatija", što je toksično.

DNA aptamer Tau-1, koji je odabran nasuprot ljudskom tau441, inhibira oligomerizaciju Tau1 in vitro [99]. Ova je inhibicija također potvrđena u studijama stanične kulture upotrebom stanica HEK293 [100]. Beta-sekretaza (BACE1) ima ulogu u proizvodnji A, a inhibicija ekspresije BACE1 je smrtonosna kod miševa. Liječenje AD-a može uključivati ​​modulaciju BACE1.

Međutim, njegovo veliko aktivno mjesto čini BACE1 izazovnom metom za inhibitore malih molekula. Kako bi se to zaobišlo, aptameri nukleinske kiseline mogli bi biti novi alati za inhibiciju aktivnosti BACE1. Ovaj enzim ima citoplazmatski rep, B1-CT, koji služi kao mjesto spajanja za proteine ​​kao što je bakreni šaperon za superoksid dismutazu-1 (CCS) i protein koji veže faktor ribozilacije (GGA1).

Fiziološka uloga B1-CT-a uglavnom je nepoznata. RNA aptamer koji cilja na B1-CT veže membranski proksimalnu polovicu C terminala BACE1 spriječio je regrutiranje CCS-a dok je dopuštao vezanje GGA1 na BACE1 i regulirao transport BACE1 do reciklirajućih endosoma [101].

Za specifično ciljanje BACE1, DNA aptameri, BI1 i BI2, generirani su protiv BACE1, koji je inhibirao BACE1, ali ne i alfa- ni gama-sekretazu. Koristeći stabilno transficiranu staničnu liniju HEK293, eksprimirali su prekursor amiloidnog proteina (APP) i, koristeći in vitro test fluorescentnog rezonantnog prijenosa energije (FRET), pokazali su da je razina A smanjena, a stanični nedostatak spašen u primarnoj kultiviranoj liniji neuronskih stanica [102]. Učinkovitost aptamera dodatno je poboljšana dodatkom kolesteriltetraetilen glikola (TEG).

3.2. Parkinsonova bolest

Parkinsonova bolest (PD) je druga najčešća neurodegenerativna bolest, koja pogađa oko sedam milijuna ljudi u svijetu. Iako je progresivna bolest koju karakteriziraju motorička i nemotorička svojstva, ona ima značajan klinički učinak na pacijente zbog gubitka pokretljivosti i kontrole mišića.

Gubitak strijatalnih dopaminergičkih neurona i gubitak neurona u nedopaminergičkim područjima karakterizira PD. Gubitak neurona općenito je povezan s karakterističnim formiranjem Lewyjevih tjelešaca. Stoga se prisutnost Lewyjevih tjelešaca koja sadrže -syn oligomere u mozgu smatra mogućim terapeutskim i dijagnostičkim ciljem za PD.

3.2.1. PD dijagnostika

Prvi aptamer, "M5-15", odabran protiv -syn nije bio specifičan za oligomere i također se mogao vezati na -syn monomere [103]. DNA aptameri, zatim odabrani, pokazali su interakciju s -syn oligomerima, a ne s -syn monomerima, ali su vezali A 1-40 oligomere.

Istraživači su također istražili specifičnost aptamera za -syn oligomere u odnosu na druge proteine ​​sa strukturama koje su pretežno -sheet, kao što je -sheet propeler struktura pirolokinolin kinin glukoza dehidrogenaze (PQQH), i dokazali da aptamer ne veže PQQH [91]. Za aptasenzore je objavljeno da mogu kvantificirati -sinoligomere.

Kolorimetrijski aptasenzor, koji koristi DNA aptamer protiv -sinoligomera, adsorbiran je na nanočestice zlata (AuNP), što je spriječilo agregaciju nanočestica izazvanu solju. Njegovo vezanje na -syn oligomer sprječava apsorpciju aptamera na površini AuNP-ova, što omogućuje agregaciju AuNP-ova da se pokrene u visokim koncentracijama soli i rezultira promjenom boje.

Za ovaj je sustav prijavljen LoD od 10 nM. Međutim, serum (čak i pri 2%) pridonio je apsorpciji spojeva u rasponu promjene boje u testu i ometao agregaciju aptamer-Au-NPs ovisnu o soli.

Aptasenzori koji koriste EIS i SPR bili su osjetljiviji, s LoD-ovima od 1 pM, odnosno 8 pM [104]. Utvrđeno je da je EIS aptasenzor vrlo specifičan za oligomere u odnosu na monomere i na njega ne utječe prisutnost seruma [104]. Razrađeni dizajn za elektrokemijski aptasenzor za otkrivanje -syn oligomera uključivao je hibrid formiran komplementarnom sekvencom za -syn oligomer aptamer povezan s površinom zlata preko tiolne veze i uključivao terminalnu deoksinukleotidil transferazu (TdT) i dTTP za produljenje 30 krajeva aptamera i njegovog nadopuniti dodatnim polipom.

Proširena ssDNA vezala je metilensko modrilo i pospješila njegovo povezivanje sa zlatnom površinom, stvarajući tako elektrokemijski signal. Osim toga, sustav je sadržavao egzonukleazu I (Exo I), specifičnu za ssDNA. Kada je aptamer uklonjen iz binarnog kompleksa sa svojim komplementom svojim vezanjem na -syn oligomer, komplementarne niti su probavljene pomoću Exo I, sprječavajući nakupljanje metilen plavog na površini zlata i tako smanjujući elektrokemijski signal.

Granica detekcije bila je 10 PM (S/N=3), a oporavak signala u prisutnosti 10% i nižih koncentracija seruma bio je vrlo prihvatljivih 95,3-107% [105]. Međutim, njegova složenost i ugradnja enzima čine ovaj sustav manje vjerojatnim da će biti stabilan za skladištenje i ponovljiv na terenu. Kombinacija kapilarne elektroforeze-masene spektrometrije (CE-MS) s ekstrakcijom čvrste faze (SPE) za predkoncentriranje cilja s mikro uloškom modificiranim aptamerom u velikom volumenu ubrizganih uzoraka smanjio je granicu detekcije 100-puta u usporedbi sa CE-MS sustavima.

U ovom novom sustavu, uzorak se čisti, a volumen se minimizira za poboljšanu analizu upotrebom mikro uloška koji selektivno zadržava metu. Utvrđeno je da je aptamer afinitetni (AA) sorbent u ulošku bolja alternativa antitijelu imunoafinitetni (IA) sorbent kao pozadinski elektroliti potrebni za ispiranje sustava također denaturiraju antitijela.

Razvoj AA-SPE-CE-MS postignut je modificiranjem mikro uloška s M5-15 DNA aptamerom. Sustav je pokazao LoD od 2,8 nM i imao je linearni raspon detekcije između 7 i 140 nM -syn u uzorku krvi.

Također, identifikacija slobodnih i N-acetiliranih -syn proteoformi bila je moguća kao rezultat vrlo precizne detekcije mase i moći razlučivanja MS-a. Konačno, utvrđeno je da je mikro uložak stabilan čak i s kiselim BGE i da se može koristiti za oko 20 analiza s malom vjerojatnošću pogrešne kvantifikacije cilja [106].

For more information:1950477648nn@gmail.com