Cjepivo protiv adenovirusa koje sadrži skraćeni SARS-CoV-2 Spike protein S1 podjedinicu dovodi do specifičnog imunološkog odgovora kod miševa

SažetakCT:Razvoj učinkovitog i sigurnog cjepiva protiv koronavirusne bolesti 2019 (COVID-19) ključan je pristup za upravljanje pandemijom teške akutne respiratorne bolesti koronavirus 2 (SARS-CoV-2) u svjetlu trenutačnih uvjeta. U ovoj smo studiji proizveli skraćeni segment optimiziranog šiljastog gena SARS-CoV-2 (2043 bp, nazvan S1) koji je mogao kodirati skraćeni protein S1. Protein je testiran kako bi se utvrdilo može li izazvati učinkovitu imunizaciju kod miševa protiv SARS-CoV-2. Prisutnost proteina S1 potvrđena je imunofluorescencijom i Western blotom. Adenovirusno cjepivo koje nosi fragment gena S1 (Ad-S1) primijenjeno je intramuskularno miševima četiri puta tijekom 4 tjedna. SARS-CoV-2 S1 protein humoralni imunitet dokazan je kod svih imuniziranih miševa. Serum imuniziranih miševa pokazao je izvrsnu antiinfekcijsku aktivnost in vitro. Snažan humoralni imunološki odgovor protiv SARS-CoV-2 primijećen je kod miševa nakon cijepljenja s Ad-S1, što sugerira da cjepivo protiv adenovirusa može pomoći u razvoju cjepiva protiv SARS-CoV-2 i drugih genetski različitih virusi.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Ključne riječi: SARS-CoV-2; cjepiva; adenovirusni vektor; S1 gen; imunitet

1. Uvod

Koronavirusna bolest 2019 (COVID-19) često je povezana s višestrukim zatajenjem organa i visokim stopama smrtnosti [1] te predstavlja veliku prijetnju javnoj sigurnosti u cijelom svijetu. Od 15. srpnja 2022. pandemija COVID-19 opstala je globalno, s 557.917.904 potvrđenih slučajeva, uključujući 6.358.899 smrtnih slučajeva, prijavljenih Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji (WHO). Nadalje, do 11. srpnja 2022. primijenjeno je ukupno 12 130 881 147 doza cjepiva. Stoga su dizajniranje i razvoj novih cjepiva protiv koronavirusa (nCoV) od velike važnosti i jedan od glavnih globalnih zdravstvenih prioriteta. S protein je ključni faktor u ulasku SARS-CoV-2 teške akutne respiratorne bolesti koronavirus 2 (SARS-CoV-2) u stanice domaćina [2,3]. Protein se veže na receptor domaćina i omogućuje virusu nesmetan ulazak u stanicu domaćina [4]. N-vezani glikani strše iz površine trimera i opsežno ukrašavaju S protein, utječući na savijanje S proteina, humoralni imunitet i procesiranje proteaze stanice domaćina [5]. SARS-CoV-2 S protein ima manju gustoću N-povezanog glikana od ostalih S proteina izazvanih ljudskim patogenim koronavirusom [6]. Stoga, S protein može biti vrlo imunogen i glavna je meta neutralizirajućih protutijela. S protein ima tri strukturne domene, među kojima je S1 domena najvažniji površinski antigen S proteina [4]. Zbog poteškoća u proizvodnji velikih rekombinantnih proteina (izvanstanična domena proteina S ima oko 1300 aminokiselina) i rizika od pojačanja infekcije ovisnog o antitijelima (ADE), S1 (oko 700 aminokiselina) i njegova domena vezanja na receptore (RBD, oko 200 aminokiselina) naširoko se smatraju najatraktivnijim potencijalnim metama za cjepivo protiv koronavirusa [7,8]. Ljudski adenovirus serotipa 5 (HAdV-C5) široko se koristi u osnovnoj virologiji kao vektor za gensku terapiju i isporuku cjepiva [9]. HAdV-C5 ima prirodnu raznolikost i može parazitirati na većini domaćina, što predstavlja osnovu za razvoj pokusa na životinjama. Rekombinantni adenovirusni vektori s defektima replikacije i replikacije konstruirani iz HAdV-C5 naširoko su korišteni u isporuci cjepiva i genskoj terapiji [9,10]. Trenutno su adenovirusi odobreni kao cjepiva protiv akutnih respiratornih infekcija i bilo je mnogo ispitivanja takvih cjepiva, poput malarije i HIV-a-1 [9]. U ovom radu opisujemo vektorsko cjepivo protiv adenovirusa SARS-CoV-2 s manjkom replikacije i njegovu pripremu i primjenu. U ovoj studiji, adenovirusno cjepivo konstruirano je na sljedeći način: vektor je bio humani replikacijski defektni adenovirus HAdV-C5 s E1 i E3 delecijom, skeletni plazmid bio je rekombinantni adenovirus s pBHGlox∆E1,3Cre, stanična linija za pakiranje bila je HEK293 stanica, a ciljni gen bio je skraćeni S1 proteinski gen SARS-CoV-2. Ekspresija S1 proteina u cjepivu identificirana je Western blotom i imunofluorescentnim testovima. Kako bi se odredila kvaliteta imunoloških odgovora izazvanih kandidatima za cjepivo na bazi šiljaka, odgovor protutijela nakon cijepljenja je detaljno ispitan. Imunološki učinak cjepiva procijenjen je testom vezivanja antitijela (enzimski imunoanaliza [ELISA]) i testom neutraliziranja antitijela. Naša otkrića pružaju osnovu za razvoj i procjenu cjepiva i tretmana za COVID-19 na temelju proteina S1.

