2.6. Izraz kaspaze-3 i kaspaze-6

Glikozid cistanhe također može povećati aktivnost SOD-a u tkivima srca i jetre, te značajno smanjiti sadržaj lipofuscina i MDA u svakom tkivu, učinkovito čisteći različite reaktivne kisikove radikale (OH-, H₂O₂, itd.) i štiteći od oštećenja DNA uzrokovanog pomoću OH-radikala. Cistanche feniletanoidni glikozidi imaju jaku sposobnost hvatanja slobodnih radikala, veću reducirajuću sposobnost od vitamina C, poboljšavaju aktivnost SOD u suspenziji spermija, smanjuju sadržaj MDA i imaju određeni zaštitni učinak na funkciju membrane spermija. Cistanche polisaharidi mogu pojačati aktivnost SOD i GSH-Px u eritrocitima i tkivu pluća eksperimentalno starih miševa uzrokovanih D-galaktozom, kao i smanjiti sadržaj MDA i kolagena u plućima i plazmi, te povećati sadržaj elastina, imaju dobar učinak čišćenja na DPPH, produžiti vrijeme hipoksije u starim miševima, poboljšati aktivnost SOD u serumu i odgoditi fiziološku degeneraciju pluća u eksperimentalno starim miševima Uz stančnu morfološke degeneraciju, pokusi su pokazali da Cistanche ima dobru antioksidacijsku sposobnost i ima potencijal da bude lijek za prevenciju i liječenje bolesti starenja kože. U isto vrijeme, ehinakozid u Cistancheu ima značajnu sposobnost hvatanja slobodnih radikala DPPH i ima sposobnost hvatanja reaktivnih vrsta kisika i sprječavanja degradacije kolagena izazvane slobodnim radikalima, a također ima dobar učinak popravka na oštećenje aniona slobodnih radikala timina.

Kliknite ovdje da saznate Cistanche Tubulosa za antioksidans

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

TgAPP miševi pokazali su povećanje ekspresije gena kaspaze{{0}} (Slika 8C1, H1), koje je bilo značajno i veće od 30 posto u usporedbi s hipokampusima WT miševa (Slika 8H1; p < 0,05). Što se tiče ekspresije kaspaze-6, nisu primijećene razlike između transgenih i netransgenih miševa (Slika 8C2, H2).

Liječenje kvercetinom i rutinom uspjelo je sniziti razine mRNA kaspaze{{0}} u hipokampusu na statistički značajan način (Slika 8H1; p < 0.05), s postocima inhibicije od oko 17 posto i 27 posto za ženke i mužjake miševa. U cerebralnom korteksu značajne razlike uočene su samo u liječenju rutinom kod muškaraca (Slika 8C1; p < 0,05).

O kaspazi-6, tretmani kvercetinom i rutinom nisu imali nikakav statistički značajan učinak u korteksu ili hipokampusu (Slika 8C2, H2), iako je u potonjem kaspaza-6 kod TgAPP muškaraca pokazala tendenciju smanjenje (Slika 8H2).

2.7. Markeri upale

Rezultati dobiveni za ekspresiju gena medijatora upale IL-1, TNF- i IFN- prikazani su na slici 9.

U TgAPP, došlo je do značajnog povećanja ekspresije gena IL{{0}} od oko 20 posto u korteksu i hipokampusu kod oba spola u usporedbi s WT miševima (Slika 9C1, H1; p < 0,05). Što se tiče TNF-, iako su više razine mRNA prikazane u TgAPP, one nisu statistički značajne u WT miševa (Slika 9C2, H2). Što se tiče IFN-a, došlo je do povećanja od oko 30 posto u njegovoj ekspresiji kod muškaraca, što je bilo statistički značajno samo u korteksu (Slika 9C3; p < 0,05).

