Novi, ataksični mišji model ataksije telangiektazije uzrokovane klinički relevantnom besmislenom mutacijom (2. dio)

Za više informacija kontaktirajtedavid.wan@wecistanche.com

3.0 Rasprava

Povećavanjem genotoksičnog stresa dodavanjem sekundarnog udara DDR putu, generirali smo novi model miša koji prikazuje najopsežniji skup simptoma AT od bilo kojeg modela do danas. To uključuje tešku i progresivnu ataksiju povezanu s cerebelarnom atrofijom i perturbacijama svojstava PN zajedno s visokom učestalošću raka i defektima u razvoju imunoloških stanica. Zajedno, ovi komorbiditeti obuhvaćaju tri vodeća uzroka prerane smrti uAT—svaki doprinosina otprilike trećinu smrti. Od njih, onesposobljavajući učinak ataksije je najprodorniji i pacijenti i njegovatelji navode da ima najveći utjecaj na njihovu kvalitetu života. Iz tog razloga, prisutnost ataksije i cerebelarne atrofije u ovom novom mišjem modelu od velike je važnosti, budući da po prvi put pruža resurs za ne samo razjašnjavanje mehanizama neurološke disfunkcije, već i kritično potreban in vivo model za testirati jako potrebne AT terapije, kao što su spojevi za čitanje koje ovdje opisujemo. Pronašli smo nekoliko sličnosti između ukupnog napredovanja ataksije u Atm3535; Aptx miševi iAT bolesnika. U kliničkom AT-u, motorički nedostaci vidljivi su u dobi od otprilike 2 godine, kada roditelji i liječnici otkriju smanjenu sposobnost prijelaza iz male djece u glatka, refleksno koordinirana vrata—nažalost, malo se zna o motoričkim defektima u ranijim fazama zbog bolesti. niska prevalencija i trenutni nedostatak ranog dijagnostičkog testiranja (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Pacijenti obično nauče hodati bez pomoći, a neurološki simptomi obično ostaju stabilni tijekom prvih 4 do 5 godina života (Rothblum-Oviatt et al. 2016.). Pronašli smo sličnu ranu progresiju motoričkih nedostataka u Atm735×R3x; Aptx^' miševi, detektirajući rane blage motoričke nedostatke na P8 (deficit refleksa ispravljanja) nakon čega slijedi razdoblje relativne stabilnosti, prije početka progresivne i teške ataksije koja se razvija nakon p210 koja uključuje promjene u hodu, refleksu trzanja, tremoru i lokomotorici aktivnost. Nekoliko važnih pitanja proizlazi iz ovih nalaza, uključujući imaju li ATM i/ili APTX neurorazvojnu ulogu u

cerebelum. Buduće studije usmjerene na ranu fazu poremećaja bit će ključne za razumijevanje razvija li se mali mozak normalno prije disfunkcije ili su razvojni defekti početni uzrok. Također smo otkrili, slično pacijentima s AT, da je ozbiljnost kasno razvijene ataksije bila promjenjiva, pri čemu su se neki miševi kretali s nespretnim stražnjim vratima s visokim korakom (Videozapis 3), a drugi su se kretali gotovo u potpunosti putem iskrivljenja stražnjeg trupa ( Slika 1E i video 4) (Rothblum-Oviatt et al. 2016; Levy i Lang 2018; Boder i Sedgwick 1958). Sve u svemu, otkrili smo da je Atm?35×xR35×; Aptx' miševi razvili su vizualno dubok i mjerljiv progresivni gubitak motoričke koordinacije sličan onom uočenom kod pacijenata s AT, koji je spašen ekspresijom barem jedne kopije Atm ili Aptx get he. Gubitak motoričke koordinacije u AT pripisuje se cerebelarnoj degeneraciji zbog njegove relativno selektivne neuropatologije u mozgu i njegove uzročne uloge u nekoliko različitih oblika ataksije (Hoche et al. 2012). U skladu sAT pacijentneuroimaging studijama (Wallis et al. 2007; Sahama et al. 2015; Sahama et al. 2014; Dineen et al. 2020; Tavani et al. 2003; Quarantelli et al. 2013), nalazimo da veličina malog mozga u Atm735×R3× ; Aptx' miševi su u početku normalni, ali progresivno atrofiraju istodobno s promjenama u neurološkim funkcijama. Dok se gubitak cerebelarnog tkiva smatra glavnim uzrokom ataksije kod ljudi, iz kliničkih podataka nije jasno je li težina ataksije dobar prediktor opsega cerebelarne degeneracije pronađene postmortalno (Aguilar et al. 1968b: Crawford et al, 2006 : Dineen et al.2020). U bankomatu?35×R35×; Aptx^ miševa, nalazimo jasnu atrofiju povezanu sa stanjivanjem sloja dendrita Purkinjeovog neurona koji prethodi kasnim, teškim poremećajima u ponašanju. Naša histološka opažanja u Atm?35xR35×; Aptx'miševi sugeriraju da su promjene u samoj cerebelarnoj funkciji, umjesto dubokog gubitka cerebelarnih stanica, dovoljne da izazovu ataksični fenotip, u skladu s opažanjem defekata u ponašanju prije značajnog gubitka PN u nekoliko SCA (Shakkottai et al. 2011: Lorenzetti i dr. 2000.; Clark i dr. 1997.; Jayabal i dr. 2016.). Razlog zašto je nedostatak ATM-a i APTX-a potreban za stvaranje ataksije kod miševa kada je gubitak bilo kojeg dovoljan da izazove ataksiju kod ljudi ostaje nejasan. Jedna je mogućnost da mozak glodavaca može fleksibilnije koristiti kompenzacijske putove ili suvišne proteine ​​dok odgovara na 10-20k DNA lezije koje utječu na stanice svaki dan (Lindahl i Barnes 2000). Postoji nekoliko oblika popravka DNK koji bi mogli odgovoriti na ovaj izazov, uključujući popravak ekscizijom baze (BER), popravak ekscizijom nukleotida (NER),

