Antioksidativni i anti-age potencijal formulacije peptida (Gal2–Pep) konjugirane s galnom kiselinom Ⅱ

3. Rezultati i rasprava

3.1. Sinteza i konjugacija galne kiseline s peptidom

Sintetizirani peptidi TPPTTP, galoil–TPPTTP (Gal–Pep) i Gal2–Pep dobiveni su i pročišćeni korištenjem polupreparativnog RP-HPLC. Slika 1a i Shema 1 prikazuju strategiju konjugacije galne kiseline s KTPPTTP kao Gal2–Pep. U SPPS metodi, nečistoće nastale tijekom sinteze peptida obično uključuju peptide sa bočnom reakcijom, zaštitne skupine aminokiselina i otapala koja se koriste za sintezu i pročišćavanje. Poznato je da HOBt koji se koristi u sintezi peptida inhibira racemizaciju i poboljšava učinkovitost sinteze peptida.17-19 Kako bismo uklonili zaštitne skupine aminokiselina i otapala korištena za sintezu, izveli smo nekoliko puta ispiranje koristeći otapala kao što su DMF i DCM tijekom proces sinteze peptida. Čak i nakon posljednjeg koraka pranja, nečistoće, uključujući zaštitne skupine aminokiselina, još uvijek su prisutne u tragovima. Kako bi se zadovoljila čistoća peptida od više od 90 posto koju je izvjestilo nekoliko istraživača,20-22 poluprep HPLC je izveden kao korak poliranja da bi se dobio konačni peptid čistoće od 99,2 posto kao rezultat HPLC analize (vidi sliku. S1†). Pročišćeni peptidni produkt analiziran je pomoću Q-TOF kako bi se ponovno potvrdila njihova uspješna sinteza (Slika 1b–d).

Kliknite ovdje za više informacija o Cistanche Treat Anti-Aging

3.2. Testovi viabilnosti stanica

3.3. Antioksidativno djelovanje sintetiziranih peptida

TPPTTP nije imao aktivnost hvatanja radikala ni u jednoj koncentraciji, dok su GA, Gal–Pep i Gal2–Pep pokazali veću aktivnost hvatanja radikala na način ovisan o koncentraciji.

Uposebno, Gal2–Pep je pokazao najučinkovitijeantioksidansaktivnost; u koncentraciji od 10mM, GA, Gal–Pep i Gal2–Poletimao je aktivnost hvatanja radikala od 13,6 posto, 24,23 posto i 26.0 posto,odnosno. Ovo ukazuje na to da vezanje TPPTTP na GA značine inhibira aktivnost uklanjanja radikala. Slika 3b konfirms thestabilnost uzoraka kao konfirmed procjenom njihove radikalneaktivnost čišćenja kada se čuva na sobnoj temperaturi. GA zadržannjegova aktivnost čišćenja radikala do tjedan dana, ali, aftdva tjedna, ta se aktivnost smanjila za više od 60 posto . Na drugojruka, Gal–Pep i Gal2–Pep je nastavio svoju aktivnost čišćenjaviše od dva tjedna. Konkretno, Gal2–Pep je imao radikalan scavpovećanje aktivnosti od 50 posto čak iu četvrtom tjednu. Ovi rezultatisugeriraju da vezanje GA na TPPTTP stabilizira njegovo uklanjanje radikalaaktivnost. Neke studije su pokazale da je askorbinska kiselina stabiliziranavežući ga peptidima.12,25 Vjerujemo da bi GA mogao biti stabilanlizira se tako da se veže s peptidom na isti način.

Theantioksidativno djelovanje peptidaje također testiran korištenjem DCF DA testova u prisutnosti intracelularnog oksidativnog stresa izazvanog H2O2 (slika 4). Nakon 24 h tretiranja uzoraka na stanicama u koncentraciji od 100 mM, DCF-DA je napunjen na stanice, a stanice su zatim tretirane s H2O2 30 minuta i promatran je intenzitet fluorescencije DCF-a pri ekscitaciji valne duljine od 485 nm i valne duljine emisije od 535 nm. Stanice podvrgnute oksidativnom stresu s 1 mM H2O2 pokazale su intenzitet fluorescencije koji je bio više od tri puta veći od negativne kontrole; međutim, tretman Gal2–Pep proizveo je fluorescenciju koja je bila samo 67 posto one koju proizvode stanice tretirane samo s H2O2. U prisutnosti TPPTTP-a, koji nije pokazao aktivnost hvatanja radikala (Slika 3a), ROS stres uzrokovan H2O2 smanjen je za oko 20 posto, podupirući prethodna istraživanja koja su izvijestila da TPPTTP smanjuje razine ROS-a u stanicama.24 Kada stanice liječeni samo GA, nije bilo značajne promjene u razinama ROS-a. Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da je Gal2–Pep, koji kombinira dvije molekule GA s peptidom, stabilan i učinkovit antioksidans.

