Sažetak
Svrha: Ovo je istraživanje provedeno kako bi se potvrdila primjenjivost miješanog biljnog ekstrakta (MHE) kao lijekakozmetika protiv starenjasastojak istražujući njegovprotiv starenja kožeaktivnosti in vitro i in vivo. Metode: U ovoj smo studiji pripremili MHE pomoću ultrazvučne ekstrakcije koja sadrži Forsythiae fructus, Tribuli fructus, Solomonov tuljan, sibirski ginseng, Ponciri Fructus i Ginseng. Istražili smoanti-aging učinak MHE za kožu u dermalnim fibroblastima. Theaktivnost protiv starenjaje određena razinama sinteze kolagena tipa I. Razine mRNA matrične metaloproteinaze-1 (MMP1) i tkivnog inhibitora metaloproteinaze 1 (TIMP1) mjerene su qRT-PCR-om. Razine MMP1 proteina procijenjene su blotting analizom. Klinička ispitivanja vlažnosti, elastičnosti, teksture i bora kože provedena su pomoću kozmetike koja je sadržavala 1 posto MHE. Rezultati: MHE je inducirao pojačanu regulaciju sinteze pro-kolagena tipa I i ekspresije mRNA TIMP1. MHE je doveo do niže razine MMP1 mRNA i razine proteina. Nadalje, nakon nanošenja na kožu kozmetike koja sadrži 1 posto MHE, poboljšana je hidratacija kože, elastičnost, tekstura i 4 tjedna nakon tretmana. Zaključak: MHE djeluje protiv starenja potičući sintezu kolagena i potiskujući ekspresiju gena MMP1 in vitro, a ima učinak poboljšanja kože in vivo. Stoga se pokazalo da MHE ima vrijednost kao funkcionalni kozmetički sastojak.
Ključne riječi:Briga o koži, Protiv starenja, Protiv bora, Prirodna kozmetika, Biljni lijekovi
Biljni dodaci Cistanche protiv starenja
Uvod
Koža je organ koji dolazi u kontakt s vanjskim okolišem i vitalna je za naš opstanak, djelujući kao primarna barijeraprotiv vanjskih napadakao što su infektivni agensi i fizičke ozljede; osim toga, ispunjava nekoliko važnih fizioloških uloga (Slominski i sur., 2004; Vollmer i sur., 2018). Kako starimo,funkcija kožepostupno propada s atrofičnim promjenama zbog ultraljubičastih (UV) zraka, zagađenja i stresa te starenjem kože do kojeg dolazi smanjenjem broja stanica kože i debljine kože (Farage i sur., 2013.).
Starenje kožemože se podijeliti na endogeno starenje i egzogeno starenje. Endogeno starenje kože događa se prirodno tijekom vremena bez obzira na vanjske utjecaje. Dermalno-epidermalnojunction (DEJ) kohezija slabi, a s diferencijacijomkeratinocita, smanjuje se stvaranje lipida (MakrantonakiET AL., 2007). S druge strane, egzogeno starenje uzrokovano je vanjskimčimbenici kao što su UV zrake, infracrvene zrake (IR), pušenje, finoprašina i stil života. Među njima, fotostarenje uzrokuje UV zračenjezrake koje prodiru u kožu i oštećuju kolagen i elastinu dermisu. U tom procesu, elastična vlakna i kolagenvlakna kože su deformirana, što rezultira smanjenom elastičnošćui opuštenost. Kolagen je glavna komponenta izvanstaničnogmatriksa i ima važnu ulogu u određivanju funkcije tkiva.
Među različitim vrstama kolagena, kolagen tipa 1 čini oko 75-80 posto ukupnog kolagena (Landau, 2007.; Lovell i sur., 1987.; Mays i sur., 1988.). Kada je koža izloženaUV zrake dugotrajno, stvaraju se slobodni radikali. Ove besplatneradikali stimuliraju ekspresiju matrične metaloproteinaze-1(MMP1) koji potiče razgradnju kolagena i inhibira kolagensinteza koja smanjuje elastičnost kože i rezultira borama.Stoga, za sprječavanje i poboljšanje bora kože uzrokovanihstarenja, potrebno je razviti sastojak koji promičeproizvodnju kolagena i inhibira ekspresiju i aktivnostMMP1 (WlaschekET AL., 2001).
