Apikalni smični stres pojačan organski transport kationa u ljudskim OCT2/MATE1-transfektiranim stanicama Madin-Darby psećeg bubrega uključuje senzor cilijara

Za više informacija:emily.li@wecistanche.com

Aishwarya Jayagopal, Paul R. Brakeman, Peter Soler, Nicholas Ferrell, William Fissell, Deanna L. Kroetz i Shuvo Roy

Zavodi za bioinženjering i terapijske znanosti (AJ, PS, DLK, SR) i pedijatriju (PRB),

Kalifornijsko sveučilište San Francisco (UCSF), San Francisco, Kalifornija;

i Odjel medicine, Odjel za nefrologiju, Medicinski centar Sveučilišta Vanderbilt, Nashville, Tennessee (NF, WF)

SAŽETAK

Aktivan prijevoz pobubrežniproksimalnih tubula igra značajnu ulogu u dispoziciji lijeka. Tijekom razvoja lijeka, procjene odbubrežniizlučivanje su bitni za određivanje doze. Bubrežni bioreaktori koji reproduciraju fiziološke rođake bubrega, kao što je smični stres izazvan protokom, mogu bolje predvidjeti in vivo ponašanje lijeka nego sadašnji in vitro modeli. U ovoj smo studiji istražili ulogu smičnog naprezanja na aktivni transport 4-(4-(dimetilamino)-stiril)-N-metil piridinijevog jodida (ASP plus ) Madin-Darby pasabubregStaniceegzogeno eksprimirajući ljudske transportere organskih kationa organski transporter kationa 2 (OCT2) i protein ekstruzije više lijekova i toksina 1 (MATE1). Stanice uzgojene u paralelnoj ploči pod kontinuiranom perfuzijom medija formirale su tijesan monosloj s visokom barijerom za inulin. Kao odgovor na rastuće razine smičnog naprezanja (0.2-2 dyna/cm), stanice su pokazale odgovarajući porast u transportu ASP plus, dostižući maksimalno povećanje od 4.2-puta na 2 dina/cm² u usporedbi sa stanicama uzgojenim u statičkim uvjetima. Ovaj transport je inhibiran imipraminom, što ukazuje da je aktivni transport bio prisutan u uvjetima smičnih naprezanja. Stanice izložene stresu smicanja od 2 dyna/cm² također su pokazale povećanje ekspresije RNA i kod transficiranih ljudi i kod endogenog OCT2 (3.7- odnosno 2.0- puta). Uklanjanje cilija amonijevim sulfatom eliminiralo je učinke smicanja na ASP plus transport na 0.5 dynes/cm² bez učinka na ASP plus transport u statičkim uvjetima. Ovi rezultati pokazuju da smično naprezanje utječe na aktivni transport organskih kationa ububrežnicjevastiepitelne stanice na način ovisan o cilijama.

Cistanche je dobar za rad bubrega

Uvod

Unatoč velikom napretku pretkliničkih metoda za odabir optimalnih kandidata za lijekove, razvoj lijeka ostaje dug i skup proces koji ima vrlo nizak prinos novih molekularnih entiteta na tržištu (Watkins, 2011.). Glavni nedostatak pretkliničkih modela je nemogućnost predviđanja klirensa i toksičnosti kod ljudi. Otprilike 30 posto lijekova koji su bili uspješni u pretkliničkim studijama ne uspije kod ljudi kao rezultat neočekivanih vrijednosti klirensa ili toksičnosti (Kola i Landis, 2004.).

Bubrezi su posebno važna meta za in vitro modeliranje staničnih kultura jer su odgovorni za eliminaciju više od trećine svih lijekova i većine metabolita (Morrissey et al., 2013). Thebubrežniproksimalni tubul važan je za testiranje lijekova tijekom razvoja jer obavlja većinu aktivnog transporta kandidata za lijek i posebno je osjetljiv na toksične ozljede (Giacominiet al., 2010.). Thebubrežnicjevčicaje monosloj epitelnih stanica s filtratom koji teče preko apikalne površine. Bazalna membrana nalazi se ispod tubularnog epitela, a susjedne peritubularne kapilare omogućuju reapsorpciju vode i saluta. Mikrookruženje proksimalnog tubula, posebno smični stres tekućine i apikobazalni onkotski gradijenti, nepotpuno se reproduciraju konvencionalnim tehnikama stanične kulture. Bioreaktori epitelnih stanica koji hvataju istaknutu in vivo fiziologiju mogu poboljšati točnost klirensa i predviđanja toksičnosti izvedenih iz in vitro testova (Pfaller i Gstraunthaler, 1998; Astashkina et al., 2012).