Kliknite ovdje da saznate više o Cistancheu

kao i homologno i nehomologno spajanje krajeva (HEJ i NHEJ), u koje su svi uključeni ATM i APTX (Chou et al. 2015; Caglayan et al. 2017; Wakasugi et al. 2014; Tumbale et al. 2018; Chatterjee i Walker 2017) Alternativno, to može biti U slučaju da sam nedostatak ATM-a ili APTX-a ne utječe adekvatno na zdravlje stanica tijekom relativno kratkog životnog vijeka miša, pa je stoga eliminacija oba proteina neophodna kako bi se postigla dovoljna akumulacija oštećenja DNA koja bi se manifestirala tijekom tog vremenskog razdoblja. Ova je mogućnost pojačana činjenicom da ATM i APTX imaju različita biokemijska svojstva i funkcionalne uloge u odgovoru na oštećenje DNA, pa bi se stoga predviđalo da će nedostatak oba uzrokovati širi udar na stabilnost genoma (tj. povećani genotoksični stres). Naše otkriće da su dva proteina puta stabilnosti genoma potrebna za induciranje neuroloških defekata u miševa snažno sugerira da je gubitak ATM's Oriole u popravku DNK, a ne potencijalne funkcije u signalizaciji oksidativnog stresa, mitofagiji ili mitohondrijskoj funkciji ono što uzrokuje cerebelarne defekte ( Shiloh 2020). Alternative se, međutim, ne mogu u potpunosti isključiti, jer je APTX, kao i ATM, primijećen unutar mitohondrija moždanih stanica, gdje se smatra da podržava procesiranje mitohondrijske DNK (Meagher i Lightowlers 2014; Sykora et al. 2011). Ovaj novi model miša pruža novi alat za istraživanje ovih mogućnosti i mehaničko definiranje kako gubitak ATM-a i APTX-a u konačnici uzrokuje cerebelarnu disfunkciju. Biofizičke smetnje uočene u PN-ovima snimljenim s AtmR35XR35X; Aptx miševi se slično nalaze u nekoliko drugih mišjih modela ataksije. To uključuje promjene koje smo primijetili u PN ulaznom otporu, kapacitetu membrane i AP pragu i širini, koje su također opisane u mišjim modelima SCA kao što su 1, 3 i 7 (Stoyas et al. 2020; Shakkottai et al. 2011; Dell 'Orco i sur.2015). Štoviše, progresivno smanjenje učestalosti aktiviranja PN akcijskog potencijala o kojem izvješćujemo pozitivno korelira s razvojem ataksije u AtrnR35XR35X; Aptx'miševi prijavljeni su u velikom broju modela ataksičnih miševa, uključujući SCA 1, 2, 3, 5, 6 i 13, kao i nekoliko epizodnih oblika (vidi pregled (Cook, Fields i Watt 2021.)). S obzirom na značajno preklapanje u PN perturbacijama uočenim u mnogim različitim ataksijama uzrokovanim različitim staničnim defektima, ponovno uspostavljanje frekvencija aktiviranja PN AP smatra se širokim terapijskim pristupom. Međutim, ostaje nejasno je li smanjeno PN okidanje uzročni čimbenik ataksije. Štoviše, eksperimentalni dokazi upućuju na to da promjene u aktivnosti PN mogu zapravo biti generalizirani odgovor za održavanje homeostaze tijekom tekućeg oštećenja fiziologije PN povezanog s bolešću (Dell'Orco et al. 2015.). Stoga su potrebni kontinuirani napori u svim cerebelarnim ataksijama da se povežu genetski, molekularni i stanični poremećaji uzrokovani bolešću sa specifičnim promjenama u cerebelarnom neuralnom signaliziranju koje u konačnici stvaraju ataksiju. Od značajne važnosti u ovom nastojanju bit će utvrđivanje uzrokuju li cerebelarni defekti koji uzrokuju bolest uobičajeno ili različito uzrokuju ataksiju kroz gubitak cerebelarne funkcije (npr. gubitak koordinacijskih signala tijekom pokreta) ili zbog dominantno negativnog učinka (npr. ometanje nizvodnog neuralnog sklopovi s abnormalnim neuralnim izlaznim obrascima). U konačnici, iako bi zajednička terapijska strategija za rješavanje cerebelarnih ataksija imala najveći učinak, usmjereni pristup koji se bavi različitim genetskim i molekularnim uzrocima stanične disfunkcije mogao bi u konačnici biti neophodan za uspješan razvoj učinkovite terapije. Mehanička veza između nedostatka DNK proteini stabilnosti kao što su ATM i APTX i PN disfunkcija je daleko od jasne. Naši rezultati sugeriraju da je učinak gubitka ATM i APTX na PN intrinzičan, budući da ne nalazimo promjene u presinaptičkim svojstvima zrnatih stanica ili dokaze o njihovom staničnom gubitku (bez promjene u debljini GCL). Štoviše, dok smo uočili razlike u kratkoročnoj plastičnosti inferiornih olivarnih inputa u PN s nedostatkom ATM-a i APTX-a i divljeg tipa, ovi rezultati vjerojatno ukazuju na poremećaj homeostaze Ca2* potencijalno putem smanjenja inozitola 1,4,5- ekspresija trifosfatnog receptora 1 (ltpr1), slična onima uočenim u mišjim modelima SCAs 1, 2 i 3, kao i miševima s nedostatkom ATM (Kim i sur. 2020; Chen i sur. 2008; Demirci i sur. 2009; Shakkottai i dr. al.2011). Iako ovo pruža obećavajući put za buduća ispitivanja i usporedbe, još je nejasno, čak i za SCA, jesu li promjene u Ca²* homeostazi uzročni faktor ili samo još jedan simptom ili čak kompenzacijski odgovor bolesnih ili poremećenih PN (Dell 'Orco i sur.2015). U imunološkom sustavu, ATM je uključen u popravak lomova DNK koji se prirodno javljaju tijekom preuređivanja gena gena za antigenske receptore u prekursorima B- i T-stanica, što je fenomen kritičan za raznolikost antigenskih receptora (LG i TCR) u tim stanicama. nalazeći daT-stanicaudjeli u krvi su značajno smanjeni u skladu je s prethodnim studijama na ljudima i AT nokaut miševima (Schubert, Reichenbach i Zielen 2002; Hathcock i sur. 2013; Chao, Yang i Xu 2000; Barlow i sur. 1996). Ovo smanjenje T-stanica na periferiji vjerojatno je u korelaciji s defektom stanične i humoralne imunosti. Važno je napomenuti da smo otkrili da je ekspresija jedne kopije ATM gena dovoljna za obnavljanje CD4 plus deficita u krvi, što ukazuje da bi terapije koje mogu vratiti djelomičnu ekspresiju ATM imale terapeutsku učinkovitost. Iako u ovom radu nismo procijenili razvoj B-stanica, vjerojatno bi se slični zaključci primijenili na taj proces s obzirom na njihove mehaničke sličnosti (Marshall et al. 2018.). Kao što se očekivalo, smanjenje T-stanica u perifernoj krvi povezano je s defektnim razvojem timocita. U timusu smo pronašli dva glavna oštećenja. Jedan, induciran primarno nedostatkom APTX-a, manifestira se kao defekt u prijelazu DN3 u DN4 koji koincidira s ranim preuređivanjem lokusa TCR. Drugi defekt, primarno uzrokovan nedostatkom ATM, korelira sa smanjenim napredovanjem dvostruko pozitivnih CD4*CD8 u jednostruko pozitivne stanice, primarno CD4' timocite. Dok je nalaz APTX-a bio iznenađujući, budući da njegov nedostatak (AOA 1) nije povezan s imunološkim deficitima, poznato je da APTX stupa u interakciju s proteinima preraspodjele gena TCR, uključujući XRCC4 (Clements et al. 2004). Buduće studije usmjerene na definiranje uloge APTX-a u mehanizmima spajanja krajeva tijekom preuređivanja TCR gena bit će