Starenje kožeusko je povezana s kvalitetom života. Budući da je koža najvidljiviji organ, ona nas osvještava o procesu starenja (Binić i sur., 2013.). U tijeku su razni napori u područjima medicine, farmaceutike i kozmetikespriječiti i poboljšati starenje kože. Therazvoj sastojaka protiv starenjajedna je od najvažnijih strategija protiv starenja.
Pripremili smo biljne ekstrakte pomoću ultrazvučne ekstrakcije kako bismo razvili nove sastojke protiv starenja koji sadrže Forsythiae fructus, Tribuli fructus, Solomonov tuljan, sibirski ginseng, Ponciri fructus i Ginseng.
Odabrano je šest biljnih lijekova s različitim ljekovitim i kožnim djelovanjem. Forsythiae fructus, osušeni plod Forsythia suspense (porodica Oleaceae), poznat kao Lian Qiaou Kini, prvi je put zabilježen u Shennong Bencao Jing, aprestižna monografija o tradicionalnoj kineskoj medicini (TCM)(DongET AL., 2017). Koristio se kao sredstvo za čišćenje topline idetoksikacija TCM za liječenje zaraznih bolesti, kao što suakutni nefritis, erizipel i čirevi (WangET AL., 2018). to ješiroko se koristi u klinikama kao pojedinačni lijek ili složeni recept.Moderna farmakologija je pokazala da ima nizbioaktivnost, uključujući protuupalno, antibakterijsko, antivirusni, antioksidativni, antitumorski, antidijabetički, antihiperlipidemijski,antiandrogena alopecija, protiv povraćanja, protiv starenja i protivaktivnosti protiv pretilosti i neuroprotektivne, hepato-protektivne ivazorelaksirajuće djelovanje (DongET AL., 2017). Osim toga, bilo jeizvijestio da jeForsythiae fructusima izbjeljivanje kože, anti-atopijskog dermatitisa i učinaka protiv starenja. Prema Tajvanunacionalna baza recepata,Forsythia Fructusje biouvrštena u top 10 biljaka koje se najčešće koriste za liječenje atopijedermatitis (15,9 posto), urtikarija (11.49-13.4 posto) i akne (22,3 posto)(DongET AL., 2017). Forsythiae fructussadrži saponine,flavonoidi,te alkaloida i oleanolne kiseline koja ima koristanfarmakološko djelovanje. Osim toga, sadrži arktigenin imatairesinol. Kao fiziološki aktivni sastojci kože, onisu inhibitori tirozinaze koji djeluju na metabolizam melaninaput izazvan - hormon koji stimulira melanocite ( -MSH)i privlače pažnju kao kozmetički materijali za izbjeljivanje(Yang i Choe, 2011.).Tribuli fructus, koji je sušeno voćeTribulus terrestrisL, navodno ima farmakološki učinakaktivnosti poboljšanja spolne funkcije, prevencije i liječenjakardiovaskularne bolesti, te poboljšanje neuroprotekcije imemorija. Također ima antidijabetičko, protuupalno iantioksidativno djelovanje (ChhatreET AL., 2014). Tribuli fructusekstrakt sadrži velike količine diosgenina, tigogeina, raznihsaponini itd. Ovi saponini su najvažniji bioaktivnikomponente odgovorne za različite biološke učinke kao što suafrodizijačko djelovanje, antihipertenzivno djelovanje i zaštituučinak protiv ishemijsko-reperfuzijske ozljede i protiv raka,antibakterijsko i antifungalno djelovanje (ChhatreET AL., 2014).