Sve više dokaza pokazuje da morfologija i funkcionalnost stanica proksimalnih tubula može varirati ovisno o okruženju rasta, kao što je poroznost površine rasta, izloženost tekućini s obje strane i/ili smični stres tekućine. Prethodni rad Essiga i Friedlandera (2003.), kao i našeg laboratorija (Ferrell et al. 2010.), pokazao je da je preuređenje izazvano protokom tubularne tekućine u apikalnom aktinskom citoskeletu stanica proksimalnih tubula (Ferrell et al., 2010.) . Naknadno je nekoliko studija pokazalo da smični stres utječe na razine ekspresije i lokalizaciju višestrukih unosa i efluksnih prijenosnika, uključujući natrij-vodikov antiporter 3. Na/K-ATPazu, prijenosnike glukoze, epitelne natrijeve kanale i receptore endocitoze, megalin i tubulin (Duan i sur., 2010.; Raghavan i sur., 2014.; Jansen i sur.., 2016.; Ernandez i sur., 2018.). Drugi rad je pokazao da se smično strujanje u cjevastom sustavu bioreaktora usmjerava i izdužujebubrežnicjevastistanice duž putanje protoka (Venzac et al. 2018). In vitro dokazi pokazuju da su neke promjene u strukturi citoskeleta i transportnoj funkciji vjerojatno povezane s mehanosenzornom funkcijom cilija (Overgaard et al., 2009; Raghavan et al., 2014); međutim, malo je studija razmatralo učinak smičnog stresa na prijenosnike lijekova u bubrežnim stanicama. Nadalje, malo se zna o učinku različitih brzina smicanja na funkcionalnost stanice, osobito kod dugotrajne izloženosti smicanju. Većina studija razmatrala je jednu stopu smicanja i provodila samo kratkoročne pokuse (1-6 sati), što otežava razlikovanje pravih učinaka smicanja i stanične reakcije na stres na nagle promjene u mikrookruženju (Duan et al.2010; Jang et al.2013: Maggiorani et al.2015).

Ovdje je korišten mikrofluidni bioreaktor za ispitivanje učinka stupnjevanih razina smičnih naprezanja nabubrežniprijenosnici lijeka stanica proksimalnih tubula organski kationski prijenosnik 2 (OCT2) i protein ekstruzije više lijekova i toksina 1 (MATE1). Pokazali smo da povećanje apikalnog smičnog stresa dovodi do povećanja transporta organskih kationa i ekspresije transportera te da su trepavice uključene u ovaj stanični odgovor na smični stres.

Materijali i metode

Izrada i montaža uređaja. Prethodno smo objavili naš dizajn bioreaktora s paralelnom pločom koji osigurava putanju protoka tekućine podesive visine preko apikalne strane stanica i statički spremnik na bazalnoj strani (Brakeman et al., 2016.). Za rad koji je ovdje predstavljen, prilagodili smo naš prethodni dizajn kako bismo stvorili multipleksirani uređaj s četiri odvojena puta protoka kako bismo omogućili testiranje četiri biološka uvjeta odjednom (Slika 1). Svaki uređaj sastoji se od tri sloja: baze s 5-ml apikalnim spremnikom, srednje ploče za držanje Snapwell umetka（Costar, Corning, Corning, NY） s površinom ćelija od 1,12 cm² i gornje ploče koja sadrži bazolateralni rezervoar od 1- do 2- ml. Tanjuri

izrađeni su od polisulfona kako bi se omogućila sterilizacija u autoklavu. Laserski izrezane silikonske brtve visine od 500- do 1000-um postavljene su između svakog seta ploča za brtvljenje odjeljaka s tekućinom i na apikalnoj strani za definiranje visine kanala. Bioreaktor je sastavljen pomoću vijaka. Spremnik medija i zamka za mjehuriće bili su ugrađeni u stupac. Ulazi i izlazi su spojeni pomoću bodljikavih konektora na silikonsku cijev Masterflex LS14 s unutarnjim promjerom od 16-mm (Cole Parmer Lab Supplies, Vernon Hills, IL). Protok tekućine, a time i apikalni smični stres, postavljeni su i kontrolirani peristaltičkom pumpom (Cole Parmer).

Stanična kultura i tok. MDCK stanice transficirane ili praznim vektorom ili parom prijenosnika unosa i efluksa (hOCT2/hMATE1) (Konig et al..2011) osigurao je dr. Martin Fromm (Erlangen, Njemačka) i uzgojene u minimalni osnovni medij s Earleovom uravnoteženom otopinom soli (UCSF Cell Culture Facility) s 10 posto fetalnog goveđeg seruma (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) i 1 posto penicilin-streptomicin (UCSF Cell Culture Facility). Pet stotina mikrograma po mililitru higromicina (UCSF Cell Culture Facility) i 100 mg/h ml geneticina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dodano je u medij za dvostruko transficirane stanice. Za protočne eksperimente, hOCT2/hMATE1 MDCK stanica nasađene su na donju stranu Snapwell umetaka (Corning) u gustoći od 300,000 stanica/jažici (250,000 stanica/cm"), uzgajane u statičkim uvjetima do konfluencije. i zatim stavljene u bioreaktoru. Protok apikalnog medija povećavao se tijekom 7 dana od 0,1 do 1-6 mlmin dok se nije postigao željeni smični napon, a zatim je ostavljen stabilan 72 sata prije eksperimenta. Stanice su uzgajane u statičkim uvjetima jednako dugo kao i kontrole .

