Primjena aptamera u neuroznanosti, 1. dio

Sažetak:

Budući da su dominantan uzrok invaliditeta, neurološke bolesti su dobile veliku pozornost globalne zdravstvene zajednice.

Živčani sustav je važan dio ljudskog tijela. Odgovoran je za ljudsku percepciju, razmišljanje, kretanje, psihologiju i emocije. Međutim, neki ljudi mogu imati neurološke probleme koji utječu na njihovo pamćenje. Bolesti živčanog sustava odnose se na patološke promjene u središnjem živčanom sustavu i perifernom živčanom sustavu, kao što su moždani udar, Parkinsonova bolest, Alzheimerova bolest itd. Ove bolesti utječu na pamćenje, ali ih svi možemo prevladati aktivnim metodama. Poboljšajte ga.

Prvi je moždani udar. Prema statistikama, milijuni ljudi godišnje dožive moždani udar, a jedan od najčešćih simptoma je gubitak pamćenja. Moždani udar je vrlo štetan za tijelo jer utječe na dijelove mozga koji opskrbljuju kisikom i krvlju. Ipak, moždani udar možemo spriječiti vježbanjem i promjenom prehrambenih navika. Primjerice, pravilna tjelovježba, održavanje normalne tjelesne težine i zdrava prehrana mogu učinkovito smanjiti rizik od moždanog udara i tako održati bolje pamćenje.

Sljedeća je Parkinsonova bolest. Ovo je bolest poremećaja kretanja uzrokovana smrću neurona. Osim kretanja, Parkinsonova bolest može utjecati i na pamćenje. Studije pokazuju da većina pacijenata razvije kognitivno oštećenje, uključujući gubitak pamćenja. Međutim, pacijenti mogu poduzeti različite mjere kako bi odgodili napredovanje bolesti, poput redovitog stručnog liječenja i rehabilitacijske obuke. Imati hobije poput slušanja glazbe, čitanja i učenja novih vještina također može biti korisno za opuštanje mozga i pomoć pri oporavku pamćenja.

Na kraju, tu je i Alzheimerova bolest. To je bolest koja uzrokuje kognitivno oštećenje, a gubitak pamćenja je jedan od najočitijih i najčešćih simptoma. Međutim, Alzheimerova bolest također je bolest koja se može povući. Istraživanja pokazuju da vježbanje, zdrava prehrana, učenje novih vještina i volontiranje mogu usporiti napredovanje bolesti i poboljšati pamćenje.

Uvijek trebamo imati pozitivan stav i koristiti aktivne metode za prevenciju i liječenje neuroloških bolesti kako bismo poboljšali svoje pamćenje. Čak i ako smo pogođeni, možemo poduzeti različite mjere kako bismo poboljšali svoju otpornost i sposobnost borbe protiv bolesti. Sve dok ustrajemo, pronaći ćemo bolji, zdraviji put za prevenciju i liječenje gubitka pamćenja. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje jer je Cistanche deserticola tradicionalni kineski ljekoviti materijal koji ima mnogo jedinstvenih učinaka, a jedno od njih je i poboljšanje pamćenja. Djelotvornost Cistanche deserticola proizlazi iz brojnih aktivnih sastojaka koje sadrži, uključujući taninsku kiselinu, polisaharide, flavonoidne glikozide itd. Ovi sastojci mogu promicati zdravlje mozga na različite načine.

Pritisnite Know za poboljšanje kratkoročnog pamćenja

Više od milijardu ljudi pati od jednog od sljedećih neuroloških poremećaja: demencije, epilepsije, moždanog udara, migrene, meningitisa, Alzheimerove bolesti, Parkinsonove bolesti, multiple skleroze, amiotrofične lateralne skleroze, Huntingtonove bolesti, prionske bolesti ili tumora mozga. Dijagnoza i mogućnosti liječenja su ograničene za mnoge od ovih bolesti.

Aptameri, budući da su male i neimunogene molekule nukleinske kiseline koje je lako kemijski modificirati, nude potencijalne dijagnostičke i terapeutske primjene za ispunjavanje ovih potreba.

Ovaj pregled pokriva pionirske studije u primjeni aptamera, koje obećavaju buduću dijagnostiku i liječenje neuroloških poremećaja koji predstavljaju sve strašnije zdravstvene izazove u svijetu.

Ključne riječi: aptamer; neuroznanost; neurološke bolesti; neurološki poremećaji; neurotoksini; Rak.

1. Uvod

Aptameri su jednolančane DNA, RNA ili sintetičke XNA molekule koje se mogu saviti u jedinstvene trodimenzionalne (3D) strukture pomoću kojih vežu svoje ciljne molekule s visokom specifičnošću i afinitetom [1,2].