Ostali sastojci uključuju furostanol i spirostanol saponine, polisaharide, flavonoidne glikozide, alkaloide i amide. Osim toga, učinkovit je protiv atopijskog dermatitisa u štakora i ima protuupalni učinak (Chhatre i sur., 2014.). Zabilježeno je da učinak ekstrakta Tribuli fructusa protiv starenja povećava proizvodnju pro-kolagena tipa I i elastina u HS68 stanicama, potiče nakupljanje lipida u adipocitima i u konačnici poboljšava bore i elastičnost kože (Kim i sur., 2016.). ). Sibirski ginseng (Acanthopanax senticosus) je listopadni grm koji pripada obitelji Oga zajedno s ginsengom i divljim ginsengom. Sibirski ginseng ima mnogo sličnosti s ginsengom i koristi se kao biljni lijek za moždani udar, visoki krvni tlak i dijabetes. Ekstrakt sibirskog ginsenga već se dugo koristi u istočnjačkoj medicini, a farmakološki i fiziološki rezultati objavljeni su u raznim studijama donedavno. Komponente sibirskog ginsenga koje su do sada identificirane uključuju eleutero strane A, B, C, D, E, I, K, L i M, te sezamin, chiisanoside, kavenu kiselinu, klorogensku kiselinu, kampesterol, vitamine i minerale (Park i sur., 2010).
Sadrži triterpenoidne saponine, lignane, kumarine iflavonoidi, među kojima se fenolni spojevi smatraju najaktivnijim komponentama (Huang i sur., 2011.). Postoje mnoga izvješća o djelotvornosti ekstrakta sibirskog ginsenga na kožu.Učinak protiv bora,antioksidativno djelovanje,sinteza kolagena, a zabilježena je i inhibitorna aktivnost kolagenaze protiv fotostarenja (Park i sur., 2010.). Zabilježeno je da ekstrakt sibirskog ginsenga regulira sintezu kolagena tipa IV, utječući na proliferativni kapacitet epidermalnih matičnih stanica i zadebljavajući epidermis (Choi i sur., 2016.). Salomonov pečat je rizom biljke Polygonatum odoratum (sinonim: P.officinale) koji ima toničko djelovanje, a koristi se u istočnjačkoj medicini za liječenje zatajenja srca i dijabetesa. Solomonov pečat je protiv ciklusa i protiv kašlja; ublažava napetost srca, te je diuretik, energizator, hipoglikemik, sedativ i tonik; koristi se za liječenje plućnih bolesti, uključujući tuberkulozu i gastrointestinalne poremećaje (Haroon i sur., 2012.). Osim toga, široko se koristi u liječenju bolesti krvi; blagotvorno djeluje na bubrežne kanale te sprječava sijedu kosu, probleme s vidom, vrtoglavicu i lišajeve. To je tonik za živce i koristi se u liječenju dijabetesa (Haroon i sur., 2012.). Solomonov pečat ima visok sadržaj fenola i antioksidativno djelovanje. Homoizoflavanoni iz Solomonovog tuljana inhibiraju stvaranje naprednih krajnjih proizvoda glikozilacije. Solomonov pečat pokazao je snažnu regulatornu aktivnost crijevnog imunološkog sustava i sposobnost induciranja diferencijacije osteoklasta i apoptoze izazvane lektinima. U slučaju ekstrakta lišća P. odoratum, kao primjer je navedeno djelovanje zacjeljivanja rana (Fathi et al., 2014.). Ponciri fructus immatures je nezreli plod Poncirus trifoliata Rafinesque, koji pripada obitelji Rutaceae (Jung i sur., 2016.). Nedavno su zabilježeni protuupalni učinci i učinci protiv preosjetljivosti, a zabilježeno je i djelovanje ekstrakta masnog mulja na induciranje apoptoze stanica raka (Lee i sur., 2008.). Ponciri fructus je poznat kao učinkovit u liječenju atopijskog dermatitisa. Primjenom ekstrakta Ponciri fructus na koži zabilježeni su njegovi učinci protiv atopijskog dermatitisa, poput epidermalne hiperkeratoza, dermalnog edema