Imunofluorescencija. Stanice su fiksirane s 4 posto paraformaldehida (Thermo Fisher Scientific), permeabilizirane s 0.1 posto Triton-Xin PBS (Sigma-Aldrich) i blokirane goveđim serumskim albuminom (Sigma-Aldrich). Nakon toga su inkubirani s 1:50 razrjeđenjem Alexa 488 obilježenog zonula occludens-1 mišjeg monoklonskog protutijela (Life Technologies, Carlsbad, CA) ili primarno acetiliranog -tubulin mišjeg monoklonskog protutijela (Life Technologies) tijekom 60 minuta. Stanice tretirane s a-tubulin antitijelom zatim su inkubirane sa sekundarnim 561 anti-mišjim kozjim antitijelom (Life Technologies) i faloidinom (Thermo Fisher Scientific) za bojenje F-aktinom. Snimanje je provedeno uporabom Nikon (Tokio, Japan) spektralnog konfokalnog mikroskopa s 40x uljnim objektivom.

Izvedba barijere. Inulin, polimer od 5000 Da, dobro je poznati marker brzine glomerularne filtracije i marker je propuštanja proksimalnog tubula in vivo (Sohtell et al, 1983.):

FITC-om obilježen inulin (Sigma-Aldrich) dodan je u apikalni medij i ostavljen da teče kroz uređaje. Uzorci su skupljani iz bazalnog rezervoara svaka 24 sata i analizirani na sadržaj inulina pomoću Genios Pro čitača fluorescentnih ploča (Tecan, Mannedorf, Švicarska). Funkcija barijere staničnog monosloja izračunata je iz razina inulina izmjerenih u apikalnom i bazalnom odjeljku kako je opisano jednadžbom 1. Ovdje je Capital koncentracija inulina u apikalnom odjeljku, a C Mal je koncentracija u bazalnom odjeljku. Propuštanje inulina izračunato je kao koncentracija u bazalnom (donorskom) odjeljku podijeljena s površinom stanica nakon 24 sata.

ASP plus Transport. Transducirani prijenosni geni inducirani su s 10 mM Na-butirata (Sigma-Aldrich) 24 sata prije transportnog eksperimenta, kao što je prethodno opisano (Konig et al, 2011). Kada je bilo prikladno, stanice su inkubirane s inhibitorom （500 μM imipramina ili 1 mM cimetidina (Sigma-Aldrich)) na bazalnoj strani 30 minuta, nakon čega je uslijedio dodatak 25 μM 4-（4-dimetilamino）- stiril-N-metil piridinij (ASP plus) (Life Technologies) i inkubirati 1 sat. Uzorci su prikupljeni iz apikalne i bazalne podloge. Stanice su zatim isprane s ledeno hladnom fosfatnom puferiranom fiziološkom otopinom tri puta i lizirane za mjerenje ASP plus akumulacije i transporta. Eksperimenti transporta su istovremeno izvedeni na stanicama pod smičnim stresom i uzgojenim u statičkim uvjetima. Koncentracija ASP plus je kvantificirana na Genios Pro čitaču fluorescentnih ploča (Tecan) pri valnoj duljini ekscitacije od 485 nm i valnoj duljini emisije od 590 nm.

Kvantifikacija proteina. Stanice su lizirane s 1 postotnim SDS-10 M puferom za lizu uz mućkanje preko noći. Sadržaj proteina mjeren je korištenjem standardnog Pierce BCA kompleta za analizu proteina (Thermo Fisher). Gdje je bilo prikladno, sadržaj proteina je normaliziran na područje rasta stanica.

Ekspresija RNA. RNA je ekstrahirana iz stanica korištenjem RNeasy RNA Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Njemačka), a cDNA je generirana korištenjem kompleta skripti (Bio-Rad, Hercules, CA). cDNA je korištena za detekciju ljudskih i pasjih OCT2 i MATE1 i pasji P-glikoprotein (P-GP) kvantitativnom lančanom reakcijom reverzne transkriptaze-polimeraze korištenjem Tagman testa i sondi (Applied Biosystems) na Fast Realtime PCR instrumentu (Applied Biosystems). Ribosomski protein S18 (RS-18) korišten je kao kućna kontrola. Učinak smičnog naprezanja na ekspresiju transportera analiziran je pomoću metode 4ACt koristeći razine transportera izražene u odnosu na RS-18(Peters et al. 2007; Schmittgen i Livak, 2008). P-GP je korišten kao mjera globalnih učinaka smicanja na ekspresiju transportera.

Decilicija. Stanice su uzgajane do konfluencije i zatim inkubirane u odsutnosti ili prisutnosti 30 mM amonijevog sulfata (Fluka AG) 24 sata prije mjerenja ASP plus transport (Oxergard et al 2009). Prisutnost cilija određena je snimanjem a-tubulina kao što je već ovdje opisano.