Tretmani kvercetinom i rutinom, i kod ženki i kod mužjaka, uspjeli su smanjiti ekspresiju IL{{0}} u cerebralnom korteksu i hipokampusu u usporedbi s kontrolnim TgAPP miševima (Slika 9C1, H1; p < {{8 }}.05), dobivajući slične vrijednosti onima kod WT miševa, a posebno niže u hipokampusu muških miševa (Slika 9H1; p < 0,05).

Ukupni učinak oba tretmana flavonoidima na ekspresiju IL{{0}} nije primijećen s TNF- niti s INF-. Stoga su muškarci TgAPP, nakon liječenja kvercetinom, bili podvrgnuti značajnom smanjenju hipokampalne ekspresije TNF- (Slika 9H2; p < 0.05) i kortikalne ekspresije IFN-a (Slika 9C3; p < 0,05).

2.8. Procjena degenerirajućih neurona i njihove projekcije

Nisu primijećeni nikakvi karakteristični znakovi neurodegeneracije u dobi u kojoj su testirani transgeni TgAPP miševi, u usporedbi s WT miševima, niti su tretmani kvercetinom i rutinom pokazali bilo kakvu promjenu tijekom 4 tjedna u usporedbi s TgAPP (Slika S1, Dodatni podaci).

2.9. Ekspresija ionotropnih glutamatnih receptora

Nisu nađene značajne razlike u ekspresiji receptora, uspoređujući vrijednosti dobivene za kontrolne TgAPP miševe s onima dobivenim za WT miševe. Također nije bilo značajnih učinaka na ekspresiju ovih ionotropnih receptora u prisutnosti tretmana kvercetinom ili rutinom (Tablica S5, Dodatni podaci).

3. Rasprava

Svrha našeg ovog istraživanja bila je procijeniti utjecaj dva flavonoida, kvercetina i rutina, u prvim fazama patogeneze AD, bez obzira na njihov učinak na neurodegeneraciju i/ili kognitivnu funkciju. Korteks i hipokampus bili su područja mozga koja su analizirana, budući da su to moždane strukture koje su najviše pogođene AD-om. Treba uzeti u obzir da su kvercetin i rutin davani kroz formuliranu prehranu koja je sadržavala jedan od dva flavonoida, kako bi se oponašao, u AD životinjskom modelu, unos zdrave ljudske prehrane koja sadrži aktivni sastojak.

Konkretno, transgen APPswe u C57B6 mišu imao je značajan utjecaj na omjer GSH/GSSG, razine MDA, kapacitet antioksidativnog enzima, ekspresiju APP, aktivnost BACE1 i ekspresiju kaspaze-3 i IL-1. Dok mutacije APP-a kod ljudi općenito dovode do tipičnog AD-a, one su pretežno povezane isključivo s amiloidnom patologijom u APP transgenih miševa i nema primjetne neurodegeneracije [14,15], budući da nije bilo karakterističnih znakova primijećenih u naših transgenih miševa TgAPP, suprotno WT miševi (dodatni podaci, slika S1). Suprotno bojenje s 40 -6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI) neurona hipokampusa omogućilo nam je promatranje nuklearne morfologije, jer je ovaj spoj fluorescentna boja za nukleinske kiseline. Nismo uočili fragmentirane ili lobularne jezgre, tipično apoptotične; niti smo uočili bilo kakve značajne razlike uspoređujući hipokampalne histološke presjeke kontrolne transgene linije TgAPP u odnosu na WT isječke; niti smo uočili bilo kakve razlike između tretmana kvercetinom i rutinom u odnosu na kontrolne TgAPP miševe.