i citokina. Konkretno, zabilježeno je značajno smanjenje svrbeža, broja mastocita, proizvodnje IgE i ekspresije faktora rasta živaca. Ekstrakti Ponciri fructusa pokazali su učinkovit protuupalni učinak protiv atopijskog dermatitisa i antipruritsku učinkovitost regulacijom imunoloških mehanizama. Osim toga, poznato je da oralna primjena ekstrakta Ponciri fructusa pomaže u liječenju i prevenciji alergijskih bolesti (Hwang i sur., 1997.). Ginseng je široko korišten tradicionalni biljni lijek s višenamjenskim djelovanjem. Ginseng se koristi zbog svojih protuupalnih, antioksidativnih, antitumorskih i anti-age aktivnosti (Choi, 2008; Kim & Ko, 2020). Provedena su mnoga istraživanja o djelotvornosti ginsenga na kožu (He i sur., 2018.). Među njima postoje mnoga izvješća o saponinima i ginsenozidima, koji su reprezentativni sastojci ginsenga. Saponini su spojevi koji se u velikoj mjeri nalaze u većini biljaka i postoje u različitim oblicima. Saponini mogu ubrzati razne biološke aktivnosti poput hemolize, te antibakterijske, antivirusne i antioksidativne funkcije. Osim toga, saponini imaju protuupalna svojstva koja mogu smanjiti oticanje i upalu kože. Ginsenozidi povećavaju interleukin (IL)-1, jedan od upalnih citokina za koje se zna da potiču angiogenezu i induciraju vaskularni endotelni faktor rasta i nakupljanjena mjestima opeklina kože kod miševa. Prijavljen je i njihov učinak uklanjanja makrofaga iz kožnih rana i poticanja zacjeljivanja rana (Kim i sur., 2011.).
Cilj ove studije bio je razjasniti učinak miješanog biljnog ekstrakta (MHE) protiv starenja kože in vitro i in vivo.
Metode
1. Procjena učinkovitosti in vitro
1) Priprema MHE
Osušeni plodovi Forsythia suspense, sušeni plodovi Tribulus Terrestris L., sibirski ginseng (Acanthopanax senticosus (Eleuthero) Root), Salomonov tuljan (Rhizome i korijen Polygonatum Officinale), plod Poncirus Trifoliata Rafinesque i ginseng (Panax) kupljen na lokalnom tržištu. Na temelju teorije "Yin-Yang" i "Pet elemenata" tradicionalne kineske medicine (TCM), Forsythia suspensa, Tribulus terrestris L. i Poncirus trifoliata Rafinesque koji odgovaraju "Yang" i sibirskom ginsengu, ginsengu i Solomonovom pečatu koji odgovaraju Odabran je "Yin". Šest ljekovitih biljaka ponovno je podijeljeno u karakteristike koje odgovaraju pet elemenata (drvo, vatra, voda, metal ili zlato i zemlja ili tlo). Ove ljekovite biljke pomiješane su u istom omjeru za ravnotežu svakog elementa, a Poncirus trifoliata i ginseng koji odgovaraju Zemlji kombinirani su s ostalim elementima kako bi se uskladili s omjerima (Tablica 1). Šest ljekovitih biljaka ekstrahirano je u 30 postotnom etanolu ultrazvučnom obradom (20 kHz, 2 h). Nakon koncentriranja s rotacijskim isparivačem, dodano je 30 posto (v/v) butilen glikola, a otopina je razrijeđena da se dobije ekstrakt koji sadrži 1 posto krutog sadržaja.
Tablica 1. Sastav ljekovitih mješavina
2) Stanične kulture i reagensi
Ljudske primarne fibroblastne stanice (HDFn) dobivene su od PromoCell (Normal human human dermal fibroblasts juvenile foreskin, C-12300; PromoCell, Njemačka). Kulture stanica s Dulbeccovimmodificirana Eagleova srednje visoka glukoza (DMEM visoka glukoza, SH30243.01, Hyclone, Cytiva) koja sadrži 10 posto (v/v) fetalnog goveđeg seruma (FBS, SH30084.03, Hyclone) i 1 posto antibiotikaantimikotici (Anti-anti, 15240-062, Gibco, SAD) uzgajani su na 37 stupnjeva u inkubatoru s 5 posto CO2.