2. Materijali i metode

2.1. Stanice i životinje

U ovoj studiji korištene su stanične linije majmunskih bubrega HEK293 i Vero E6. Obje stanične linije uzgajane su u Dulbeccovom modificiranom Eagleovom mediju (DMEM) s dodatkom 2% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 1% penicilina i streptomicina na 37 ◦C s 5% CO2 i zasićenom vlagom. Dvadeset ženki C57BL/6 miševa (6-8 tjedana) kupljeno je od Zhejiang Animal Experimental Center, Zhejiang Province. Miševi su nasumično podijeljeni u dvije skupine s 10 miševa u svakoj skupini. Jedna skupina je imunizirana (100 µL intraperitonealna injekcija) vektorom Ad5 koji eksprimira SARS-CoV-2 spike protein (Ad5-S), a druga PBS-om (100 µL intraperitonealna injekcija) kao kontrola. Ukupna količina virusa bila je 5 × 109 VP. Svi miševi imunizirani su D0/D14 intramuskularnom injekcijom [11,12]. U D14 uzeta je periferna krv od 100 µL, serum je odvojen, a druga injekcija je dana dva sata nakon prikupljanja krvi. Na D28, krv je sakupljena retro-orbitalnom punkcijom i serum je odvojen. Vežuća protutijela otkrivena su 3 dana nakon svakog uzimanja krvi, neutralizirajuća protutijela su otkrivena 7 dana nakon svakog uzimanja krvi, a citokini su otkriveni 7 dana nakon drugog uzimanja krvi. Svi miševi su eutanazirani; svi testovi su provedeni u strogom skladu sa "Smjernicama za brigu i korištenje pokusnih životinja Narodne Republike Kine" i odobreni od strane Etičkog vijeća Sveučilišta Zhejiang Shuren.

2.2. Cjepiva

Svi sojevi SARS-CoV-2 korišteni u ovoj studiji prikupljeni su od pacijenata s COVID-19 uz pristanak. Državni ključni laboratorij za dijagnostiku i liječenje zaraznih bolesti razvio je cjepivo protiv adenovirusa (Vero stanica, soj WuHan, GISAID broj: EPI_ISL_415711) protiv SARS-CoV-2, a zatim cjepivo je proizvedeno u uvjetima usklađenim s razinom biološke sigurnosti (BSL). Specifikacija cjepiva je 0.5 mL/doza i sadrži Tris, NaCl, šećer od trske, MgCl2.6H2O, C6H9N3O2, apsolutni etanol i SARS-CoV-2 S1 protein.

2.3. Konstrukcija rekombinantnog adenovirusa

Proteinski slijed SARS-CoV-2 S1 (br. QRU91950.1) dobiven je od PubMed-a. U skladu s degeneracijom gena, optimizirana sekvenca nukleotida kodona prikladna za ekspresiju stanica sisavaca dizajnirana je na temelju pretpostavke da je sekvenca aminokiselina produkta proteina kodiranog SARS-CoV-2 S1 proteinom ostala nepromijenjena. Ukupna duljina bila je 2043 bp. Prekursorski slijed od 50 sintetiziran je tkivnim aktivatorom plazminogena (tPA), a slijed koji kodira SARS-CoV-2 S1 aminokiselinu 2–688 i tPA prekursorski slijed vezani su. Kozak sekvenca i restrikcijsko mjesto SpeI dodani su ispred početnog kodona, a restrikcijsko mjesto XbaI dodano je nakon terminacijskog kodona. Nukleotidne sekvence gore navedenih gena sintetizirane su i klonirane u pUC18 od strane Sangon Biotech-a kako bi se dobio klonirani plazmid sintetskog gena. Sintetizirani slijed gena S1 i vektor pDC316 digestirani su restrikcijskim endonukleazama SpeI i XbaI. Ciljani fragment i vektor su izvučeni iz gela i spojeni da bi se formirao shuttle plazmid. SARS-CoV-2 shuttle plazmid upakiran je s kosturnim plazmidom adenovirusnog sustava AdMax pBHGloxd∆E1 i 3Cre kotransfekcijom stanica HEK293. Primarna otopina virusa dobivena je nakon ponovljenog zamrzavanja-odmrzavanja i centrifugiranja, a virus je umnožen i uzgojen nakon pročišćavanja plaka.

koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav

Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda za jačanje imuniteta

【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Određivanje titra adenovirusa

HEK293 stanice u dobrom zdravlju odabrane su i resuspendirane kako bi se pripremila suspenzija stanica od 5.0 × 105 stanica/mL, koja je nasađena u 24-pločicu s jažicom (1 mL/jažici ) i uzgojeni na 37 ◦C u okolini s 5% CO2. Uzorak je serijski razrijeđen deset puta i razrijeđeni uzorak (0.1 mL) od 10−5 do 10−8 stanica inokuliran je na 24-ploču s jažicama . Zatim su ploče bile izložene infekciji na 37 ◦C s 5% CO2 tijekom 48 sati. Nakon toga, medij kulture je uklonjen, prethodno ohlađeni metanol (0,5 mL) je dodan, a uzorci su fiksirani na -20 ◦C tijekom 20 minuta. Nakon fiksacije, uzorci su isprani fosfatno puferiranom slanom otopinom (PBS) i blokirani s 1% goveđim serumskim albuminom (BSA, 0,2 mL) na 37 ◦C tijekom 1 sata. Zatim su dodana primarna (mišji anti-adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) i sekundarna (kozji pAb na MS IgG2a(HRP), Abcam ab97245, 1:1000) antitijela i inkubirana 1 h, tijekom kojih je PBS služio za pranje. Nakon inkubacije, dodana je novopripremljena radna otopina (0,2 mL) i inkubirana 5-10 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je radna otopina odbačena, uzorci isprani PBS-om i ponovno dodan PBS (1 mL). Izračunat je prosječni broj pozitivnih stanica u mikroskopskom polju (kat. CKX53, OLYMPUS Research Inverted System Microscope), gdje je odabran gradijent s 5-50 pozitivnih stanica u vidnom polju i najmanje pet područja nasumično odabrano za brojanje . Izračunat je broj vidnih polja u svakoj jažici 24-ploče s jažicom. Zatim je izračunat titar virusa prema sljedećoj formuli (1):