važno, a mogućnost da alternativni mehanizmi spajanja krajeva, poput upotrebe mikrohomologija, objašnjavaju nedostatak imunološkog deficita u njegovoj odsutnosti zahtijeva daljnje istraživanje (Bogue et al. 1997). Mogućnost preživljavanja Atm?35×/R35×; Aptx'mice je znatno dulji od prethodnih modela AT miševa. Za usporedbu, prviNA KOmišji model objavio je Barlow et al. umrli od timoma obično unutar 2-4 mjeseci nakon rođenja (Barlow et al. 1996). Smanjena mogućnost preživljavanja raka u ovom i mnogim drugim modelima nokautiranih AT miševa vjerojatno je genetska, budući da se pokazalo da pozadinski soj koji nosi mutaciju ima značajne učinke na prevalenciju raka i preživljavanje, s A/J i C57BL/6

pozadine koje su značajno povećale preživljavanje u odnosu na sojeve BALBC i 129S (Genik et al. 2014.). Činjenica da su naši miševi s nedostatkom ATM-a stvoreni na pozadini C57BL/6 vjerojatno leži u pozadini; da Aptx*t miševi ne razvijaju ataksiju, njihov je relativno dug životni vijek. S obzirom da je Atm35xR35×; Malo je vjerojatno da rana smrt kod AT KO miševa sprječava opažanje ataksičnog fenotipa koji bi se inače razvio kod ovih miševa. Međutim, nije poznato daje li pozadina C57BL/6 otpornost na razvoj ataksije, kao što je slučaj s rakom. Definiranje genetskih ili eventualno epigenetskih čimbenika koji utječu na težinu bolesti moglo bi pružiti puteve za budući terapijski razvoj. S obzirom na globalnu prirodu nulte mutacije ATM i APTX u našem mišjem modelu, ne možemo u potpunosti isključiti mogućnost da ekstracerebelarni defekti također mogu pridonijeti ozbiljnom ataksičnom fenotipu, a time i buduća ispitivanja izvan malog mozga u prednjem mozgu, moždanom deblu, leđnoj moždini. , pa čak i mišiće će trebati provoditi. Unutar malog mozga, dok smo pronašli neke anatomske razlike u svojstvima paljenja PN unutar različitih regija malog mozga, nismo otkrili regionalne razlike u širini ML ili gustoći PN. Međutim, postoje izazovi u korištenju regionalne anatomije kao faktora grupiranja u malom mozgu, budući da fizički nabori tkiva nisu nužno u korelaciji s granicama funkcionalne, molekularne ekspresije ili domena fizioloških svojstava koja su opisana (Apps i Hawkes 2009. ; Tsutsumi et al.2015; Gao, van Beugen i De Zeeuw 2012; Zhou et al.2014). Eksperimenti usmjereni na ispitivanje opsega cerebelarnih defekata unutar ovih domena bit će važni u budućim studijama i u usporedbi s anegdotskim izvješćima o anatomskim razlikama u pacijenata s AT (Verhagen et al. 2012; De Leon, Grover i Huff 1976; Amromin, Boder, i Teplitz 1979; Monaco i dr. 1988; Terplan i Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare i Lopez 1967; Aguilar i dr. 1968a; Paula-Barbosa i dr. 1983). Iako otkrivamo dvije potencijalne faze u napredovanju ataksije u Atm735wR35x; Aptx miševa, kasniji stadij teške ataksije razvija se u odrasloj dobi kod miševa, u usporedbi s pojavom u djetinjstvu kod ljudi. To može ograničiti njegovu upotrebu u nekim neurorazvojnim studijama. Također, tumačenje budućih eksperimenata mora pažljivo uzeti u obzir činjenicu da ovaj novi model izražava nulte mutacije u dva gena stabilnosti genoma u isto vrijeme, situacija koja nije otkrivena kod pacijenata s AT ili AOA1. Konačno, precizno određivanje gdje, kada i kako nedostatak ATM-a uzrokuje cerebelarnu patologiju i ataksiju bio je izazov, budući da prethodnim miševima s nedostatkom ATM-a općenito nedostaju karakteristične značajke potrebne za uzročno povezivanje staničnih i molekularnih nedostataka s ataksičnim fenotipom. Definirano je više obećavajućih puteva istraživanja, uključujući one usmjerene na neuronsku razinu, gdje je ATM uključen u signaliziranje oksidativnog stresa (Chen et al.2003) i sinaptičku funkciju (Li et al.2009; Vail et al.2016), kao kao i funkciju glije, gdje nedavni dokazi sugeriraju da bi patologija glije mogla biti vodeći čimbenik u cerebelarnoj patologiji (Kaminsky et al. 2016; Campbell et al. 2016; Petersen, Rimkus i Wassarman 2012; Weyemi et al. 2015). Ovaj novi životinjski model pruža novi alat za testiranje mehaničkih hipoteza o tome kako nedostatak ATM uzrokuje cerebelarnu patologiju i ataksiju. Dodatno, ovaj model može poslužiti što je najvažnije kao kritičan predklinički alat za testiranje prethodno predloženih terapeutskih kandidata (Browne et al. 2004; Chen et al. 2003) i naših vlastitih SMRT spojeva (Du et al. 2013). Ozbiljna ograničenja nepostojanja prikladnog pretkliničkog modela za terapijsko testiranje, posebno za rijetke poremećaje poput AT i AOA1, ne mogu se precijeniti.