3) Test viabilnosti stanica (MTT test)
MTT test mjerio je vitalnost stanica i određivao citotoksičnost MHE. Stanice su nasađene u količini od 5 × 103 stanica/jažici na 96-ploču s jažicama i uzgajane 24 h u kulturi stanicaUvjeti. Zatim smo bacili medij, isprali stanice otopinom fosfatno puferirane slane otopine (PBS, 21-040-CV; Corning, SAD), stavili stanice u novi medij bez seruma itretirao je stanice koncentracijama {{0}}.01, 0.025, {{10}}.05. 0,10, 0,25, 0,50, 0,75 i 1.00 posto uzoraka i inkubirali su stanice 24 i 48 h. Zatim smo dodali 100 μL otopine MTT(0.5 posto, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil-2H tetrazolijev bromid) na svaki dobro i inkubirao stanice još 2 sata. Nakon uklanjanja medija kulture, dodali smo 100 μL 100 postotnog dimetil sulfoksida (DMSO), mućkali stanice 10 minuta i izmjerili apsorbanciju na 590 nm čitačem mikropločica (Epoch 2 čitač mikropločica, BioTek, SAD).
4) Mjerenje generacije pro-kolagena tipa I
Koncentracija pro-kolagena tipa I u mediju stanične kulture mjerena je pomoću komercijalno dostupnog kompleta ELISA (Procollagen type I C-peptid EIA Kit, MK101, TaKaRaBio, Japan) prema uputama proizvođača. Svaki uzorak je analiziran u tri ponavljanja.
5) Mjerenje razine ekspresije mRNA pomoću kvantitativnog
Lančana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu (qRT PCR) Stanice su nasađene u količini od 1×105 stanica/jažici na 6-ploči s jažicama. HDFn stanice su uzgajane 24 sata; zatim su stanice sinkronizirane s DMEM visokom glukozom bez FBS-a tijekom 24 sata. Medij je zamijenjen s medijem bez seruma i tretiran koncentracijama od 0.05, 0.10, 0,25, 0,5 i 0,75 posto uzoraka za 24 i 48 sati. Ekstrakcija RNA provedena je s HDFn stanicama pomoću pribora za ekstrakciju RNA (TaKaRa MiniBEST Universal RNA extraction kit, 9767A, Takara Bio, SAD), a uzorci su pročišćeni prema protokolima proizvođača. Izolirana RNA (1 ug) je sintetizirana u cDNA korištenjem TR kompleta reagensa (PrimeScriptTM RT komplet reagensa s gDNA Eraser, RR047A, Takara Bio, USA). Koristeći SYRB Green Realtime PCR Master Mix (Power SYBRTM Green PCR Master Mix, 4367659, Applied BiosystemsTM, SAD) i QuantStudioTM 3 (QuanStudioTM 3 Real-Time PCR instrument, A28132, Thermo Fisher Scientific, SAD) uređaj za PCR u stvarnom vremenu, razine ekspresije gena standardizirane su prema genu za domaćinstvo gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH). Primeri korišteni u ovoj studiji prikazani su u tablici 2. Pokusi su izvedeni u duplikatu za tri neovisna ponavljanja. Analiza krivulje taljenjaprovedeno je za svaki set primera.