Statistika. Svi eksperimenti izvedeni su u tri primjerka s najmanje dva tehnička ponavljanja unutar svakog eksperimenta. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD i grafički prikazani kao kutijasti dijagrami. Statističke analize provedene su neuparenom jednosmjernom ili dvosmjernom analizom varijance, a P-vrijednost<0.05 was="" considered="" significant.="" data="" were="" analyzed="" using="" prism="" version="" 6.0="" (graphpad,="" san="" diego,="">

Rezultati

Stanična morfologija i funkcija barijere. Immunofluova nedavna analiza stanica postavljenih ispod protoka otkrila je jednoliku formaciju monosloja s proteinom uskog spoja, zonula occludens-1, lokaliziranim na uskim spojevima između stanica i pod statičkim uvjetima i uvjetima protoka (Slika 2, A–C). Kvantifikacija ukupnog sadržaja proteina pokazala je povećanje sadržaja proteina do 1.6-puta po kvadratnom centimetru monosloja kao odgovor na smično naprezanje (Sl. 2D). Zatim smo izmjerili propusnost inulina, markera propuštanja proksimalnih tubula, preko monosloja. Uređaji su zadržali stopu učinka barijere od 97,9 posto 6 1.42 posto tijekom 7 dana kulture pod do 2 dyna/cm2 smicanja (Slika 2E), što je rezultiralo konačnom stopom curenja inulina 6. dana { {15}}.13–0.69 mg/cm2 dnevno.

Učinak smičnog naprezanja na transport organskih kationa. Prijenos ASP plus, auto-fluorescentnog supstrata OCT2 i MATE1, mjeren je 1 sat pri različitim razinama smičnih naprezanja（0.2-2 dina/cm²）. MDCK stanice koje egzogeno eksprimiraju hOCT2 i hMATE1 pokazale su 42-struko povećanje ASP plus transporta kao odgovor na smični stres od 2 dynes/cm², što se odražava u mjerama stanične akumulacije (Slika 3A) i transcelularnog transporta (Slika. 3B). Učinak smicanja na ASP plus akumulaciju ili transcelularni transport bio je sličan pod smicanjem od 0.5 i 2 dyna/cm². Kako bi se utvrdilo je li transport aktivnog ASP plusa povećan, izmjeren je prijenos ASP plus stanicama izloženim 0.2 dyna/cm smicanja sa ili bez prethodnog tretmana s 500 uM imipramina, OCT{{20} } i MATE1-specifični inhibitor. ASP plus transport bio je inhibiran imipraminom 60,3 posto ± 15,8 posto u uvjetima smičnih naprezanja u usporedbi s 47,6 posto ± 19,7 posto u statičkim uvjetima (Slika 3C).

Za daljnje razumijevanje ovog zapažanja, učinak smicanja na ekspresiju ljudskog OCT2 (transfektiranog), psećeg OCT2 (endogenog) i psećeg P-GP (endogenog) mjeren je u stanicama izloženim različitim razinama smicanja 72 sata nakon sporo povećanje smicanja tijekom 7 dana (slika 4). U usporedbi sa stanicama uzgojenim u statičnim uvjetima, MDCK stanice izložene smicanju pokazale su povećanu ekspresiju transfektiranog ljudskog i endogenog OCT2 (do 3.7- odnosno 2.0-puta), bez značajnog učinka na ekspresiju transfektiranog MATE1 ili endogenog P-GP.

Uloga cilija u odgovoru na smicanje. Snimanje je pokazalo da dvostruko transficirane MDCK stanice eksprimiraju cilije pod statičkim uvjetima i uvjetima protoka (Slika 5, A i E). Izlaganje stanica 30 mM amonijevom sulfatu tijekom 24 sata uzrokovalo je potpuni gubitak cilija (Slika 5, C i G). Važno je da decilijacija nije imala velikih učinaka na spojeve stanične membrane, što je izmjereno prikazom F-aktina, koji usidri proteine ​​uskog spoja na spojevima stanične membrane u epitelnim stanicama (Slika 5.D i HD (Stevenson i Begg. 1994.). Iako postoji određeno zadebljanje bojenja F-aktina na ovim slikama, to nije bio dosljedan nalaz, pa stoga nismo kvantificirali ovaj učinak. Decilijacija nije imala učinak na transport stanicama uzgojenim u statičkim uvjetima. ali je potpuno eliminirao je učinke smicanja na ASP plus transport u stanicama izloženim smicanju od 0,5 dyna/cm² (Sl. 6).

Rasprava

Bubrezi igraju središnju ulogu u eliminaciji lijekova u ljudskom tijelu. Važno je točno oponašati složenost bubrežne fiziologije za in vitro testiranje lijekova, osobito s obzirom na protok tekućine. Pokazalo se da smični stres uzrokovan protokom tekućine utječe na morfologiju stanice i ionske prijenosnike in vitro, ali malo se zna o učincima na prijenosnike lijekova (Duan i sur., 2010.; Ferrell i sur., 2012.; Jansen i sur., 2016.) . Osim toga, većina prethodnih studija mjerila je samo učinak kratkotrajnog smicanja (1-6 sati), što vjerojatno neće u potpunosti izolirati učinke smicanja od drugih odgovora na stanični stres (Duan et al..2010; Jang et al. 2013; Maggiorani et al..2015). U ovim smo se studijama usredotočili na učinke trajnog (7 dana) smičnih naprezanja iz protoka tekućine na transport lijeka kako bismo bolje oponašali trajni smični stres koji doživljavajububrežnicjevastistanica in vivo.

Razumijevanje načina na koji prijenosnici lijeka reagiraju na trajni smični stres može poboljšati in vitro predviđanja in vivo rukovanja lijekom putem bubrega. Precizno dizajnirani in vitro modeli bubrega mogu standardizirati pretklinička ispitivanja i smanjiti stope neuspjeha lijekova.