4.0 Materijali i metode

4.1 Etička izjava

Ovo je istraživanje provedeno u strogom skladu s preporukama u Vodiču za njegu i korištenje laboratorijskih životinja Nacionalnog instituta za zdravlje. Sa svim životinjama postupano je u skladu s odobrenim protokolima Institucionalnog odbora za skrb i korištenje životinja (IACUC) na Institutu Lundquist (31374-03,31773-02) i UCLA (ARC-2007-082, ARC{{3} }). Protokol je odobrio Odbor za etiku pokusa na životinjama Instituta Lundquist (Broj osiguranja: D16-00213). Uloženi su svi napori da se bol i patnja svedu na najmanju moguću mjeru pružanjem podrške kada je to bilo potrebno i odabirom etičkih krajnjih točaka.

4.2 Miševi

All mice were group-housed and kept under a 12-h day/night cycle with food and water available ad libitum. Animals were housed within the general mouse house population, and not in specialized pathogen-free rooms. Older animals were made available wetted food or food gel packs on the ground of the cages as ataxia developed. Atm35 and Atm935×mice were created and provided by Dr. Hicks and colleagues at the University of Manitoba. These mice were created to contain the c.103C>T mutacija pronađena u velikoj populaciji Sjeverne AfrikeNApacijenata using recombineering Gateway technology and site-directed mutagenesis. A C>T mutation at this position in the mouse Atm gene creates a TAG G stop codon. The same mutation in the human ATM gene produces a TGA G stop codon. In consideration of the use of these models for therapeutic interventions, we chose to create a mouse model for each of the two PTC codons(Fig.1A). A modified Gateway R3-R4-destination vector was used to pull out the desired region of the mouse Atm gene from a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) and subsequently mutated to create either a TAG G stop codon at codon 35(M00001, position 103(C>T))or a TGA G stop codon (M00002, position 103 (CAG>TGA), replicirajući ljudski AT PTC). Genomski aleli su zatim klonirani u modificiranu verziju vektora za ciljanje sisavaca NorCOMM-a pomoću 3-way Gateway Reaction (Bradley et al. 2012). Rezultirajući ciljani vektori elektroporirani su u C2 ES stanice (C57BI/6N, izvedeno u laboratoriju A. Nagy, Toronto, Kanada) i uspješno ciljani klonovi su identificirani selekcijom s G418 (Gertsenstein et al. 2010). Integracija mutirane ciljne kazete u lokus Atm gena potvrđena je Southern blotom i sekvencioniranjem PCR proizvoda za potvrdu prisutnosti Atm PTC mutacije, ciljanje bez pogrešaka u lokus Atm i funkcionalne komponente bez pogrešaka

vektor (podaci nisu prikazani). Pozitivni ES klonovi korišteni su za injekciju blastocisti kako bi se dobile transgene linije. Transgeni alel je sadržavao floksirani ljudski beta-aktin promotor-deltaTK1-Neo cassette in the intron upstream of the region containing the mutated exon. This floxed cassette was subsequently excised by crossing with a Cre driver mouse(B6.C-Tg(CMV-are)1Cgn/J) to generate Atm3x+ and AtmM1(103CTMFcc, respectively) mouse lines Atm35×+ (MGI nomenclature: AtmTM1(103CAG>TGA)MFGCc; (Slika 1A). Genotipizacija dviju Atm linija provedena je korištenjem sljedećih početnica na Tm 62 stupnja: početnica Atm gena naprijed (F): 5'-CCTTTGAGGCATAAGTTGCAACTTG-3'; i reverzni(R)primer gena Atm: 5'-GTACAGTGTATCAGGTTAGGCATGC-3', stvarajući produkt alela divljeg tipa od 151 bp ili produkt ciljanog alela od 241 bp (Slike 1A, 1B). Atmn35~ i Atm035×v bili su povratno križani s C57Bl/6J miševima kroz 9 generacija (99,2 posto izogeni) prije krioprezervacije i naknadne rederivacije korištenjem C57BI/6J surogat majki. Atm735× i Atm?35x i Atm 35×/Q35× bili su rasplodni miševi dobiveni od F1 srodnih miševa Atm35 i Atm835X plus. AtmR35×k35×: obje su bile plodne. Aptx nokautirani (Aptx) miševi stvoreni su i dostavljeni dr. Mathewsu kao embriji od dr. McKinnona (Ahel et al. 2006.), a zatim su ponovno izvedeni putem C57Bl/6J surogat majki. Aptx' miševi su na C57Bl/6 i 129 mješovitoj pozadini. Atm35k35; Aptx miševi različitih divljih tipova, heterozigotnih i homozigotnih kombinacija stvoreni su iz Atm35X; Aptxt uzgajivači stvoreni su križanjem Atm?35×R35 i Aptx^ miševa. Jedna kohorta dvostrukih mutanata i odgovarajućih kontrolnih miševa korištena je u longitudinalnoj studiji ponašanja za analizu hoda i SHERPA testiranje (Slike 2,3). Višestruke dodatne kohorte dvostrukih mutanata i kontrolnih miševa dobno usklađenih korištene su za elektrofiziološke, imunohistološke i testne pokuse Vertical Pole (Slike 4, 7). Imunološki i eksperimenti s ekspresijom proteina provedeni su pomoću miševa uzgojenih iz izvornih AtmR35× i Atm35× ponovno izvedenih miševa (Slike 5, 6 i 8). Genotipizacija je provedena iz uzoraka tkiva uha P8-11 miševa. Za određivanje genotipa svake životinje korištene su PCR metode u stvarnom vremenu koje je proveo Transnetyx Inc. Životinje su se mogle identificirati pomoću tetovaža nožnih prstiju danih u isto vrijeme kad i biopsija uha. Jedinstveni primeri za Atm35× i Atm35× kvantificirani su i korišteni za identifikaciju divljeg tipa, heterozigotnih i homozigotnih miševa (gore navedenih). Aptx' i Aptx*" početnice korištene su za procjenu njihovih genotipova.

4.3 Zdravlje životinja

Životinje su izvagane digitalnom vagom na P8, 45, 120,210,400. Uginuće životinje zabilježeno je kao dan kada je pronađena mrtva ili na dan eutanazije kada su životinje dosegle humanu krajnju točku (životinja se nije mogla ispraviti unutar 60-ih godina, značajna mat dlaka ukazuje na nedostatak samonjege ili pretjeranu uznemirenost kako je primijetio veterinar osoblje). Trupovi životinja zamrznuti su odmah nakon smrti, a obdukcije su obavljene u serijama. Vjerojatni uzrok smrti utvrđen je prema našim najboljim mogućnostima u suradnji s veterinarkom (dr. Catalina Guerra) vizualnim pregledom unutarnjih organa. Osoblje vivarija je kanibaliziralo neke miševe ili ih se slučajno bacilo i bili su

stoga označeni kao "nestali." Miševi bez vidljivog vizualnog uzroka smrti označeni su kao "neodredivi." Miševi koji su pronađeni s torakalnom masom blizu mjesta gdje bi inače bio timus kod mladih miševa navedeni su kao "rak timusa." Svi ostali identificirani vjerojatni uzroci smrti (npr. povećanje jetre, blokada mokraćnog sustava) označeni su kao "ostalo".