U panelu biokemijskih značajki AD koje treba analizirati, prvenstveno smo se usredotočili na određivanje omjera GSH/GSSG na bilo kojoj od dvije flavonoidne dijete, budući da smanjenje razine GSH predstavlja jedan od najvažnijih ranih biokemijskih markera u AD [16,17]. ] i uočen je tijekom njegove patogeneze i napredovanja bolesti. Mjerenje razine GSH u mozgu [18] i, u novije vrijeme, razine GSH u krvi [19] obećavaju kao dijagnostički markeri za rane faze AD. Štoviše, uloženi su napori da se nadopune endogene zalihe GSH samim sobom ili njihovim prekursorima [20-22]. U našoj studiji opaženo je smanjenje stanične redukcijske moći (GSH/GSSG) kod TgAPP miševa u odnosu na WT životinje, i kod mužjaka i kod ženki, i u oba područja mozga. U korteksu i hipokampusu WT i TgAPP miševa, omjer GSH/GSSG bio je niži u mužjaka nego u ženki. Prehrana kvercetinom i rutinom značajno je povećala omjer GSH/GSSG u usporedbi s netretiranim TgAPP miševima, a to je povećanje bilo izraženije u hipokampusu. Promjene u razinama GSH i GSSG i omjeru GSH/GSSG nakon tretmana kvercetinom ili rutinom muškaraca, u pogledu povećanja redoks snage, bile su izraženije nego kod žena. Rezultati naših određivanja mogu otkriti važnu osnovu koja leži u podlozi spolno povezanih razlika kod Tg2576 miševa u osjetljivosti na oksidativno oštećenje makromolekula s jedne strane, budući da je glutationski sustav svestrani reduktor u višestrukim biološkim funkcijama, te u utjecaju preventivnih flavonoidne dijete u vraćanju njegovog fiziološkog statusa s druge strane. Kao što ćemo vidjeti kroz ovu raspravu, postavili smo povećanje omjera GSH/GSSG kao glavnu os koja bi mogla objasniti niz učinaka opaženih kod TgAPP miševa.

Nedavno je predloženo da bi omjer GSH/GSSG, umjesto da jednostavno funkcionira kao redoks pufer, djelovao kao glavni regulatorni mehanizam, dopuštajući proteinima da postignu svoju nativnu konformaciju i funkcionalnost čvrstom kontrolom tiol-disulfidne ravnoteže u stanici. proteom. Ukratko, glutationski sustav je bitan za očuvanje zdravog proteoma, pokazujući da poremećaj redoks homeostaze glutationa (tj. genetski ili farmakološki) povećava agregaciju proteina zbog poremećaja u učinkovitosti autofagije [23]. Stoga, strategije usmjerene na održavanje redoks homeostaze glutationa mogu imati terapeutski potencijal u bolestima povezanim s agregacijom proteina, kao što je AD. Usko povezan s očuvanjem proteoma je mehanizam razgradnje ubikvitin-proteasom, koji je uključen u patogenezu AD-a. Proteasom selektivno razgrađuje višestruke supstrate koji su ključni u održavanju neuronske homeostaze, uključujući katabolizam oksidiranih i agregiranih proteina. BACE1 se podvrgava sveprisutnosti, a pokazalo se da će blokiranje puta ubikvitin-proteasom inhibirati razgradnju BACE1 i posljedično dovesti do povećane proizvodnje enzimske aktivnosti BACE1, više produkta cijepanja C99 i povećanja A 1-40 i A { {8}} u neuronskim i ne-neuronskim stanicama [10]. Naše prethodne studije su otkrile da i flavonoidi, kvercetin i rutin, utječu na različite signalne putove i molekularne mreže povezane s modulacijom funkcije proteasoma u stanicama neuroblastoma [9]. Osim toga, pokazalo se da su neuroni kojima je dodan reducirani glutation (GSH) obnovili aktivnost proteasoma i smanjili stvaranje agregata [11] budući da je funkcija proteasoma regulirana redoks statusom [24]. Stoga je povećanje omjera GSH/GSSG koje su iskusile životinje nakon prehrane kvercetinom ili rutinom u skladu s modulacijom proteasoma kvercetinom i rutinom, što je prethodno dokazano ex vivo.