Pristup odabiru aptamera postignut je 1990. godine od strane tri odvojene skupine [3-5]. Metoda je sada poznata kao sustavna evolucija liganda eksponencijalnim obogaćivanjem (SELEX). Od tada su mnogi aptameri odabrani za upotrebu u područjima temeljne znanosti, a sve je veći broj aptamera nedovoljno razvijen za primjenu u terapiji, dijagnostici i slikanju [6-10].

SELEX metoda simulira Darwinovu evoluciju in vitro. Uključuje nekoliko krugova selekcije, a nakon svakog kruga provodi se eksponencijalna amplifikacija "najprikladnijih" oligonukleotida (oligosa).

Jedna runda tradicionalnog SELEX-a uključuje tri koraka u redoslijedu (1) inkubirati željenu ciljnu molekulu sa skupom oligoa sa središnjim područjem od 20-60 nukleotida randomiziranog slijeda okruženim terminalnim regijama konstantnog slijeda koji će biti uzorci za kasnije lančane reakcije polimeraze (PCR ), (2) uhvatiti oligo u skupu koji uspješno veže metu i (3) umnožiti uhvaćene oligo pomoću PCR ili reverzne transkripcije-PCR (rt-PCR), ovisno o vrsti oligo, DNA ili RNA.

Runde kontra-selekcije također su uključene, u kojima se skup nukleinske kiseline prenosi preko prazne prateće matrice, bez željenog cilja ili preko prateće matrice s jednom ili više drugih molekula koje bi mogle biti strukturno srodne ciljnoj molekuli.

U kontra-selekciji, oligosi koji ne vežu potpornu matricu ili strukturno srodne molekule su uhvaćeni i nastavljeni kroz više krugova SELEX-a.

Protuselekcija se provodi u mnoge svrhe, kao što je eliminacija oligosa koji su u interakciji s (1) potpornom matricom, (2) analozima ili molekulama koje su strukturno povezane s metom, ili (3) molekulama prisutnim u visokim koncentracijama u biološkoj matrici (kao što je serum ili ekstrakt tkiva) u kojem će djelovati odabrani aptamer.

Glavni cilj protuselekcije je povećati specifičnost aptamera za željenu metu u odnosu na druge potencijalne molekularne konkurente. Osim konvencionalnog SELEX-a, nedavno razvijeni SELEX s promjenom strukture postaje popularan [11-13].

U ovom pristupu, oligosi moraju promijeniti svoje strukture kada stupaju u interakciju s metom, kako bi se odvojili od komplementarne sekvence hvatanja. Ovo osigurava da odabrani adaptameri mijenjaju strukturu nakon vezanja liganda. Razvijene su i druge alternativne SELEX metode uključujući CE-SELEX, Cell-SELEX i in-vivo SELEX, kao što je sažeto prikazano u tablici 1.

Sasvim je moguće kombinirati različite SELEX postupke za razvoj još složenijih tehnika. Nakon što SELEX odabere aptamere, oni se dalje modificiraju kako bi poboljšali svoje specifičnosti i afinitete pomoću nekoliko pristupa koji se, u cjelini, mogu nazvati sazrijevanjem.

Nekoliko je razmatranja pri odabiru i sazrijevanju aptamera. Prvo, na strukture aptamera i interakcije aptamer-cilja utječu temperatura i komponente pufera, uključujući ione, ionsku snagu i pH.

Stoga je jedna od najvažnijih točaka u dizajnu SELEX-a oponašanje okoline (biološki matriks ili sastav soli/pufera) tijekom odabira u kojem se nalazi molekularna meta aptamera i gdje će se dogoditi interakcija između aptamera i mete.

Odabir odgovarajućeg sastava pufera i temperatura inkubacije osigurat će optimalnu učinkovitost odabranih aptamera u uvjetima u kojima će se primjenjivati ​​[4,30–32].

Drugo, stabilnost aptamera možda treba poboljšati, budući da su aptameri DNA i RNA potencijalne mete za napade nukleazom. To je posebno slučaj za RNA, zbog skupine 20OH, koju ribonukleaze koriste u elektrofilnom napadu fosfata okosnice nukleinske kiseline za hidrolizu.

Dakle, RNA je labilnija na visoke temperature i pH od DNA. Aptameri se mogu sazrijeti kemijskim modifikacijama nakon odabira kako bi se prevladala ova osjetljivost. Međutim, takve modifikacije mogu rezultirati gubitkom specifičnosti i/ili afiniteta aptamera.