4.4 Ponašanje

Prije izvođenja bilo kakvog bihevioralnog testa, miševi su bili priviknuti na bihevioralni prostor oko 20 minuta. Miševi su testirani u različito doba dana, u skladu s njihovim dnevnim ciklusom. Baterija testova ponašanja provedena je na naivnim dvostrukim mutiranim miševima naznačenih genotipova u različitim vremenskim točkama, ovisno o ponašanju, ali u istoj kohorti miševa. Baterija testova uključivala je procjenu hoda na katunu (P45, 120, 210, 400) i podskup testova SmithKline-Beecham Harwell Imperial-College i Royal-London-Hospital Phenotype Assessment (SHERPA) (P30 i 400). Ove testove proveo je UCLA Behavioral Core. Dvostruki mutirani i kontrolni miševi dodatno su ispitani Vertical Pole testom. Svi bihevioralni aparati su obrisani etanolom (70 posto) između svakog subjekta testiranja.

Analiza hoda

Koristili smo sustav za analizu hoda Noldus Catwalk dizajniran za poluautomatsko mjerenje i analizu hoda miševa tijekom normalnog kretanja. Ukratko, kretanje miševa kroz hodnik sa staklenim dnom je video snimljen sa središnjeg položaja. Otisci šapa istaknuti su u videu zbog svjetlosnog osvjetljenja preko staklene platforme za hodanje. Svaki korak miša unutar videa naknadno se otkriva pomoću Catwalk XT (Noldus) na poluautomatski način. Izvođenje za svakog miša sastoji se od 3 pokušaja dosljednog kretanja po nadziranoj platformi. Prihvaćaju se samo dosljedni pokusi, a miševima može trebati do 10 pokušaja da dovrše 3 sukladna pokusa u oba smjera preko hodnika. Sukladna ispitivanja definirana su kao ona s kretanjem po platformi kraćim od 5 s i s ne više od 60 posto varijacije brzine. Nakon što su postavljeni na platformu, miševi su općenito trčali naprijed-natrag bez ikakve potrebe za poticajem eksperimentatora.

Vertikalni stup

Miševi se postavljaju na vrh klina visokog 80 cm s nosom okrenutim prema dolje i stražnjim šapama što bliže vrhu. Miševi se odmah puštaju, a vrijeme počinje odmah nakon postavljanja.

Vrijeme se zaustavlja kada prva prednja šapa dotakne površinu ispod motke. Prirodna sklonost miševa je da se odmah spuste niz stup, a dano im je do 60 sekundi da prijeđu stup, u suprotnom im se pomaže da siđu sa stupa. Nedovršenom pokusu automatski se daje vrijeme od 30 s, budući da je 95 posto miševa koji se nisu spustili unutar 30 s još uvijek bilo na stupu na granici od 60 s. SHIRPA Bihevioralne testove proveo je Behavioral Core Sveučilišta Kalifornije u Los Angelesu na P30

i P400. Svi parametri se boduju kako bi se pružila kvantitativna procjena. što omogućuje usporedbu rezultata kako tijekom vremena tako i između različitih laboratorija. Svaki miš je sekvencijalno testiran kroz sva ponašanja unutar ~20- min vremenskog raspona prije prelaska na sljedeći miš. Eksperimentator je bio zaslijepljen za životinjski genotip. Provjera je izvedena kao što je prethodno opisano (Rogers et al. 1997).

Promatranje ponašanja

Primarni ekran pruža profil promatranja ponašanja, a procjena svake životinje počinje promatranjem neometanog ponašanja u posudi za promatranje (promjera 10 cm) tijekom 5 minuta. Osim ocijenjenih ponašanja položaja tijela, spontane aktivnosti, brzine disanja i drhtanja, promatrač bilježi sve slučajeve bizarnog ili stereotipnog ponašanja i konvulzija, kompulzivnog lizanja, samodestruktivnog ugriza i retropulzije (hod unatrag) i indikacije prostornog dezorijentiranost.

Ponašanje u areni

Nakon toga, miš se prenosi u arenu (30 cm x 50 cm) radi testiranja uzbuđenja prijenosa i promatranja normalnog ponašanja. Arena je označena u mrežu kvadrata 10 x 10 cm² za mjerenje lokomotorne aktivnosti unutar razdoblja od 30 s. Dok je miš aktivan u areni, bilježe se mjere reakcije na trzanje, hoda, elevacije zdjelice i elevacije repa.

Suzdržavanje u ležećem položaju

Životinja je sputana u ležećem položaju kako bi se zabilježila autonomna ponašanja. Tijekom ove procjene procijenjena je snaga stiska, tonus tijela, refleks usne šupljine, kornealni refleks, stiskanje nožnih prstiju, manevar žicom i otkucaji srca.

Ravnoteža i orijentacija

Na kraju je provedeno nekoliko mjerenja funkcije vestibularnog sustava. Provedeni su refleks uspravljanja, kontaktni refleks uspravljanja i negativni testovi geotaksije. Tijekom ovog postupka zabilježeni su vokalizacija, mokrenje i opći strah, razdražljivost ili agresija.