U ovom radu, mikrofluidni bioreaktor s paralelnom pločom korišten je za određivanje učinaka trajnog smičnog naprezanja na transport organskih kationa pomoću OCT2 i MATE1 ububrežnicjevčicastanična linija. Nekoliko staničnih linija uzeto je u obzir za ove studije, uključujući ljudske stanične linije kao što su stanice ljudskih proksimalnih tubula iz Hopferove grupe (Orosz et al, 2004) i RPTECs (CRL-4031: American Type Culture Collection, Manassas, VA)( Wieser et al., 2008), ali dvostruko transficirane hOCT2/hMATE1 MDCK stanice smatrane su najprikladnijim izborom za ovu studiju iz nekoliko razloga. Prvo, MDCK stanice dosljedno pokazuju robusnu pričvršćenost na umetke transwella, što im omogućuje da izdrže početni stres protoka tekućine. Drugo, ove stanice tvore čvrste monoslojeve, što sprječava propuštanje i bitno je za proučavanje transcelularnog transporta supstrata markera. Konačno, egzogena ekspresija transportera omogućuje poboljšanu detekciju aktivnog transporta i učinka poremećaja.

Stanice postavljene ispod toka formirale su konfluentni monosloj i lokalizirale protein uskog spoja na periferiji stanice. Također su zadržali visoku funkciju barijere mjerenu propusnošću inulina. Sposobnost epitelnih stanica da tvore monosloj koji sprječava istjecanje tekućine i proteina izuzetno je važna za pravilnu funkciju tubula. Ovdje je curenje kroz MDCK stanice bilo minimalno s manje od 1 ug/cm² po danu i znatno niže od onoga kroz ljudske stanice. Prethodno smo pokazali da monoslojevi ljudskih bubrežnih stanica imaju 10-20 ug/cm² po danu curenja inulina（Brakeman et al., 2016), podupirući zaključak da su hOCT2/hMATE1 MDCK stanice formirale robustan monosloj.

Transport ASP plus bio je značajno povećan u hOCT2/hMATE1 MDCK stanicama koje su bile izložene različitim razinama smicanja tijekom 72 sata u usporedbi sa statičkim kontrolama. ASP plus preuzima OCT2 (SLC22A2) i ispušta ga MATE1 (SLC47A1), dva prijenosnika organskih kationa koji rade usklađeno kako bi olakšalibubrežniizlučivanje često korištenih lijekova, kao što su metformin i cisplatin (Biermann i sur. 2006; Wittwer i sur. 2013). Slični učinci smicanja zabilježeni su za ionske transportere proksimalnih tubula. Prijavljeno je povećanje unosa albumina, reapsorpcije iona te ekspresije i funkcije megalina i tubulina kao odgovor na povećani smični stres (Overgaard i sur., 2009; Duan i sur., 2010: Ferrell i sur., 2012: Raghavan i sur., 2014). Izlaganjebubrežnistanice proksimalnih tubula na smični stres također je povezan sa smanjenom apoptozom i bržim oporavkom od akutne toksičnosti cisplatinom i pojačanom inhibicijom transporta organskih aniona (Jang et al.2013). Budući da je smični stres iz protoka tekućine stalno prisutan u proksimalnom tubulu, ovi nalazi zajedno podupiru upotrebu više fizioloških in vitro modela sustava za predviđanje dispozicije i toksičnosti lijeka u bubrezima. Važno je napomenuti da nema značajne razlike u transportnoj funkciji između 0.5 i 2.0 dina/cm² smičnih naprezanja. Prethodne studije koje su proveli Essig i Friedlander (2003) otkrile su da je potrebna minimalna razina smicanja od 0,17 dynes/cm2 da bi se izazvala promjena u staničnoj morfologiji, a druge studije su mjerile učinke na fiziologiju do 1 dyne/cm²（Duan et al., 2010）. Ovo je prva studija koja istražuje učinke niza viših i trajnih razina smičnog naprezanja na funkcionalnost bubrežnih prijenosnika lijekova, a moguće je da veličina biološke razlike između 0,5 i 2,0 dyna/cm² smičnog naprezanja koje mi procijenjena nije bila dovoljno velika da omogući identifikaciju razlika između ovih razina smičnih naprezanja u našim testovima. Iako su potrebna daljnja istraživanja, naši rezultati bacaju svjetlo na potrebne uvjete za fiziološki relevantne modele i učinke povećanih razina stresa na smicanje zbog bolesti na bubrežno rukovanje lijekovima.

Jedno od ograničenja naših eksperimentalnih metoda jest to da smo se bavili samo transportom pri pH 7,4 koristeći medij s pH 7,4 i na apikalnoj i na bazalnoj strani oponašajući eksperimentalne metode prethodno opisane za hOCT2/hMATE1 MDCK stanice (Konig et al..2011). Apikalni do bazalnog pH gradijenta može utjecati na funkciju OCT2 i MATE1, a obično postoji pH gradijent u fiziološkim uvjetima (Muller et al., 2013). Naše su metode stoga ograničile našu sposobnost procjene interakcije između apikalnog i bazalnog pH gradijenta i smičnog naprezanja na funkciju OCT2 i MATE1. Budući da smo koristili dosljedan pH od 7,4 u svim eksperimentalnim uvjetima, ovaj nedostatak pH gradijenta vjerojatno nije utjecao na naše nalaze, ali potencijalno ograničava primjenjivost naših nalaza na transport OCT2 i MATE1 u prisutnosti apikalnog do bazalnog pH gradijenta.