Stoga je obično bolje uključiti modificirane nukleotide tijekom SELEX-a. Mnoge moguće modifikacije aptamera navedene su u tablici 2.

Mogu se odabrati aptameri koji selektivno vežu većinu virusa, stanica, bakterija, proteina, toksina i peptida s visokim afinitetom [45-48]. Mogu se koristiti više puta bez primjetnog prekida aktivnosti. Drugim riječima, mogu se odvojiti od svojih meta za daljnju upotrebu.

Nasuprot tome, antitijela se mogu upotrijebiti samo nekoliko puta prije nego što izgube funkcionalnost. Aptameri nukleinske kiseline također mogu sazrijeti da budu stabilniji od protutijela i enzima, osobito na višim temperaturama [2].

Štoviše, nakon što je sekvenca aptamera poznata, njegova kemijska sinteza i pročišćavanje do homogenosti vrlo su ponovljivi i jeftini. Ova svojstva daju aptamerima potencijal za zamjenu za antitijela kao komponente senzorskih jedinica [49].

Fleksibilnost struktura aptamera i njihova sposobnost da "maskiraju" regije sekvence aptamera s komplementarnim oligosima pruža opcije za signaliziranje koje omogućuju ugradnju aptamera u mnoge senzorske platforme, koje se ne mogu lako prilagoditi antitijelima. Ova svojstva motiviraju razvoj biosenzora temeljenog na aptameru [50-52].

Razvijanje novih alata za dijagnozu jedno je od najistaknutijih područja u polju biosenzora, a mnogi istraživači nastoje stvoriti jednostavne, učinkovite i jeftinije metode za postizanje rane dijagnoze i precizne medicine.

Uključivanje aptamera u biosenzore (nazvane "aptasenzori") ukorijenilo se 1990-ih.

Rani primjer aptamera kao elemenata za bioprepoznavanje je optički biosenzor koji je koristio fluorescentno obilježene aptamere protiv humane neutrofilne elastaze u homogenom testu [53].

Od tada su prijavljeni mnogi tipovi dizajna aptasenzora, većina s aptamerima na čvrstim nosačima, te s elektrokemijskim, optičkim, mehaničkim i akustičnim signalima [45,54-56]. Neki primjeri se raspravljaju kasnije u ovom članku.

Aptameri su također primijenjeni u terapiji. Modifikacije koje rezultiraju produljenim poluvrijemima života i poboljšanom farmakokinetikom čine neke aptamere dobrim opcijama za kliničku primjenu. U usporedbi s protutijelima, aptameri su puno manje imunogeni, a njihovo djelovanje može biti inhibirano obrnutim komplementarnim oligonukleotidima (Munzar et al., 2019).

Ove važne karakteristike preporučuju aptamere za razvoj kao terapeutike. Macugen (pegaptanib natrij), koji selektivno prepoznaje faktor rasta vaskularnog endotela (VEGF), bio je prvi aptamer koji je odobren kao terapeutsko sredstvo (Tobin, 2006).

Od tada je nekoliko aptamera doseglo različite stupnjeve kliničkih ispitivanja u kojima se testiraju za liječenje medicinskih stanja kao što su rak malih stanica pluća, poremećaj povezan s von Willebrandfactorom, angiomi i karcinomi bubrežnih stanica [51,57-60].

Još jedna potencijalna terapijska primjena aptamera uključuje sustave isporuke [61,62]. Da bi se postigli učinkoviti rezultati u tim sustavima, aptameri bi trebali prepoznati proteine ​​stanične površine u njihovim izvornim oblicima.

Cell-SELEX je razvijen za selekciju proteina na površini stanice koje je često teško pročistiti u njihovim prirodnim oblicima [63]. Aptamer koji prepoznaje protein na površini stanice može kooptirati receptor za internalizaciju tereta vezanog za aptamer. Ovom metodom se mogu odabrati aptameri za receptore primarno izražene na jednom tipu stanice koji se može ciljati in vivo [57].

Na primjer, anti-PSMA (prostata-specifični membranski antigen) aptameri razvijeni su za isporuku siRNA u tumore kod miševa ili kultiviranih stanica [62,64-66].

U neuroznanosti je uporaba aptamera do sada bila ograničena, iako ima vrlo širok raspon potencijalnih primjena. Aptameri su prijavljeni kao moguće mogućnosti liječenja neurodegenerativnih bolesti koje rezultiraju gubitkom strukture i funkcije središnjeg živčanog sustava (CNS), uključujući Alzheimerovu bolest (AD), Parkinsonovu bolest (PD), Creutzfeldt-Jakobovu bolest, bolesti motoričkih neurona i Huntingtonovu bolest (HD) (Slika 1). Trenutačno se oko 50 milijuna ljudi u svijetu suočava s demencijom, za koju je globalni trošak zdravstvene skrbi blizu trilijun američkih dolara godišnje.