Korištena oprema

1.Arena od prozirnog pleksiglasa (približne unutarnje dimenzije 55x33x18 cm). Na podu arene je ploča od pleksiglasa označena s 15 kvadrata (11 cm). Čvrsta vodoravna žica (promjera 3 mm) pričvršćena je preko stražnjeg desnog kuta tako da životinje ne mogu dotaknuti strane tijekom manevra žice. Rešetka (40x 20 cm) s mrežom od 12 mm (približno) pričvršćena je preko širine kutije za mjerenje ovjesa repa i ponašanja snage stiska. 2. Prozirni cilindar od pleksiglasa (15 x 11 cm) korišten je kao staklenka za promatranje. 3. Jedan rešetkasti pod (40x 20 cm) s otvorom od 12 mm na kojem stoje staklenke za gledanje.4. Četiri cilindrična nosača od nehrđajućeg čelika (duljina 3 cm x promjer 2,5 cm) za podizanje rešetki s stola. 5. Jedna četvrtasta (13 cm) ploča od nehrđajućeg čelika za prijenos životinja u arenu. 6. Izrezane duljine od 3/0 Mersilka držane u pinceti za testove refleksa rožnice i usne šupljine. 7. Plastična šipka tipla je naoštrena na vrh olovke za testiranje salivacije i grizenja.8. Par pinceta opreme za seciranje, zakrivljenih s finim šiljcima (klešta od 125 mm, Philip Harris Scientific, kat. br. D46-174), za stezanje nožnog prsta. 9.Štoperica.10. IHR Click okvir se koristi za testiranje odgovora zaprepaštenja. Click Box generira kratki ton od 20 kHz na 90 dB SPL kada se drži 30 cm iznad miša. Kontaktirajte prof. KP Steel, MRC institut za istraživanje sluha, University Park, Nottingham NG7 2RD. 11. Ravnalo. 12. Prozirna cijev od pleksiglasa od 30 cm s unutarnjim promjerom od 2,5 cm za refleks uspravljanja kontakta. 4.5 Elektrofiziologija Priprema akutnog cerebelarnog presjeka Slatki parasagitalni rezovi debljine 300 μm pripremljeni su iz malog mozga pokusnih i kontrolnih miševa iz legla. slijedeći objavljene metode (Hansen i sur., 2013.). Ukratko, cerebela je brzo uklonjena i uronjena u ledeno hladnu izvanstaničnu otopinu sastava (mM): 119 NaCl, 26 NaHC0g, 11 glukoze, 2,5 KCl, 2,5 CaCla, 1,3 MgCla i 1 NaHzPOa, pH 7,4 kada je plinom s 5 posto CO-/95 posto O2. Cerebela je presječena parasagitalno pomoću vibratoma (Leica VT-100, Leica Biosystems, Nussloch, Njemačka) i inicijalno inkubirana na 35 stupnjeva -30 min, a zatim uravnotežena i pohranjena na sobnoj temperaturi do upotrebe. Izvanstanična elektrofiziologija Izvanstanične i unutarstanične snimke dobivene su iz Purkinjeovih neurona (PN) u rezovima koji su stalno perfundirani izvanstaničnom otopinom s mjehurićima karbogena i održavani na 37 stupnjeva C (izvanstanični) ili 32 stupnja (unutarstanični) ± 1 stupanj (vidi gore). Stanice su vizualizirane DIC optikom i objektivom uronjenim u vodu 40x (NA 0,75) pomoću mikroskopa Zeiss Examiner. Staklene pipete otpora ~3 MQ (Model P-1000, Sutter Instruments, Novato, CA) napunjene su izvanstaničnom otopinom i postavljene u blizini brežuljaka PN aksona kako bi se izmjerile kapacitivne prijelazne struje povezane s akcijskim potencijalom u načinu naponske stezaljke s potencijalom pipete održavanim na 0 mV. Za patch-clamp snimke cijele stanice, pipete su napunjene intracelularnom otopinom (mM): 140 mjeseci (CH3KO3S), 10 NaCl, 2 MgCl2, 0,2 CaClz, 10 HEPES, 14 fosfokreatin （tris sol）, 1 EGTA, 4 mg -ATP,0,4 Na-GTP.100 μM pikrotoksin (Sigma) je dodan da blokira inhibitorne GABAegeric sinaptičke ulaze. Podaci su prikupljeni pomoću

MultiClamp 700B pojačalo na 20 ili 100 kHz u načinu napona ili strujnih kliješta, Digidata 1440 s pClamp10 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) i filtrirano na 2 do 4 kHz. Serijski otpor je obično bio između 10 i 15 MQ. Serijska otpornost kompenzirana je na 80 posto samo za kratkotrajne pokuse plastičnosti. Za izvanstanična snimanja, ukupno je snimljeno 20 do 45 PN za svaku životinju u svim genotipovima, spolovima i dobnim skupinama. Snimke su raspoređene po medijalno-lateralnoj i rostrokaudalnoj osi malog mozga. Ispitivane su samo stanice "zdravog" izgleda (nizak kontrast staničnih granica) i pravilne, neprekinute brzine paljenja. Tijekom analize, otkriveno je da nekoliko stanica ima praznine u paljenju veće od 2 sekunde, i te su stanice eliminirane iz analize, jer se ova vrsta paljenja povezuje s "nezdravom". Dvostruko mutirano tkivo nije se kvalitativno razlikovalo u izgled pod DIC mikroskopom prije snimanja, niti je broj "nezdravih" stanica bio veći od broja drugih genotipova (7 posto u odnosu na 4 do 11 posto svih stanica u kontrolnim genotipovima na P400). Prostorna usporedba neuralne aktivnosti dobivena je snimanjem iz serijskih presjeka u flokulusu, bočnim (2"d ili 3'), srednjim (6" ili 7.) i medijalnim (11" ili 12t) rezovima. U rezovima je korišten manji broj rezova mlađe dobne skupine (P45 i 110) kako bi otprilike odgovarale relativnom položaju snimaka u dobnim skupinama. 0-3 snimke su napravljene iz svakog lobula unutar svakog presjeka ovisno o kvaliteti i zdravlju tkiva. Svako snimanje trajalo je {{29} } minuta Korišteno je 3 do 5 miševa za svaku dobnu skupinu, a eksperimentator je bio slijep za genotip, dob i spol.

Intracelularne snimke dobivene su iz PN-ova bilo u lobulu IIl ili VIl medijalnog cerebeluma (tj. vermisa); nisu uočene statističke razlike u svojstvima između lobula.