2.5. PCR u stvarnom vremenu

Kako bismo otkrili ekspresiju mRNA stanica HEK293 nakon virusne infekcije, ekstrahirali smo intermedijarnu RNA prema uputama za rad TRIzola (Invitrogen, Waltham, MA, SAD). Ukupna RNA ekstrahirana je korištenjem TRIzola i obrađena s RQ1 RNase-free DNase I (Promega, Madison, WI, USA) kako bi se uklonila zaostala DNA. Komplementarna DNA (cDNA) dobivena je reverznom transkripcijom ekstrahirane RNA upotrebom PrimerScript™ RT reagens kita s gDNA Eraser kitom (Takara, Kusatsu, Japan). Fragmenti DNA generirani su sa specifičnim početnicama P1 (50 -GGTGATTCTTCTTCAGGTTGGA-30 ) i P2 (50 - GTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTG-30 ) ciljnog gena (S1). Gen je umnožen s početnicama P3 (50 -GTCTTCACCACCATGGAGAA-30 ) i P4 (50 -TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-30) kao internom kontrolom (GAPHD).

2.6. Western Blot

Stanični lizat i supernatant odvojeni su elektroforezom natrijevog dodecil sulfata i poliakrilamidnog gela (SDS-PAGE) i zatim prebačeni na membrane od poliviniliden fluorida (PVDF). Mrlje su vizualizirane Western blot opremom za snimanje (Bio-Rad, Hercules, CA, SAD). Ukratko, membrane su prebačene u TBST (50 mL Tris-HCl, pH 7,5, 8 g NaCl [0,5 mL], 0,2 g KCl, 0,5 mL Tween -20) s 5% bezmasnim suhim mlijekom u prahu i mućkajte na tresilici za obezbojavanje na sobnoj temperaturi 1 h. Membrane eksperimentalne i kontrolne skupine uklonjene su iz otopine za brtvljenje i inkubirane s primarnim protutijelom: [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:5000, kat. #40591- T62, Sino Biological, Peking, Kina)] na sobnoj temperaturi. Primarna antitijela su mućkana i inkubirana preko noći na tresilici za obezbojenje na 4 ◦C. Mrlja je isprana otopinom TBST i inkubirana 2 sata sa sekundarnim protutijelom [kozji anti-zečji imunoglobulin G (IgG) H&L (HRP) (1:10 000, kat. #ab6721, Abcam, Cambridge, UK)]. Nakon ispiranja, mrlje su inkubirane 1 minutu s LumiBest ECL priborom za otopinu supstrata (kat. br. 4AW011-100, 4A Biotech), a zatim su promatrane u uređaju za snimanje.

2.7. Imunofluorescentni test

HEK293 stanice (3 × 106/jažici) su nasađene u 12-ploče s jažicama. Nakon 48 h stanice su zaražene adenovirusom koji sadrži S1 gen (Ad-S1). Nakon 48 h, medij je aspiriran, a stanice su isprane jednom s PBS-om koji je sadržavao 2% BSA i fiksirane 15 minuta s metanolom koji je prethodno ohlađen 15 minuta na -20 ◦C. Nakon tri ispiranja s 2% BSA u PBS-u, stanice su permeabilizirane s 0,5% Triton X-100 tijekom 10 minuta. Zatim su stanice blokirane 1 sat s 2 mL 2% BSA, otopina za blokiranje je odbačena, a stanice su isprane tri puta s PBS. Nakon toga, 2 mL primarnog antitijela [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #40591-T62, Sino Biological)] je dodano u svaku jažicu i inkubirati na sobnoj temperaturi 1 h ili 4 ◦C preko noći. Zatim je uzorak ispran tri puta s 2% BSA po 5 min po ispiranju. Zatim je u svaku jažicu dodano 2 mL sekundarnog protutijela [kozji anti-zečji IgG H&L (Alexa Fluor 488) (1:1000, kat. #550037, ZenBio)] i inkubirano na sobnoj temperaturi 1 h. Nakon toga, uzorci su isprani tri puta s 2% BSA 5 minuta po ispiranju. Otopina 40,6-diamidino-2-fenilindola (DAPI) (2 mL, 1 mg/mL) (1:400, kat. #S0001, Bioss, Woburn, MA, SAD) dodana je u svaku jažicu i reagirao 10 minuta u mraku. Analiza je promatrana sa sustavom za snimanje EVOS™ M7000 (kat. #AMF7000, Invitrogen).

2.8. ELISA

SARS-CoV-2 S protein (1 µg/mL) obložen je preko noći u 96-pločama s jažicom (100 µL/jažici) s 0. 05 M bikarbonatni pufer. Nakon ispiranja s PBST (0.2 g KH2PO4, 2,9 g Na2HPO4·12H2O, 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,5 mL Tween-20, dodajte vodu do 1000 mL) pet puta, dodana je otopina za blokiranje i inkubirana na 37 ◦C 1 h. Uzorak seruma je razrijeđen i dodan u svaku jažicu (100 µL/jažici). Nakon 1 h inkubacije na 37 ◦C, uzorci su isprani s PBST pet puta. Dodano je primarno protutijelo [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, kat. #40591-T62, Sino Biological)] i inkubirano 1 h, a zatim uzorci su isprani pet puta s PBST, nakon čega je uslijedila inkubacija od 1 h na 37 ◦C sa sekundarnim protutijelom konjugiranim s peroksidazom hrena [kozji anti-zečji IgG H&L (HRP) (1:10 000, kat. #ab6721, abcam)] i pet pere se PBST-om. Nakon dodavanja 3, 30, 5 i 50-tetrametil bifenil anhidrida tijekom 5 minuta, reakcija je zaustavljena s 2 M sumpornom kiselinom. Optička gustoća je izmjerena na 450 nm i 630 nm instrumentom za označavanje enzima (Molecular Devices, SpectraMax 190) i zatim prilagođena standardnoj krivulji.