Iznenađujuće, ekspresija mRNA transfektiranog ljudskog i endogenog OCT2 bila je povećana u stanicama izloženim svim razinama smicanja u usporedbi sa statičkim kontrolama. Ova regulacija ekspresije transportera bila je specifična, bez mjerljivog učinka na endogenu ekspresiju P-GP ili transfektirani MATE1. Pojačana ekspresija transportera daje uvid u mehanizam koji stoji iza povećanog transporta i može biti rezultat poboljšane stabilnosti mRNA ili povećane transkripcije mRNA. Zanimljivo je primijetiti da su i transfektirani i endogeni transporteri bili regulirani naviše, što je neočekivano budući da je transfektirani OCT2 eksprimiran pod promotorom citomegalovirusa i ne bi trebao biti podložan regulacijskim mehanizmima endogene ekspresije gena. Iako iznenađujuće, ovo opažanje nije bez presedana. Prijavljen je sličan učinak na stanice proksimalnih tubula transficiranih OAT1 izložene perfuziji, ali mehanizam za povećanu ekspresiju ostaje nejasan (Jansen et al., 2016.). U drugoj studiji utvrđeno je da Nrf2 signalizacija igra ulogu u povećanju ekspresije endogenog MATE2-K kao odgovor na smični stres (Fukuda et al., 2017.). Daljnja studija o tome je opravdana i bit će predmet budućih istraga.

Također smo utvrdili da je uvođenje apikalnog smicanja povećalo sadržaj proteina po kvadratnom centimetru stanica. Taj je učinak bio iste veličine i za 0.5 i za 2 dyna/cm² smicanja, slično učinku koji je viđen za ekspresiju mRNA i ASP plus transport. Postoje neki dokazi da smični stres uzrokuje višibubrežniepitelne stanice, što bi rezultiralo većim volumenom stanica po kvadratnom centimetru, a time i vjerojatnim povećanjem proteina po kvadratnom centimetru; međutim, ovaj prethodno objavljeni fenomen bio je samo manje opažanje u većem broju podataka i nije kvantificiran (Long et al., 2017.). Povećanje ukupnog proteina u stanicama uzgojenim u prisutnosti apikalnog smicanja može predstavljati normalan sadržaj proteina za zdrave stanicebubrežnicjevastiepitelnih stanica koje se mogu postići samo izlaganjem stanica apeksnom smicanju. Stoga niže razine sadržaja proteina u stanicama uzgojenim u statičkoj kulturi mogu predstavljati abnormalno stanično stanje koje se klinički može pojaviti u situacijama niskog apikalnog protoka filtrata, kao što je akutna ozljeda bubrega. Ovaj fenomen zaslužuje daljnje proučavanje.

Poznato je da cilije imaju mehanosenzorne uloge u proksimalnom tubulu (Raghavan i Weisz,2016). Stoga, kako bi se utvrdilo imaju li kritičnu ulogu u povećanom OCT2 i MATE1-posredovanom transportu koji je ovdje prijavljen, izmjeren je učinak uklanjanja cilija na funkciju transportera. Potpuna blokada povećanja ovisnog o smicanju u ASP plus transportu uklanjanjem cilija u našim studijama slična je učinku koji je pronađen u studijama Raghavan et al. (2014), koji su pokazali regulaciju endocitoze ovisnu o cilijama kao odgovor na protok tekućine. Amonijev sulfat vjerojatno ima druge neobilježene učinke na ponašanje i funkcionalnost stanica koji mogu neizravno utjecati na transport otopljene tvari. Unatoč mogućim učincima izvan cilja, ova metoda decilijacije testira ulogu cilijarnog senzora na kretanje organskih otopljenih tvari posredovano prijenosnikom. Mehanizam signalizacije između mehano-senzornih proteina u cilijama i transportera trenutno je nepoznat. Jedna je hipoteza da se funkcija prijenosnika organskih kationa mijenja promijenjenim prijenosom iona. Poznato je da uklanjanje cilija mijenja pokretljivost otopljene tvari u stanicama proksimalnih tubula, posebno smanjenjem Nat/K plus. Lokalizacija membrane ATPaze i modificiranje paracelularnog transporta (Overgaard et al.., 2009). Moguće je da to rezultira promjenama u funkciji MATE1, antiporteru ovisnom o H gradijentu. Druga je hipoteza da osjetila smičnih naprezanja utječu na ekspresiju prijenosnika organskih kationa. Smično naprezanje modulira funkciju MATE2-K putem Nrf2 signalizacije (Fukuda et al., 2017.). Drugi prijenosnici organskih kationa mogu slično reagirati na smični stres, koji bi se eliminirao kada se uklone mehanosenzorne cilije. Mnogo toga je nepoznato i zahtijeva daljnje proučavanje. Zanimljivo je da uklanjanje cilija nije imalo značajan učinak na transport ASP plus stanicama izloženim smičnom naprezanju od 0,2 dyna/cm², ali je opažen snažan učinak kada je smično naprezanje povećano na 0,5 dyna/cm2. Ovo sugerira da cilije osjećaju prag razine smičnog naprezanja; zauzvrat, promjene signala cilija u ekspresiji i funkciji transportera prije nego što se očekuju mjerljivi učinci na transport. Sveukupno, ovisnost transporta organskih kationa o cilijarnom senzoru smicanja daje uvid u mehanosenzorni signalni put koji je uključen i minimalnu razinu stresa koja bi mogla biti potrebna za pokretanje snažnog odgovora na smicanje.