6) Western blot analiza
Proteinski lizati iz stanica fibroblasta ekstrahirani su puferom za lizu (EzRIPA Lysis Kit, WSE-7420; ATTO Corporation, Japan). Za kvantificiranje proteina korištena je Bradfordova metoda.Jednake količine proteina pomiješane su s 5X puferom za uzorke (TLP-102-01, TransLab, Koreja) i denaturirane na 99 stupnjeva 10 minuta. Proteini su odvojeni 10 postotnom SDS-PAGE na 150 V tijekom 150 minuta i preneseni na PVDF membrane (Clear Blot Membrane, 3322546, ATTO Corporation, Japan). Membrane su blokirane s 0,5 posto goveđim serumskim albuminom (BSA, A4503-10G; Sigma) tijekom 1 sata i isprane s Tris-puferiranom fiziološkom otopinom koja je uključivala Tween-20 (10X TBS s Tween 30, TR{ {17}}; Biosesang, Koreja) tri puta; membrane su zatim inkubirane s primarnim antitijelima protiv MMP-1 (rekombinantno anti-MMP1 antitijelo [EP1249Y], ab134184, Abcam, SAD), -Aktin (Anti- -Aktin (N-tern) i PA0207 (Abfrontier , Koreja) na 4 stupnja preko noći. Nakon ispiranja, membrane su tretirane anti-zečjim IgG-peroksidazom hrena (HRP) (Anti-zečji IgG, HRP-vezano protutijelo, #7074; Cell Signaling Technology, USA) kao sekundarnim protutijelom 1 sat. Detekcija kemiluminiscencije provedena je korištenjem ECL Prime western blotting detekcijskog reagensa (GE Healthcare, SAD) i ATTO WSE-6100 LuminoGraph (ATTO Corporation, Japan). Za kvantitativnu analizu, snimljene slike analizirane su Image softver (CS analizator 4, ATTO corporation, Japan).
7) Statistička analiza
Statistička analiza provedena je korištenjem GraphPad Prism verzije 3.03 za Windows (GraphPad Software, SAD). Rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD od 3 eksperimenta. NeuparenKorišten je Studentov t-test, a p vrijednosti<0.05 were considered statistically significant.
2. Procjena učinkovitosti in vivo
1) Reagensi i kozmetički proizvodi
Testirani proizvodi bili su losion za kožu, esencijalna krema i krema za područje oko očiju; te su kreme sadržavale 1 posto MHE kao aktivnog sastojka prikazanog u tablici 3.
2) Ljudski sudionici
Svi su se volonteri složili sa svrhom i sadržajem testa i potpisali pisani obrazac za informirani pristanak prije početka testa. Nije im bilo dopušteno koristiti nikakve druge proizvode za njegu kože, a testni proizvodi nanošeni su na lice redoslijedom koža-krema za područje oko očiju (samo na papučici)-esencijalna krema-losion krema. Studija je provedena u skladu sa smjernicama Helsinške deklaracije i odobrena od strane Institucionalnog odbora za reviziju Korejskog nacionalnog instituta za bioetičku politiku (#P01-202108-13-001).
3) Test učinkovitosti
Dvadeset i jedna ispitanica u dobi između 45 i 55 (srednja vrijednost ±SD 50,81±2.86) godina s normalnom kožom sudjelovala je u ovoj studiji. Ispitivani proizvodi primjenjivani su dva puta dnevno (ujutro i navečer) tijekom 4 tjedna. Sudionici su posjećivali istraživački centar svaka 2 tjedna, a ispitna mjesta su mjerena u laboratoriju, gdje su se temperatura okoline i relativna vlažnost održavali na 22±2 stupnja odnosno 50±5 posto. Sudionici su se aklimatizirali 20 minuta u laboratoriju nakon što su oprali lice i procijenjena im je hidratacija kože, elastičnost, tekstura i "crowd foot". Hidratacija kože mjerena je pomoću Corneometra® CM825 (C plus K electronic GmbH, Köln, Njemačka); elastičnost je mjerena pomoću Cutometra® MPA 580 (C plus K electronic GmbH, Köln, Njemačka), a tekstura i papučice mjereni su pomoću DermaTOP 3D-HE (EOTECH SAS, Francuska).
4) Procjena nuspojava kože
Nuspojave su provjeravane svakim posjetom upitnikom i promatranjem. U procjeni su subjektivni parametri klasificirani kao svrbež, bockanje, škakljanje, žarenje, peckanje,ukočenost i zatezanje, a objektivni parametri klasificirani su kao eritem, edem, ljuskice i papula.
5) Statistička analiza
Podaci su analizirani pomoću softvera SPSS®. Statistička značajnost razlika između vremenskih točaka određena je analizom ponovljenih mjerenja; p-vrijednost<0.05 se smatralo statistički značajnim. Stopa promjene ( postotak ) od osnovne vrijednosti izračunata je na sljedeći način:
Stopa promjene=((nakon tretmana-osnovna vrijednost)/osnovna vrijednost)×100 posto