Dobrobiti cistanche tubulosa- ojačati imunološki sustav

2.9. Određivanje citokina 

Ploča (kat. #T-k15048D-1, MSD) je isprana tri puta sa 150 µL/jažici pufera za ispiranje i 50 µL pripremljenog uzorka je dodano u svaku jažicu. Zatim je ploča zapečaćena ljepljivom zaštitom za ploču i inkubirana na sobnoj temperaturi uz mućkanje 2 h. Zatim je ploča isprana tri puta sa 150 µL/jažici pufera za ispiranje i 25 µL detekcijske otopine antitijela je dodano u svaku jažicu. Ploča je ponovno zatvorena i inkubirana na sobnoj temperaturi uz mućkanje 2 h. Zatim je ploča isprana tri puta s najmanje 150 uL/jažici pufera za ispiranje; 150 µL 2× Read Buffer T (MSD) dodano je u svaku jažicu, a ploča je analizirana na MSD instrumentu.

2.10. Neutralizirajuća antitijela

2.10.1. Test neutralizacije pseudovirusa

Aktivnost neutralizacije mišjeg seruma testirana je pomoću pseudovirusnog sustava virusa vezikularnog stomatitisa (VSV). Serum je inaktiviran u vodenoj kupelji {{0}}.5 h na 56 ◦C, a zatim serijski razrijeđen do traženog raspona. Stanice HEK293 stavljene su u 96-ploču s jažicama. Razrijeđeni serum pomiješan je s 200 CCID50 (doza virusa koja može zaraziti 50% stanične kulture)/100 µL suspenzije virusa u omjeru 1:1 i stavljen u CO2 inkubator (37 ± 1 ◦C) na 2 h. Zatim je u svaku jažicu dodano 100 µL otopine za održavanje virusa koja je sadržavala 0,5% dvostrukog protutijela penicilin-streptomicin, a neutralizirana smjesa je inokulirana u 96-ploču s jažicom koja je sadržavala stanice od 100 µL po jažici, s dvije ponovljene jažice za svako razrjeđivanje. Istodobno je postavljena normalna stanična kontrola, a stanice su inkubirane u CO2 inkubatoru (37 ± 1 ◦C) 96 h. Zatim je 200 CCID50/100 µL otopine virusa razrijeđeno do 10-1~10-3. Medij stanične kulture u 96-ploči s jažicama je odbačen, 150 µL otopine za održavanje virusa dodano je u svaku jažicu, a razrijeđena otopina virusa je inokulirana u koncentraciji od 10-1~{{33} } u jažice 96-ploče s jažicama (50 µL po jažici). Svako razrjeđenje je ponovljeno u 8 jažica; normalna stanična kontrola postavljena je u isto vrijeme, nakon čega je uslijedila kultura tijekom 96 h. Promjene u staničnom CPE promatrane su pod invertnim mikroskopom. Normalna kontrola stanica ne bi trebala imati citopatske promjene, a pozitivna kontrola trebala bi imati CPE promjene. Krajnje točke neutralizacije (razrjeđenja seruma pretvorena u logaritme) izračunate su promatranjem CPE. Seronegativni/pozitivni kriterij bio je 1:12 kao pozitivni/negativni kriterij,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. Test neutralizacije uživo

Aktivnost neutralizacije mišjeg seruma procijenjena je testom neutralizacije uživo. Razrijeđeni serum je pomiješan sa SARS-CoV-2 i inkubiran na 37 ◦C 1 h. Smjesa je dodana u 96-ploču s jažicama kako bi se zarazile Vero E6 stanice. Nakon 72-h inkubacije na 37 ◦C, citopatski učinak virusa (CPE) opažen je pod povećanjem ×40 i izračunat je neutralizacijski titar (recipročna vrijednost 50%-tnog razrjeđenja seruma potrebnog za neutralizaciju virusne infekcije). Svi gore navedeni postupci provedeni su u okolišu razine 3 biološke sigurnosti.

2.11. Statistička analiza

Statističke analize provedene su t-testom s dva uzorka korištenjem SPSS 26. p-vrijednosti Manje ili jednake 0.05 smatrane su značajnima. Središnja tendencija je mjerena geometrijskom sredinom titra (GMT).

3. Rezultati

3.1. Konstrukcija rekombinantnog adenovirusa

Dobiven je rekombinantni adenovirusni shuttle plazmid pAdeno-CMV-S1 s ispravnom insercijom; njegov strukturni dijagram prikazan je na slici 1. Rekombinantni adenovirus sadržavao je genom HAdV-C5 bez regije E1/E3. Shematski dijagram vektora rekombinantnog adenovirusa dobivenog transfekcijom shuttle plazmida i plazmida citoskeleta u stanicama HEK293 prikazan je na slici 1.

3.2. Karakterizacija rekombinantnog adenovirusa

Rekombinantni plazmid koji sadrži ciljni gen identificiran je PCR-om (vidi sliku 2A za rezultate gel elektroforeze). Ovo je bio ponovljeni eksperiment. Slijedovi primera bili su MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag i S1-R acaataagtagggactgggtc, a sekvenciranje je potvrdilo da je slijed u skladu s dizajnom. Ekspresija SARS-CoV-2 S1 u stanicama otkrivena je Western blotom (Slika 2B) i neizravnom imunofluorescencijom (Slika 2C). Obojenost trake (~75 kDa) detektirana je Western blotingom i bila je u skladu s očekivanim položajem trake. Na razini transkripcije, ekspresija S1 in vitro otkrivena je pomoću PT-PCR. Rezultati su pokazali da je ekspresija S1 mRNA u HEK-293 stanicama bila značajno viša nego u kontrolnoj skupini.