Zbog toga su demencije jedan od najvećih medicinskih i ekonomskih problema našeg društva [67]. Također, prema podacima Ujedinjenih naroda i Svjetske zdravstvene organizacije, procjenjuje se da će se svjetska populacija starija od 65 godina udvostručiti do 2050. godine.

Stoga će neurodegenerativne bolesti ovisne o dobi zahtijevati sve veće troškove za dijagnostiku i liječenje [67].

Ovi kritični zahtjevi za metodama za olakšavanje rane dijagnoze i nove terapijske primjene mogu se ispuniti aptamerima, koji bi također mogli biti rješenja za neke od temeljnih komplikacija [68,69].

Aptameri se razvijaju za primjenu u tehnologijama snimanja mozga (MRI, PET, itd.), vizualizaciji neurotransmitera, dijagnostici i terapiji za tumore mozga i druge bolesti povezane s mozgom. U mnogim od ovih pristupa, aptameri su obilježeni radiotracerima, kao što je fluor -18 za PET snimanje [70]. U ovom pregledu raspravljat ćemo o postignućima i izazovima primjene aptamera za oslikavanje mozga i neuralne bolesti.

2. Molekularna detekcija

2.1. Detekcija neurotoksina
Neurotoksini su kemijski raznolika skupina farmakološki aktivnih spojeva. Oni imaju jasne biološke učinke na živčane sustave organizama, ali se razlikuju po svojim kemijskim strukturama i mehanizmima djelovanja.

Oni mijenjaju akcijske potencijale i tako ometaju prijenos živčanih impulsa. Kako bi se ispravno procijenili njihovi rizici za ljudsko zdravlje i utjecaj na okoliš, neophodno je koristiti dovoljno osjetljive tehnike za njihovu točnu identifikaciju.

Aptameri nukleinskih kiselina korišteni su za provjeru prisutnosti ovih toksina u vodi i biološkim uzorcima s visokom osjetljivošću i selektivnošću [71]. Zabilježena su istraživanja koja pokazuju točnu identifikaciju botulinum neurotoksina (Botulinum A, E), saksitoksina, brevotoksina, parakvata i tetrodotoksina pomoću aptasenzora.

Botulinum neurotoksini (BoNT) su među najsmrtonosnijim neurotoksinima i potencijalno bi se mogli koristiti kao bioteroristički agensi. Kako bi se odgovorilo na ključnu potrebu za osjetljivim, učinkovitim sustavom za detekciju BoNT-a u stvarnom vremenu, SELEX na bazi sol-gela korišten je za izolaciju DNA aptamera protiv botulinum neurotoksina tipa E (BoNT-E) [47].

Aptamerkandidatske sekvence, nakon pete runde, analizirane su sekvenciranjem sljedeće generacije (NGS) i karakterizirani su visokofrekventni aptameri. U ovim obiteljima aptamera, aptamerBT5.6 pokazao je visok afinitet, od 53 nM Kd, za BoNT-E i bio je imobiliziran na platformi grafenoksida. Ovaj senzor je pokazao 0.83 nM granicu detekcije (LoD) za BoNT-E.

Brevotoksini (BTX) i saksitoksini su morski neurotoksini koji uzrokuju neurološko trovanje školjkama (NSP). BTX-ove karakterizira visoka toksičnost i brzi početak NSP-a. Tehničke poteškoće povezane s njihovom analizom potaknule su istraživače na potragu za alternativnim, učinkovitim i jeftinim metodama otkrivanja ovih jakih neurotoksina.

U tu svrhu razvijen je elektrokemijski aptasenzor za otkrivanje BTX-2, za koji su ovi odabrani DNA aptameri karakterizirani pomoću spektroskopije elektrokemijske impedancije (EIS) i fluorescencije.

Aptamer BT10, s afinitetom od 42 nM za BTX-2, ugrađen je u konkurentni impedimetrijski biosenzor bez oznaka koji je pokazao granicu detekcije od 95 pM BTX-2.

Ovaj aptasenzor uspio je detektirati BTX-2 u ekstraktu školjkaša s šiljcima s pouzdanim odgovorom u prisutnosti matrice školjkaša [72]. Kao druga klasa morskih neurotoksina, saksitoksin je karakteriziran javnozdravstvenim značajem.