Ukratko, ovi podaci pokazuju da smično naprezanje od protoka tekućine ima značajan učinak na funkciju transportera organskih kationa i ekspresiju u MDCK stanicama. Nadalje, regulacija transporta organskih kationa ovisila je o prisutnosti cilija. Predlažemo da je apikalni smični stres važna komponenta svakog in vitro modeliranjabubrežnicjevastistanica i vjerojatno će biti važna komponenta modeliranja bubrežnog sekretornog klirensa i nefrotoksičnosti lijekova. Specifični mehanizam kojim signali mehaničkog stresa povećavaju aktivnost i ekspresiju prijenosnika još uvijek je nejasan i zahtijeva daljnje proučavanje.

Reference

Astashkina A, Mann B i Grainger DW (2012.) Kritička procjena in vitro modela stanične kulture za visokoučinkoviti probir lijekova i toksičnost. Pharmacol Ther 134:82-106.

Biermann J, Lang D, Gorboulev V, Koepsell H, Sindic A, Schröter R, Zvirbliene A, Pavenstädt H, Schlatter E i Ciarimboli G (2006) Karakterizacija regulacijskih mehanizama i stanja ljudskog transportera organskih kationa 2. Am J Physiol Cell Physiol 290: C1521-C1531.

Brakeman P, Miao S, Cheng J, Lee CZ, Roy S, Fissell WH i Ferrell N (2016.) Modularni mikrofluidni bioreaktor s poboljšanom propusnošću za procjenu polariziranih bubrežnih epitelnih stanica. Biomicrofluidics 10:064106.

Duan Y, Weinstein AM, Weinbaum S i Wang T (2010.) Promjene lokalizacije i ekspresije membranskog prijenosnika izazvane smicanjem u stanicama proksimalnih tubula miša. Proc Natl Acad Sci USA 107:21860–21865.

Ernandez T, Udwan K, Chassot A, Martin PY i Feraille E (2018.) Sindikalna nefrektomija i smični stres apikalne tekućine smanjuju obilje ENaC u glavnim stanicama sabirnog kanala. Am J Physiol Renal Physiol 314:F763-F772.

Essig M i Friedlander G (2003.) Tubularni smični stres i fenotip bubrežnih proksimalnih tubularnih stanica. J Am Soc Nephrol 14 (Suppl 1): S33–S35.

Ferrell N, Desai RR, Fleischman AJ, Roy S, Humes HD i Fissell WH (2010.) Mikrofluidni bioreaktor s integriranim elektrodama za mjerenje transepitelnog električnog otpora (TEER) za procjenu bubrežnih epitelnih stanica. Biotechnol Bioeng 107:707-716.

Ferrell N, Ricci KB, Groszek J, Marmerstein JT i Fissell WH (2012.) Rukovanje albuminom od strane epitelnih stanica bubrežnih tubula u mikrofluidnom bioreaktoru. Biotechnol Bioeng 109:797-803.

Ferrell N, Ricci KB, Desai RR, Groszek J, Marmerstein JT i Fissell WH (2012.) Mikrofluidni bioreaktor za studije epitelnih stanica pod stresom smicanja tekućine. FASEB J 26:911.3.

Fukuda Y, Kaishima M, Ohnishi T, Tohyama K, Chisaki I, Nakayama Y, Ogasawara-Shimizu M i Kawamata Y (2017.) Smični stres tekućine stimulira ekspresiju MATE2-K putem aktivacije puta Nrf2. Biochem Biophys Res Commun 484:358-364.

Giacomini KM, Huang SM, Tweedie DJ, Benet LZ, Brouwer KLR, Chu X, Dahlin A, Evers R, Fischer V, Hillgren KM, et al.; International Transporter Consortium (2010.) Membranski transporteri u razvoju lijekova. Nat Rev Drug Discov 9: 215–236.

Jang KJ, Mehr AP, Hamilton GA, McPartlin LA, Chung S, Suh KY i Ingber DE (2013) Proksimalni tubul ljudskog bubrega na čipu za procjenu transporta lijekova i nefrotoksičnosti. Integr Biol 5:1119-1129.

Jansen J, Fedecostante M, Wilmer MJ, Peters JG, Kreuser UM, van den Broek PH, Mensink RA, Boltje TJ, Stamatialis D, Wetzels JF, et al. (2016.) Bubrežni tubuli proizvedeni bioinženjeringom učinkovito izlučuju uremičke toksine. Sci Rep 6:26715.