Slika 1. Konstrukcija rekombinantnog adenovirusnog cjepiva i eksperimentalna strategija. (A) pAdeno-CMV-S1 je rekombinantni adenovirusni shuttle plazmid koji sadrži ciljni gen S1. pBHGlox∆E1,3Cre je plazmid skeleta adenovirusa. pBHGlox∆E1,3Cre i pAdeno-CMV-S1 ekstrahirani su QIAGEN kompletom za ekstrakciju plazmida (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Peking, Kina). Jedan dan prije transfekcije, HEK293 stanice su pasirane u tikvici za kulturu stanica od 25 cm2. Medij kulture bio je DMEM koji je sadržavao 5% FBS bez antibiotika. Drugog dana odabrano je 60-80% stanica i stanicama je dodana otopina za transfekciju. Nakon 7 dana od transfekcije, stanice su ostrugane, centrifugirane, supernatant odbačen, a stanice su oživljene s PBS-om. Stanice su zamrzavane-odmrzavane više puta na -80 ◦C i 37 ◦C. Nakon centrifugiranja, supernatant je sadržavao primarnu otopinu virusa. Rekombinantni soj adenovirusa je pročišćen, umnožen i dobiven nakon daljnje obrade i označen kao Ad-S1. Cjepivo je ubrizgano intramuskularno u miševe za daljnje studije. (B) Prikazana vremenska skala imunizacije i uzimanja krvi.

3.3. Titar adenovirusa

U ovom eksperimentu izračunat je prosjek od šest pozitivnih stanica u pet mikroskopskih polja, a virus u jažici razrijeđen je 108 puta. Na temelju formule opisane u odjeljku Materijali i metode, titar adenovirusa bio je 4,74 × 1011 jedinica koje stvaraju plak (pfu)/mL (Slika 2D).

3.4. Stanični imunitet nakon cijepljenja

Tijekom testnog razdoblja došlo je do statistički značajnih promjena u serumskim citokinima (p Manje od ili jednako 0,05), što je uglavnom pokazalo da je koncentracija kemoatraktanta keratinocita/onkogena reguliranog ljudskim rastom (KC/GRO) bila smanjene, a koncentracije IFN-, IL-10, IL-12p70, IL-1 , IL-2, IL-4, IL{{10} } i TNF- bili su povećani, dok se koncentracija IL-6 nije značajno promijenila (Slika 3).

Slika 2. Identifikacija rekombinantnog HAdV-C5–SARS-CoV-2 S1 proteina i određivanje titra adenovirusa. (A) PCR detekcija rekombinantnog plazmida s ciljnim genom S1. (B) Western blot detekcija SARS-CoV-2. Stanice HEK293 eksponencijalnog rasta zaražene su SARS-CoV-2 48 h, zatim je stanični protein ekstrahiran i odvojen pomoću SDS-PAGE. Ekspresija SARS-CoV-2 potvrđena je Western blotingom s kozjim anti-zečjim IgG. (C) Imunofluorescentna mikroskopija HEK-293 stanica inficiranih s Ad-S1 (zeleno). Stanice su obojene s 40, 6-diamidino- 2-fenilindolom (DAPI) kako bi se obojile jezgre. Mjerna traka 1000 µm. (D) Za mjerenje je korišten test plaka. Mikrografije koje prikazuju 10-5, 10-6, 10-7 i 10-8 razrjeđenje (s lijeva na desno).

Slika 3. Ad-S1 inducirane promijenjene razine citokina tipa 1/2, interferona tipa 1 i drugih citokina u plazmi. Rezultati su otkriveni vađenjem krvi iz miševa 7 dana nakon prve imunizacije. Podaci su predstavljeni kao dijagrami raspršenosti u kutiji i viski. Svaki krug predstavlja jednu osobu. p-vrijednosti su izračunate korištenjem t-testa dva uzorka.

3.5. Detekcija anti-SARS-CoV-2 S1 protutijela nakon imunizacije

ELISA je otkrila da su antitijela specifična za SARS-CoV-2- bila prisutna u miševima kojima je ubrizgan prvi i drugi Ad-S1, ali ne i kod onih kojima je ubrizgan kontrolni kapsid adenovirusa ili PBS otopina (Ad/PBS) (Slika 4A). IgG titri od 1:210 i 1:212 otkriveni su u miševima cijepljenim Ad-S1- dva tjedna nakon prve, odnosno druge imunizacije. Titar razrjeđenja 28 dana nakon cijepljenja (D28, GMT 2297,4) bio je 6.1-puta veći od onog u D14 (GMT 378,9).

Slika 4. Ad-S1 inducirao je visoke titre protutijela (A) i aktivnost neutralizacije (B, C) u miševa. (A) ELISA SARS-CoV-2-specifičnog serumskog IgG iz Ad-S1-imuniziranih miševa. (B) Analiza aktivnosti pseudovirusa u serumu miševa imuniziranih s Ad-S{8}}. (C) Analiza neutralizirajuće aktivnosti seruma Ad-S{10}}imuniziranih miševa

3.6. Test neutralizirajućih antitijela

SARS-CoV-2 izazivanje stanica Vero E6 omogućilo je otkrivanje neutralizirajuće aktivnosti u serumu imuniziranog miša (Slika 4B, C). D14 i D28 neutralizacijski titri Ad-S1-imuniziranih Vero E6 stanica protiv SARS-CoV{{10}} izazova živim virusom in vitro bili su 1:24,3 odnosno 1:26,3. Test na pseudovirus dao je slične rezultate kao i test na živom virusu, s titrima neutralizacije do 1:28,1 i 1:29,6 na D14, odnosno D28. Neutralizirajući titar pseudovirusa D28 (GMT 769,0) bio je 27-puta viši od titra D14 (GMT 283,7).