Nove studije su morale biti razvijene kao prikladne alternative zbog tehničkih i etičkih pitanja trenutno primijenjenih sustava. Kako bi se odgovorilo na ovu potrebu, razvijen je kompetitivni aptasenzor optičke bioslojne interferometrije bez oznaka. Biosenzor ima granicu detekcije od 1,66 nM za saksitoksin, s visokim stupnjem selektivnosti i osjetljivosti, dobrom stabilnošću i mogućnošću brzog otkrivanja [73].

Slično morskim toksinima, neurotoksini koji se oslobađaju nakon ugriza zmije među najmoćnijim su i najsmrtonosnijim otrovima. Nažalost, konvencionalna dijagnostika zmijskog ugriza temeljena na testovima zgrušavanja krvi i kliničkim simptomima ne može dati točnu dijagnozu. Također, varijacije učinka protutijela ovisne o seriji kompliciraju njihovu upotrebu u dijagnostici.

Skraćena verzija -Tox-FL aptamera visokog afiniteta, izvorno odabrana protiv bungarotoksina Bungarus multicinctus (-Tox-T2) s višim afinitetom (Kd=2.8 nM) od roditeljskog -Tox-FL (18 nM), primijenjen je u formatu enzimski vezanog aptamera.

U ovoj postavci, -Tox-T2 aptamer mogao je otkriti -toksin u samo 2 ng sirovog otrova, što je pokazalo njegov potencijal za otkrivanje otrova Bungarus caeruleus [74].

2.2. Detekcija neurotransmitera

Za istraživanje funkcionalne složenosti mozga može se koristiti praćenje aktivnosti neurotransmitera i signalnih putova. Neurotransmiteri su bitni za prijenos informacija između stanica i igraju ključnu ulogu u neurološkim poremećajima kao što su epilepsija, Parkinsonova bolest (PD) i Alzheimerova bolest (AD).

U nekoliko studija, aptameri specifični za dopamin, epinefrin ili serotonin korišteni su za razvoj biosenzora na bazi aptamera za detekciju neurotransmitera, in vivo i in vitro [75].

Kateholaminski neurotransmiter, dopamin (DA) regulira aspekte ljudskog metabolizma, te funkcije kardiovaskularnog i bubrežnog sustava. Za nekoliko neurodegenerativnih bolesti, posebno PB, pokazalo se da su u izravnoj korelaciji s abnormalnim metabolizmom DA [76].

Stoga je razvoj vrlo osjetljivih i selektivnih biosenzora za određivanje DA važan u biološkim sustavima. Prvi RNA aptamer protiv DA, dopa2, vezao je DA s afinitetom predstavljenim s Kd=2.8 nM [77].

Koristeći ovaj aptamer, elektrokemijski aptasenzor bez oznaka temeljen na kompozitnom filmu grafena i polianilina uspješno je otkrio prisutnost DA nehumanog seruma, s LoD od 1,98 pM [78]. U novijoj studiji razvijen je još jedan DA aptasenzor sastavljen od DNA aptamera kao senzora i kompozita kolagen grafen oksida kože amura (GCSC-GO) kao pretvarača.

Kompozit je pripremljen ultrazvukom i karakteriziran infracrvenom (IR) i Ramanovom spektroskopijom, mikroskopijom atomske sile i EIS. Ovaj sustav je uključivao imobilizaciju aptamera na kolagen nakon čega je slijedila diferencijalna pulsna voltametrija.

Iako je aptasenzor pokazao viši LoD od 0.75 nM, u usporedbi s ranijim senzorom s 2 pM, pokazao je visoku selektivnost za DA pretijesno povezane spojeve i točno izmjeren DA u prisutnosti 10% seruma [79].

Za analizu različitih molekula sa slobodnom oznakom, visokom osjetljivošću i selektivnošću nedavno je objavljen mikrokonzolni senzor s aptamerima. Senzor se sastoji od niza od 12 mikrokonzola modificiranih tioliranim DA aptamerima i koristi zlatne nanočestice (AuNP) konjugirane s nizom DNK koji je komplementaran DAaptameru na površini mikrokonzole.

U početku hibridizirani s DA aptamerom, konjugati AuNP-DNA oslobađaju se kada aptamer veže DA, što povećava površinski stres niza za oko 15 puta i povećava otklon.

Sustav ima linearni odgovor u rasponu od 0,5 do 4 µM DA s LoD od 77 nM. Njegova specifičnost je pokazana s 12 strukturnih i funkcionalnih analoga uključujući L-DOPA, od kojih nijedan nije inicirao defleksiju [80].

For more information:1950477648nn@gmail.com