Analize

Interstimulusni intervali spontanog akcijskog potencijala detektirani su i analizirani korištenjem standardnih i prilagođenih rutina u ClampFit (Molecular Device), GoPro (Wavemetrics) i Excel (Microsoft). Konkretno, detektirani su pragovi akcijskih potencijala, a statistika skokova (tj. učestalost i duljina intervala) određena je korištenjem prilagođenih ili proroutina (TaroTools;https://sites.google.com/site/tarotoolsregister/). Koeficijent varijacije srednjeg intervala između skokova (CV) i medijan intervala među skokovima (CV2=2 ISIn plus 1-ISInl/(ISIn plus 1 plus ISIn)) izračunati su u Excelu pomoću prilagođene makronaredbe. Standardna svojstva membrane analizirana su pomoću lgorPro. RM je određen usrednjavanjem 3 odgovora traga napona na -5 mV koračni impuls od -80 mV zadržavajućeg potencijala i mjerenjem rezultirajućeg otklona struje između 900 i 1000 ms nakon početka. Membranska vremenska konstanta je mjerena prilagođavanjem jedne eksponencijalne početne faze raspadanja od 90 posto do 10 posto vrha. CM je izračunat dijeljenjem vremenske konstante membrane s RM. sEPSC događaji su zabilježeni tijekom 1-minutne epohe te detektirani i izmjereni pomoću Neuroexpressa (v21.1.13). Aksoni paralelnih i penjajućih vlakana stimulirani su pomoću theta-staklenih elektroda (WPI) i TTL-kontroliranog izolatora podražaja (ISO-Flex, AMPI). Izazvane EPSC amplitude i vremenske konstante opadanja (1 eksp. za paralelna i 2 eksp. za penjajuća vlakna) analizirane su korištenjem prilagođenih rutina u lgorPro. Akcijski potencijali ispitani su kao dio niza ubrizgavanja struje od 1 s između -500 i 2250 pA (u koracima od 250 pA) sa strujom zadržavanja prilagođenom za održavanje ~70 mV potencijala. Valni oblici akcijskog potencijala izmjereni su pomoću prilagođenih

rutine u lgorPro. Prag akcijskog potencijala definiran je kao prvi membranski napon u kojem je prvi derivat premašio 30 mV/ms (Zhu et al.2006).

4.6 Ispitivanje cerebelarne atrofije

Veličina malog mozga Neposredno nakon uklanjanja mozga iz lubanje, dobivena je dorzalna, cjelovita slika. Slike su zatim obrađene pomoću Fiji (NIH). Veličine prednjeg mozga i malog mozga procijenjene su ocrtavanjem njihovog 2-dimenzionalnog prostora i zatim izračunavanjem površine. Normalizirali smo moguće razlike u ukupnoj veličini mozga dijeljenjem rezultata malog mozga s veličinom prednjeg mozga kako bismo dobili relativni omjer malog i prednjeg mozga. Eksperimentatori su bili slijepi za genotip životinje. Imunohistokemija Na odgovarajućim krajnjim točkama studije (P45, 120,210,4{{7{{104}}}}0), mužjaci i ženke miševa svih genotipova predstavljen u ovoj studiji bio je anesteziran izofluranom i podvrgnut transkardijalnoj perfuziji fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom, nakon čega je slijedio 4 posto (w/v) puferirani paraformaldehid (PFA), a zatim je seciran da se ekstrahira mozak. Slike cijelog mozga snimljene su odmah nakon uklanjanja mozga iz lubanje, a mozgovi su potom potopljeni u 4 posto PFA tijekom 24 sata, a zatim kriozaštićeni u Tris puferiranoj fiziološkoj otopini (TBS) s 0,05 posto azida i 30 posto saharoze tijekom 72 sata. sati i čuvati na 4 stupnja do daljnje uporabe. Mali mozak je odvojen od prednjeg mozga i parasagitalno presječen pomoću kliznog mikrotoma （Microm HM 430, Thermo Scientific） postavljenog na rez na 40 μm debljine. Sekcije malog mozga sakupljene su u seriji od šest i pohranjene u TBS-AF (TBS s 30 posto saharoze, 0,05 posto natrijevog azida i 30 posto etilen glikola) na 4 stupnja ili -20 stupnja do daljnje upotrebe. Za imunofluorescentnu vizualizaciju Purkinjeovih neurona, sekcije malog mozga oba Atm*; Aptx*t i Atm?35×R35×; Aptx^(n=5 po genotipu) su isprani 5 minuta u TBS-u tri puta, a zatim blokirani u 15 posto normalnom kozjem serumu na sobnoj temperaturi 30 minuta nakon čega je uslijedila inkubacija u slobodnoj plutajućoj smjesi u zečjim ili mišjim anti-kalbindin D -28k (1:1000) 1 sat na sobnoj temperaturi na orbitalnoj tresilici. Sekcije su zatim isprane 5 minuta s TBS tri puta, nakon čega je uslijedila inkubacija u slobodnoj inkubaciji u kozjem anti-zečjem ili mišjem Alexa Fluor 488 (1:1000) 1 sat u mraku na sobnoj temperaturi na orbitalnoj mućkalici. Nakon sekundarne inkubacije protutijela, rezovi su isprani 5 minuta u TBS-u tri puta, zatim postavljeni i pokriveni Fluoromount-G s DAPI. Za neke dijelove, protutijela protiv cijepane kaspaze-3(1:200) i anti-CD68(1:400) dodatno su ispitivana paralelno s Calbindinom pomoću sekundarnog antitijela Alexa Fluor 647 (1:500). Slajdovi su skenirani pomoću Stereo Investigatora (MBF Bioscience, ver. 2020) na Zeiss mikroskopu opremljenom ApoTome 2 (Carl Zeiss Microscopy, Axio Imager.M2) koristeći objektiv 2,5, 10, 20, 40 ili 63x i slike snimljen Hamamatsu CMOS kamerom (Hamamatsu Photonics, ORCA Flash 4.0 LT plus). Kako bismo kvantificirali broj stanica reaktivnih na kalbindin u svakoj lobuli na dobivenim slikama, upotrijebili smo Stereo Investigator za nasumično crtanje 2 linije duge između 300 do 500 μm u svaki lobule i ručno izbrojao ukupan broj PN-ova duž duljine unutar 40 um debljine presjeka tkiva pod povećanjem od 40x. 2D gustoća (# PN-ova/(linearna duljina*40 um debljina)) dva uzorka po režnjuću su tada u prosjeku za daljnju usporedbu između lobula i životinja. Kalbindin pozitivne širine PN dendrita izmjerene su na unaprijed određenoj lokaciji u režnjuku VI svake životinje u presjecima tkiva debljine 25 ili 40 um pod povećanjem od 20x. Širina dendrita primarnih i sekundarnih grana izmjerena je na srednjoj liniji između tijela PN stanica i ruba molekularnog sloja. Izmjereno je između 7 i 13 dendrita po sekciji, jedna sekcija po životinji. Za somatska mjerenja PN, Stereo Investigator je korišten za nasumični odabir PN raspoređenih po cijelom medijalnom dijelu pod povećanjem od 20x. Prosječna PN širina po životinji određena je usrednjavanjem rezultata preko 3 serijske sekcije (16 do 37 PN po sekciji). PN širine su izmjerene okomito na PN sloj ili na izlazni dendrit ako je nagnut za više od nekoliko stupnjeva. Širina molekularnog sloja i sloja granuliranih stanica (vizualiziranih bojama Calbindin i DAPI) procijenjena je u Stereo Investigatoru izračunavanjem prosjeka dvaju mjerenja širine na unaprijed definiranim lokacijama za svaki režnjić, otprilike na pola puta uz dužinu svakog režnjića pod povećanjem od 2,5x. CD68 pozitivnost u cerebelarnim dijelovima je kvantificirana mjerenjem ukupnog postotka površine CD68 plus pozitivno bojenje preko cijelog medijalnog cerebelarnog dijela. 10x spojene slike postavljene su na prag negativne kontrole i kvantificirane pomoću ImageJ, jedan odjeljak po životinji. Kako bismo kvantificirali postotak PN-ova pozitivnih na Calbindin koji su bili pozitivni na cijepanu kaspazu-3, izbrojali smo PN-ove u cijelom malom mozgu pomoću Stereo Investigatora. Ispitane su tri spojene slike s povećanjem od 20x po životinji i rezultati su prosječni. Prag za pozitivnost na kaspazu-3 utvrđen je iz kontrolnih presjeka obojenih samo sekundarnim antitijelima. Za nefluorescentnu histološku analizu, 25-um-debele, slobodno plutajuće dijelove tkiva na pozitivno nabijena stakalca i osušite na zraku preko noći. Tkivo je isprano u fiziološkoj otopini s fosfatnim puferom (PBS) dva puta po 5 minuta, zatim je obojeno sekvencijalno s 0,1 posto hematoksilina u 95 postotnom etanolu tijekom ~25 s i 0,5 posto eozina u 95 postotnom etanolu tijekom ~3 s i isprano u dvostruko destiliranoj vodi nakon svaka mrlja. Tkivo je potom dehidrirano 1 minutu u 95-postotnom etanolu, 100-postotnom etanolu i 100-postotnom ksilenu za ispiranje, a zatim prekrito Permountom. Slajdovi su snimljeni pomoću kamere u boji (Q Imaging, MBF Biosciences) na istom Zeiss mikroskopu i MBF softveru za prikupljanje. Eksperimentatori nisu bili upoznati s genotipom miša u kojem su sekcije pregledane, a redoslijed pregleda je bio isprepleten za sva histološka mjerenja.