4. Rasprava

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 do<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

U ovoj smo studiji konstruirali rekombinantno adenovirusno cjepivo SARS-CoV-2 koje sadrži SARS-CoV-2 S1 podjedinicu i označili ga kao Ad-S1. Kao i CanSinoBIO, koji je odobren za stavljanje u promet [28], u ovom smo cjepivu koristili HAdV-C5. Adenovirus se široko koristi u rekombinantnoj genskoj terapiji i kao vektor cjepiva. Međutim, seropozitivna stopa HAdV-C5 je čak 75-80% u normalnoj populaciji [29]. To implicira da imunitet protiv HAdV-C5 vektora prije skladištenja značajno smanjuje imunitet izazvan cjepivom. Razvijen na Sveučilištu Oxford u Ujedinjenom Kraljevstvu, ChAdOx1 nCoV-19 koristi vektor adenovirusa čimpanze koji, nasuprot tome, ima nižu stopu seropozitivnosti kod ljudi, a kada je pozitivan, obično ima niži titar antitijela u serumu [30] . Stoga se adenovirusni vektori koji mogu izbjeći već postojeći imunitet mogu istražiti kako bi se poboljšala zaštitna učinkovitost cjepiva protiv adenovirusa. U ovoj studiji, serumski status miševa prije i nakon imunizacije određen je ELISA i neutralizacijskim testovima i dao je dokaz humoralne imunosti za kandidate za cjepivo. Serum proizveden nakon intramuskularne injekcije cjepiva u miševa učinkovito je zaštitio stanice Vero E6 od infekcije SARS-CoV-2 in vitro (Slika 4). Također smo otkrili jači imunološki odgovor i bolju zaštitu kod miševa nakon druge imunizacije (Slika 4). Naši eksperimentalni rezultati slični su glavnim eksperimentalnim rezultatima.

Kako se istraživanje SARS-CoV-2 nastavlja, nekoliko je studija pokazalo da oluja citokina izazvana SARS-CoV-2 infekcijom može utjecati na proizvodnju T-stanica, što otežava pacijentima održavanje dugotrajne imunosti na SARS-CoV-2 [31]. Stoga je potrebno utvrditi može li Ad-S1 inducirati imunost posredovanu T-stanicama kod miševa. Naši su rezultati pokazali da su se koncentracije IFN-a i IL-12 povećale, a koncentracije IL-4 smanjile u Ad-S1 skupini, što ukazuje da je cjepivom izazvano preživljavanje i rast Th1 stanica u miševa. Izlučivanje IL-12, IL-10 i TNF-a iz Th1 stanica neznatno se povećalo u eksperimentalnoj skupini. Ovi rezultati pokazuju da je Ad-S1 učinkovito inducirao Th1-predstrani T-stanični odgovor u miševa [32]. Povećani IL-5 ukazuje da Th2 stanice također sudjeluju u imunološkom odgovoru i proizvode određene učinke. Koncentracija KC/GRO u eksperimentalnoj skupini bila je značajno smanjena u usporedbi s koncentracijom PBS kontrolne skupine, što je moglo biti posljedica smanjene kemotaksije neutrofila koja je potisnula upalni odgovor i omogućila neznatnu kontrolu nuspojava cjepiva. To bi bilo korisnije osobama s oslabljenim imunitetom, poput starijih osoba ili pacijenata koji su podvrgnuti kemoterapiji. Li M. i sur. [29] razvili su cjepivo protiv adenovirusa koristeći Ad68 kao vektor. Rezultati su pokazali da se in vivo neutralizirajuća aktivnost SARS-CoV-2 može otkriti unutar dva tjedna nakon intramuskularne imunizacije BALB/c miševa i zatim nastaviti rasti, a titar neutralizacijskih protutijela (PRNT ID50) dosegnuo je 957,3 u osam tjedni. U međuvremenu, u studiji Liu J., et al. [33], razvijena su cjepiva koja koriste AdC6 i AdC68 kao vektore; oba odgovora na vezivanje i neutraliziranje antitijela nakon imunizacije generirani su 14 dana nakon doze, s titrom IgG od 7108 (geometrijski srednji titar, GMT; AdC6) i 5489 (GMT, AdC68). Titar neutralizacije 50 (NT50) testa neutralizacije pseudovirusa bio je 125 (GMT, AdC6) i 67 (GMT, AdC68).

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

U ovoj studiji, miševi cijepljeni s Ad-S1 imali su titre IgG od 1:1010 i 1:122 otkrivene ELISA-om dva tjedna nakon prve, odnosno druge imunizacije. Titar razrjeđenja ad-s1 bio je 378,9 (GMT) 14 dana nakon inokulacije i 2297,4 (GMT) 28 dana nakon inokulacije. U testu neutralizacijskih antitijela, Vero E6 stanice imunizirane s Ad-S1 pokazale su 1:24,3 i 1:26,3 neutralizaciju na D14 i D28 protiv živog virusa SARS-CoV-2 in vitro. Neutralizacijski titri pseudovirusa u D14 i D28 bili su 283,7 (GMT) odnosno 769,0 (GMT). Stoga je cjepivo u ovoj studiji bilo učinkovitije u smislu imunološkog odgovora u mišjem modelu.

Zbog ograničenja eksperimentalnih uvjeta, nismo proveli analizu enzimski imunosorbentne točke (ELISpot) imunoloških stanica slezene pokusnih miševa. Štoviše, eksperimenti zaštite od napada SARS-CoV-2 na miševima nisu se mogli izvesti zbog ograničenja laboratorija za fizičku zaštitu. Međutim, utvrdili smo da je cjepivo imalo visoku učinkovitost u mišjim modelima i da se može koristiti kao idealan rezervni soj cjepiva. Osim toga, imunogenost, sigurnost i učinkovitost potencijalnih kandidata za cjepivo SARS-CoV-2 treba ispitati na dodatnim životinjskim modelima (npr. zečevi, primati, rakuni, psi), budući da mišji modeli možda neće u potpunosti kopirati ljudske imunološke značajke.

biljka cistanche koja jača imunološki sustav

5. Zaključci

Podaci dobiveni našim pretkliničkim studijama cjepiva protiv adenovirusa pokazali su da cjepivo ima dovoljnu sigurnost i učinkovitost. Stoga bi to moglo biti obećavajuće i izvedivo profilaktičko cjepivo protiv SARS-CoV-2 infekcije.