3.4. Učinak sintetiziranih peptida na membranski potencijal mitohondrija

U ovoj studiji, boja JC-1 korištena je za istraživanje učinka sintetiziranih peptida na MmP (DJm). MmP djeluje kao važan parametar za funkciju mitohondrija i poznato je da je povezan s nekoliko bolesti kao što su Alzheimerova i Huntingtonova bolest.26 Boja JC-1 proizvodi crvenu majicu iz zelenih emisija nakupljanjem u mitohondrijima i stvaranjem J-agregata. Nakon tretiranja stanica HaCaT i fibroblasta sintetiziranim peptidima tijekom 24 sata, stanice su bile izložene boji JC-1 tijekom 10 minuta, a zatim je izmjeren intenzitet fluorescencije pomoću čitača mikropločica (zeleni lEx=475 nm i lEm ¼ 530 nm, crvena lEx=475 nm i lEm=590 nm). Omjer crvene i zelene fluorescencije izražen je kao promjena puta u usporedbi s negativnom kontrolom (slika 5). HaCaT stanice tretirane GA i peptidom neovisno nisu pokazale nikakvu značajnu promjenu u usporedbi s negativnom kontrolnom skupinom, dok je Gal2–Pep pokazao značajnu razliku, povećanje 1.45-puta u usporedbi s kontrolom. Stanice fibroblasta tretirane s Gal2–Pep također značajno

Slika 4 Analize unutarstanične antioksidativne aktivnosti korištenjem DCF-DA pri koncentracijama galne kiseline i peptida od 100 mM. Nakon 24 sata tretmana, dodan je H2O2 i inkubiran 30 minuta, nakon čega je uslijedilo mjerenje intenziteta fluorescencije DCF. Zvjezdice označavaju statistički značajne razlike (*p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,001).

3.5. Inhibicijska aktivnost elastaze

3.6. Ekspresija gena kolagena tipa I, MMP-1 i PGC-1a

Slika 7. Analiza ekspresije gena u dermalnim fibroblastima pomoću RT-qPCR: (a) kolagen tipa I, (b) MMP-1 i (c) PGC-1a.

Ekspresija PGC-1a bila je najveća nakon 8 h za sve tretmane, sa stopama ekspresije za GA, TPPTTP, Gal–Pep i Gal2–Pep koje su se povećale 2.06-, 1.{{6} }, 1.07-, odnosno 2.05-savijanje. Međutim, za razliku od drugih tretmana, Gal2–Pep povećao je ekspresiju PGC-1a 1.27-puta nakon 24 h. PGC-1aregulira sintezu i antioksidativno djelovanje mitohondrijai prijavljen jesmanjuju se starenjem.29–32 Stoga Gal2–Pep ima potencijal da se koristi kao učinkovit antioksidans koji može učinkovito zaštititi od ROS-a.

Uzevši sve zajedno, Gal2–Pep povećao je ekspresiju PGC-1a i kolagena u usporedbi s učincima samih GA i TPPTTP, dok jeekspresija MMP-1 imala je tendenciju smanjenja, ilustrirajući tako njegov potencijal za upotrebu ukozmetika protiv starenja. 

4. Zaključak

Sukob interesa

Nema sukoba za prijavu.

Priznanja

Ova je studija podržana donacijom Korea Industrial Complex Corp. (KICOX, NTIS br. 1415165722) i istraživačkom potporom Sveučilišta Inha.

Reference

20 P. Song, W. Du, W. Li, L. Zhu, W. Zhang, X. Gao, Y. Tao i F. Ge, Nanomater. Nanotechnol., 2020, 10, 1–10.

21 M. De Zotti, B. Biondi, Y. Park, K.-S. Hahm, M. Crisma, C. Toniolo i F. Formaggio, Amino kiseline, 2012., 43, 1761–1777.

22 Z. Zhai, K. Xu, L. Mei, C. Wu, J. Liu, Z. Liu, L. Wan i W. Zhong, So Matter, 2019., 15, 8603–{{4 }}.

23 DJ Tobin, J. Tissue Viability, 2017., 26, 37–46.