4.7 Mjerenja protočnom citometrijom

Protočna citometrijska analiza krvi i stanica timusa provedena je bojenjem specifičnim anti-mišjim antitijelima∶CD4, CD8, CD3, CD44 i CD25. Ukratko, uzorci pune krvi (50 μ） obojeni su pomoću fluorescentno obilježenih antitijela, zatim su crvene krvne stanice lizirane pomoću BD otopine za liziranje, dok su žive bijele krvne stanice obojene pomoću boje vitalnosti. Thymi su mehanički disocirani. 1 do 2 milijuna stanica timusa obojeno je na sličan način korištenjem specifičnih antitijela za CD4, CD8, CD44 i CD25. Analiza imunološki obojenih uzoraka bijelih krvnih stanica ili timusa provedena je pomoću FACS ARIA 1, a podaci su analizirani pomoću softvera FlowJo kao što je prethodno objavljeno (Sanghez et al. 2017.).

4.8 Western BIots

Proteinski ekstrakti (stanice/tkiva) homogenizirani su u puferu za lizu radioimunoprecipitacijskim testom (RIPA) (150 mM NaCl, 1 posto Nonidet P-40 [NP-40],0 .5 posto deoksiholata,0.1 posto SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) s inhibitorima proteaze (10 ug/ml AEBSF, 10 ug/ml leupeptina, 5 ug/ml pepstatina, 5 ug/ml kimotripsina, 10 ug/ml aprotinina). Proteinski ekstrakti su sonicirani i zatim peletirani centrifugiranjem na 13,000 okretaja u minuti tijekom 15 minuta na 4C. BCA test proteina korišten je za kvantificiranje koncentracija proteina. Uzorci koji su sadržavali jednake količine proteina od 50 do 100 ug po stazi su odvojeni korištenjem 4 do 12 postotnog gradijenta TGX gotovih gelova BioRad, a zatim su prebačeni TransBlot Semi-Dry BioRad sustavom korištenjem nitroceluloznog paketa za prijenos. Prijenesene mrlje su obojene Ponceau S mrljom za jednaku količinu proteina, zatim su isprane i blokirane s 5 posto nemasnog suhog mlijeka u TBST-u tijekom 60 minuta na sobnoj temperaturi. Primarna antitijela su inkubirana uz mućkanje preko noći na 4 stupnja. Mrlje su testirane na sljedeća protutijela: ATM (D2E2) zečja mAb stanična signalizacija, u razrjeđenju 1:1000, -aktin (D6A8) zečja mAb stanična signalizacija, GAPDH (D16H11) zečja mAb stanična signalizacija praćena odgovarajućim konjugiranim s peroksidazom hrena ( HRP) sekundarni Anti-zečji, Anti-mišji 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon višestrukog ispiranja s TBST, ekspresija proteina detektirana je kemiluminiscentnim supstratom Radiance Plus pomoću Azure c400 i BioRad ChemiDoc sustava za snimanje. Denzitometrijska analiza bankomata provedena je pomoću ImageJ. Pokusi su izvedeni s 2 tehnička i 2-3 biološka ponavljanja kako je naznačeno.

4.9 Statistička procjena

Broj životinja odabranih za svaku skupinu temeljio se na apriornim analizama snage korištenjem GPower v3.1 na temelju veličine 0.5, snage 0.8 i veličine učinka procijenjene iz preliminarnih podataka ili prethodne studije. Koristili smo i parametarske (1-i 2-way ANOVA) za normalno distribuirane i neparametarske (Kruskal Wallace) statističke metode za intervalne podatke za testiranje razlika između grupa nakon čega su uslijedili testovi višestrukih usporedbi u paru kao što je naznačeno u tekst. Outlieri za imunološke podatke na sl. 6 i 7 isključeni su metodom ROUT (Q=2 posto). Specifične analize korištene za svaki skup podataka navedene su u legendi svake slike. Za sve slike: ns nije značajno,*p Manje od ili jednako 0.05,** p<0.01,***><0.001,****><0.0001. data="" are="" reported="" as="" mean="" ±="" sem="" and="" box="" and="" whisker="" plots="" indicate="" the="" minimum,="" first="" quartile,="" median,="" third="" quartile,="" and="" maximum="" data="" values.="" all="" figures="" and="" statistical="" analyses="" were="" completed="" using="" excel="" (microsoft="" 360)="" or="" prism="" v8="" and="" 9="">