Kola I i Landis J (2004.) Može li farmaceutska industrija smanjiti stope odlaska? Nat Rev Drug Discov 3:711–715.

König J, Zolk O, Singer K, Hoffmann C i Fromm MF (2011.) Dvostruko transficirane MDCK stanice koje izražavaju ljudske OCT1/MATE1 ili OCT2/MATE1: determinante unosa i transcelularne translokacije organskih kationa. Br J Pharmacol 163:546-555.

Long KR, Shipman KE, Rbaibi Y, Menshikova EV, Ritov VB, Eshbach ML, Jiang Y, Jackson EK, Baty CJ i Weisz OA (2017.) Apikalna endocitoza proksimalnog tubula modulirana je naprezanjem smicanja tekućine putem puta ovisnog o mTOR-u. Mol Biol Cell 28:2508-2517.

Maggiorani D, Dissard R, Belloy M, Saulnier-Blache JS, Casemayou A, Ducasse L, Grès S, Bellière J, Caubet C, Bascands JL, et al. (2015) Promjena epitelne organizacije uzrokovana smicanjem u stanicama bubrežnih tubula ljudi. PLoS One 10:e0131416.

Morrissey KM, Stocker SL, Wittwer MB, Xu L i Giacomini KM (2013.) Bubrežni transporteri u razvoju lijekova. Annu Rev Pharmacol Toxicol 53:503-529.

Müller F, König J, Hoier E, Mandery K i Fromm MF (2013.) Uloga transportera organskih kationa OCT2 i proteina za ekstruziju više lijekova i toksina MATE1 i MATE2-K za transport i interakcije lijekova antivirusnog lamivudina. Biochem Pharmacol 86:808–815.

Orosz DE, Woost PG, Kolb RJ, Finesilver MB, Jin W, Frisa PS, Choo CK, Yau CF, Chan KW, Resnick MI, et al. (2004) Rast, imortalizacija i potencijal diferencijacije normalnih stanica proksimalnih tubula odraslih ljudi. In Vitro Cell Dev Biol Anim 40:22–34.

Overgaard CE, Sanzone KM, Spiczka KS, Sheff DR, Sandra A i Yeaman C (2009.) Decilijacija je povezana s dramatičnim preoblikovanjem spojeva epitelnih stanica i površinskih domena. Mol Biol Cell 20:102-113.

Peters IR, Peeters D, Helps CR i Day MJ (2007.) Razvoj i primjena višestrukih internih referentnih (domaćica) testova gena za točnu normalizaciju studija ekspresije psećih gena. Vet Immunol Immunopathol 117:55-66.

Pfaller W i Gstraunthaler G (1998.) Ispitivanje nefrotoksičnosti in vitro--što znamo i što trebamo znati. Environ Health Perspect 106 (Suppl 2): ​​559–569.

Raghavan V, Rbaibi Y, Pastor-Soler NM, Carattino MD i Weisz OA (2014.) Regulacija apikalne endocitoze ovisna o smicanju u stanicama proksimalnih tubula bubrega posredovana primarnim cilijama. Proc Natl Acad Sci USA 111:8506-8511.

Raghavan V i Weisz OA (2016.) Uočavanje uloge mehanosenzora u regulaciji funkcije proksimalnih tubula. Am J Physiol Renal Physiol 310:F1–F5.

Schmittgen TD i Livak KJ (2008) Analiza PCR podataka u stvarnom vremenu komparativnom C(T) metodom. Nat Protoc 3:1101-1108.

Sohtell M, Karlmark B i Ulfendahl H (1983) FITC-inulin kao marker bubrežnih tubula u štakora. Acta Physiol Scand 119:313-316.

Stevenson BR i Begg DA (1994) Učinci citohalazina D ovisni o koncentraciji na uske spojeve i aktinske filamente u epitelnim stanicama MDCK. J Cell Sci 107: 367-375.

Venzac B, Madoun R, Benarab T, Monnier S, Cayrac F, Myram S, Leconte L, Amblard F, Viovy JL, Descroix S, et al. (2018) Inženjering malih cijevi s promjenama promjera za proučavanje organizacije bubrežnih stanica. Biomikrofluidika 12: 024114.

Watkins PB (2011.) Znanost o sigurnosti lijekova i usko grlo u razvoju lijekova. Clin Pharmacol Ther 89:788-790.

Wieser M, Stadler G, Jennings P, Streubel B, Pfaller W, Ambros P, Riedl C, Katinger H, Grillari J i Grillari-Voglauer R (2008) Sam hTERT imortalizira epitelne stanice proksimalnih tubula bubrega bez promjene njihovih funkcionalnih karakteristika. Am J Physiol Renal Physiol 295:F1365–F1375.

Wittwer MB, Zur AA, Khuri N, Kido Y, Kosaka A, Zhang X, Morrissey KM, Sali A, Huang Y i Giacomini KM (2013.) Otkriće snažnih, selektivnih inhibitora transportera ekstruzije više lijekova i toksina 1 (MATE1, SLC47A1) kroz profiliranje lijekova na recept i računalno modeliranje. J Med Chem 56:781-795.