Reference

1. Trougakos, IP; Stamatelopoulos, K.; Terpos, E.; Tsitsilonis, OE; Aivalioti, E.; Paraskevis, D.; Kastritis, E.; Pavlakis, GN; Dimopoulos, MA Uvid u životni ciklus SARS-CoV-2, patofiziologiju i racionalizirane tretmane koji ciljaju na kliničke komplikacije COVID-19. J. Biomed. Sci. 2021, 28, 9. [CrossRef]

2. Pillay, TS Gen mjeseca: 2019-nCoV/SARS-CoV-2 novi koronavirusni šiljasti protein. J. Clin. Pathol. 2020., 73, 366–369. [CrossRef]

3. Šejnin, M.; Jeong, B.; Paidi, RK; Pahan, K. Regresija raka pluća kod miševa intranazalnim davanjem SARS-CoV-2 Spike S1. Cancers 2022, 14, 5648. [CrossRef]

4. Kadam, SB; Sukhramani, GS; Bishnoi, P.; Pable, AA; Barvkar, VT SARS-CoV-2, pandemijski koronavirus: Molekularni i strukturni uvidi. J. Basic Microbiol. 2021, 61, 180–202. [CrossRef]

5. Sternberg, A.; Naujokat, C. Strukturne značajke šiljastog proteina koronavirusa SARS-CoV-2: ciljevi za cijepljenje. Life Sci. 2020, 257, 118056. [CrossRef] [PubMed]

6. Zidovi, AC; Tortorici, MA; Frenz, B.; Snijder, J.; Li, W.; Rey, FA; DiMaio, F.; Bosch, BJ; Veesler, D. Glikanski štit i maskiranje epitopa proteina šiljaka koronavirusa opaženo krioelektronskom mikroskopijom. Nat. Struktura Mol. Biol. 2016, 23, 899–905. [CrossRef] [PubMed]

7. Wang, Y.; Wang, L.; Cao, H.; Liu, C. SARS-CoV-2 S1 je superiorniji u odnosu na RBD kao antigen podjedinice cjepiva COVID-19. J. Med. Virol. 2021, 93, 892–898. [CrossRef]

8. Theoharides, TC; Conti, P. Budite svjesni SARS-CoV-2 šiljastih proteina: Postoji više nego što se čini na prvi pogled. J. Biol. Regul. Homeost. Agenti 2021, 35, 833–838. [CrossRef] [PubMed]

9. Guo, X.; Deng, Y.; Chen, H.; Lan, J.; Wang, W.; Zou, X.; Hung, T.; Lu, Z.; Tan, W. Sistemska i mukozna imunost kod miševa izazvana jednom imunizacijom s ljudskim adenovirusom tipa 5 ili 41 vektorskim cjepivima koja nose šiljasti protein koronavirusa respiratornog sindroma Bliskog istoka. Imunologija 2015, 145, 476–484. [CrossRef] [PubMed]

10. Gao, J.; Mese, K.; Bunz, O.; Ehrhardt, A. Najsuvremenija vektorologija humanog adenovirusa za terapijske pristupe. FEBS Lett. 2019, 593, 3609–3622. [CrossRef]

11. Xing, K.; Tu, XY; Liu, M.; Liang, ZW; Chen, JN; Li, JJ; Jiang, LG; Xing, FQ; Jiang, Y. Učinkovitost i sigurnost cjepiva protiv COVID-19: sustavni pregled. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi 2021, 23, 221–228. [CrossRef]

12. Voysey, M.; Clemens, SAC; Madhi, SA; Weckx, LY; Folegatti, PM; Aley, PK; Angus, B.; Baillie, VL; Barnabas, SL; Bhorat, QE; et al. Sigurnost i učinkovitost ChAdOx1 nCoV-19 cjepiva (AZD1222) protiv SARS-CoV-2: privremena analiza četiri randomizirana kontrolirana ispitivanja u Brazilu, Južnoj Africi i Ujedinjenom Kraljevstvu. Lancet 2021, 397, 99–111. [CrossRef] [PubMed]

13. Li, C.; Guo, Y.; Fang, Z.; Zhang, H.; Zhang, Y.; Chen, K. Analiza zaštitne učinkovitosti odobrenih COVID-19 cjepiva protiv raznih mutanata. Ispred. Immunol. 2022, 13, 804945. [CrossRef] [PubMed]

14. Tanriover, MD; Do ˘ganay, HL; Akova, M.; Güner, HR; Azap, A.; Akhan, S.; Köse, ¸S.; Erdinç, F.; Akalın, EH; Tabak, Ö.F.; et al. Učinkovitost i sigurnost inaktiviranog SARS-CoV-2 cjepiva s cijelim virionom (CoronaVac): privremeni rezultati dvostruko slijepog, randomiziranog, placebom kontroliranog ispitivanja faze 3 u Turskoj. Lancet 2021, 398, 213–222. [CrossRef]

15. Xia, S.; Zhang, Y.; Wang, Y.; Wang, H.; Yang, Y.; Gao, GF; Tan, W.; Wu, G.; Xu, M.; Lou, Z. Sigurnost i imunogenost inaktiviranog cjepiva protiv SARS-CoV-2, BBIBP-CorV: randomizirano, dvostruko slijepo, placebom kontrolirano ispitivanje faze 1/2. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 39–51. [CrossRef] [PubMed]

16. Yang, S.; Li, Y.; Dai, L.; Wang, J.; On, P.; Li, C.; Fang, X.; Wang, C.; Zhao, X.; Huang, E.; et al. Sigurnost i imunogenost rekombinantnog tandem-ponavljajućeg dimernog RBD-baziranog proteinskog podjediničkog cjepiva (ZF2001) protiv COVID-19 kod odraslih: Dva randomizirana, dvostruko slijepa, placebom kontrolirana ispitivanja faze 1 i 2. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 1107–1119. [CrossRef]

17. Mallapaty, S. Indijsko DNA COVID cjepivo prvo je u svijetu - dolazi ih više. Nature 2021, 597, 161–162. [CrossRef]

19. Grifoni, A.; Weiskopf, D.; Ramirez, SI; Mateus, J.; Dan, JM; Moderbacher, CR; Rawlings, SA; Sutherland, A.; Premkumar, L.; Jadi, RS; et al. Ciljevi odgovora T stanica na SARS-CoV-2 Coronavirus kod ljudi s COVID-19 bolešću i neizloženih pojedinaca. Cell 2020, 181, 1489–1501.e1415. [CrossRef]

19. Cao, Y.; Su, B.; Guo, X.; Sun, W.; Deng, Y.; Bao, L.; Zhu, Q.; Zhang, X.; Zheng, Y.; Geng, C.; et al. Snažna neutralizirajuća protutijela protiv SARS-CoV-2 identificirana visokoučinkovitim jednostaničnim sekvenciranjem B stanica pacijenata koji se oporavljaju. Cell 2020, 182, 73–84.e16. [CrossRef]

20. Amanat, F.; Krammer, F. SARS-CoV-2 cjepiva: Izvješće o statusu. Imunitet 2020, 52, 583–589. [CrossRef]

21. Li, Y.; Bi, Y.; Xiao, H.; Yao, Y.; Liu, X.; Hu, Z.; Duan, J.; Yang, Y.; Li, Z.; Li, Y.; et al. Nova formulacija cjepiva protiv COVID{1}} DNA i proteina pruža punu zaštitu protiv SARS-CoV-2 kod rezus makakija. Emerg. Mikrobi zaraze. 2021, 10, 342–355. [CrossRef]

22. Du, L.; On, Y.; Zhou, Y.; Liu, S.; Zheng, BJ; Jiang, S. Šiljasti protein SARS-CoV–meta za razvoj cjepiva i terapije. Nat. Rev. Microbiol. 2009, 7, 226–236. [CrossRef] [PubMed]

23. Yue, L.; Cao, H.; Xie, T.; Dugi, R.; Li, H.; Yang, T.; Yan, M.; Xie, Z. N-terminalno skraćeni nukleokapsidni protein SARS-CoV-2 kao bolji serološki marker od cijelog nukleokapsidnog proteina u procjeni imunogenosti inaktiviranog SARS-CoV-2. J. Med. Virol. 2021, 93, 1732–1738. [CrossRef] [PubMed]

24. Greaney, AJ; Loes, AN; Gentles, LE; Crawford, KHD; Starr, TN; Malone, KD; Chu, HY; Bloom, JD Cjepivo SARS-CoV-2 mRNA-1273 izaziva više neutralizacije usmjerene na RBD, ali sa širim vezanjem antitijela unutar RBD-a. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Mantus, G.; Nyhoff, LE; Kauffman, RC; Edara, VV; Lai, L.; Floyd, K.; Shi, PY; Menachery, VD; Edupuganti, S.; Scherer, EM; et al. Procjena staničnih i seroloških odgovora na akutnu infekciju SARS-CoV-2 pokazuje funkcionalnu važnost domene vezanja receptora. J. Immunol. 2021, 206, 2605–2613. [CrossRef]

26. On, Y.; Zhou, Y.; Liu, S.; Kou, Z.; Li, W.; Farzan, M.; Jiang, S. Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induciates high potent neutralizing antibodies: Implication for development subjediničnog cjepiva. Biochem. Biophys. Res. Komun. 2004., 324, 773–781. [CrossRef]

27. Deng, S.; Liang, H.; Chen, P.; Li, Y.; Li, Z.; Fan, S.; Wu, K.; Li, X.; Chen, W.; Qin, Y.; et al. Razvoj i primjena cjepiva protiv virusnih vektora tijekom pandemije COVID{1}}. Microorganisms 2022, 10, 1450. [CrossRef]

28. Zhu, FC; Guan, XH; Li, YH; Huang, JY; Jiang, T.; Hou, LH; Li, JX; Yang, BF; Wang, L.; Wang, WJ; et al. Imunogenost i sigurnost rekombinantnog adenovirusnog tipa-5-vektorskog COVID-19 cjepiva u zdravih odraslih osoba u dobi od 18 godina ili starijih: randomizirano, dvostruko slijepo, placebom kontrolirano ispitivanje faze 2. Lancet 2020, 396, 479–488. [CrossRef]

29. Li, M.; Guo, J.; Lu, S.; Zhou, R.; Shi, H.; Shi, X.; Cheng, L.; Liang, Q.; Liu, H.; Wang, P.; et al. Imunizacija s jednom dozom cjepiva na bazi adenovirusa čimpanze izaziva održiv i zaštitni imunitet protiv SARS-CoV-2 infekcije. Ispred. Immunol. 2021, 12, 697074. [CrossRef]

30. Guo, J.; Mondal, M.; Zhou, D. Razvoj novih vektora cjepiva: adenovirusni vektori čimpanze. Pjevušiti. Cjepiva Immunother. 2018, 14, 1679–1685. [CrossRef]

32. Kaneko, N.; Kuo, HH; Boucau, J.; Farmer, JR; Allard-Chamard, H.; Mahajan, VS; Piechocka-Trocha, A.; Lefteri, K.; Osborn, M.; Bals, J.; et al. Gubitak Bcl-6-ekspresije T folikularnih pomoćnih stanica i germinativnih centara kod COVID-a-19. Cell 2020, 183, 143–157.e113. [CrossRef] [PubMed]

32. Lexberg, MH; Taubner, A.; Albrecht, I.; Lepenijes, I.; Richter, A.; Kamradt, T.; Radbruch, A.; Chang, HD IFN- i IL-12 u sinergiji pretvaraju in vivo generirane Th17 u Th1/Th17 stanice. Eur. J. Immunol. 2010, 40, 3017–3027. [CrossRef] [PubMed]

33. Liu, J.; Xu, K.; Xing, M.; Zhuo, Y.; Guo, J.; Du, M.; Wang, Q.; An, Y.; Li, J.; Gao, P.; et al. Heterologna prima-boost imunizacija s adenovirusnim vektorima čimpanze izaziva snažan i zaštitni imunitet protiv SARS-CoV-2 infekcije. Cell Discov. 2021, 7, 123. [CrossRef] [PubMed]