Kao što je prethodno spomenuto, redoks neravnoteža dovodi do visoko oksidativno modificiranih proteina koji imaju tendenciju nakupljanja i stvaranja agregata što rezultira oštećenjem proteasoma [25]. Stoga, s obzirom na ključnu ulogu oksidativnog stresa u patogenezi AD, biomarkeri oksidativnog stresa, uključujući peroksidaciju lipida (razine MDA) i antioksidativne enzime, procijenjeni su u korteksu i hipokampusu kod TgAPP i WT miševa. SOD, CAT, GR i GPx najvažniji su antioksidativni enzimi koji djeluju protiv slobodnih radikala kisika i reguliraju metabolizam slobodnih radikala u tijelu te igraju ulogu u sustavu hvatanja slobodnih radikala, štiteći stanice u tijelu od peroksidacije lipida. . U našem istraživanju, kao posljedica prekomjerne ekspresije APP-a, opaženo je generalizirano smanjenje aktivnosti antioksidativnih enzima u TgAPP miševa u usporedbi s WT miševima, što je statistički značajno za CAT. U skladu sa smanjenim razinama GSH, lipidna peroksidacija je značajno povećana u TgAPP miševa. Dok je izvor oksidativnog stresa kod AD kod ljudi vrlo složen i multifaktorijalan, čini se da je amiloidna patologija razvijena u miševa dovoljna za pokretanje patološkog procesa koji dovodi do povećanog oksidativnog stresa u mozgu [26]. Životinje liječene rutinom doživjele su povećanje CAT aktivnosti u korteksu i GR aktivnosti u hipokampusu, i kod mužjaka i kod ženki. Samo su životinje liječene rutinom doživjele promjene u ekspresiji gena CAT i GR u korteksu i hipokampusu kod mužjaka i ženki te GPx u hipokampusu ženki miša. U tom kontekstu, pokazalo se da nekoliko prirodnih spojeva utječe na preslušavanje između proteasoma i redoks regulacije. Točnije, kvercetin je poznati aktivator Nrf2 [27] koji pokazuje antioksidativna svojstva kroz stimulaciju funkcije proteasoma, promičući povećanu otpornost na oksidativni stres i dajući poboljšanu dugovječnost stanica [28].

Tkivno specifična ekspresija BACE1 kritična je za normalnu obradu APP-a, a njegova disregulirana ekspresija može igrati ulogu u patogenezi AD. BACE1 se pretežno eksprimira u neuronima hipokampusa, korteksu i granularnom sloju malog mozga [10]. Treba napomenuti da su ranije studije pokazale da su švedski mutirani APP transgeni miševi imali značajno povećane razine A u mozgu u stabilnom stanju [29], što sugerira da BACE1 igra ključnu ulogu u amiloidogenom putu u patogenezi AD i da je dobra terapeutska meta za liječenje AD-a. U našem smo istraživanju primijetili značajno smanjenje aktivnosti BACE1 nakon tretmana kvercetinom i rutinom, što bi moglo pridonijeti smanjenju taloženja A u miševa. Tvrdimo da više nego samo djelovanje kao BACE1 inhibitori enzima, kvercetin i rutin mogu izazvati smanjenje aktivnosti BACE1 povezano s povećanjem omjera GSH/GSSG, na temelju hipoteze o poboljšanju oporavka aktivnosti proteasoma. U tom smislu, poznato je da se ciljanje BACE1 inhibitora na mjesto cijepanja APPswe (švedska mutacija) događa prije nego što dosegne plazma membranu, dok se APPwt (divlji tip) obrađuje u ranom endosomu koji potječe na površini stanice. Stoga je BACE1 koji cijepa APPwt ponekad vezan za inhibitor BACE1 na površini stanice prije obrade APP-a, međutim, enzim koji procesira APPswe nije [30]. Iz tog razloga nenormalna lokalizacija APPswe obrade može značajno smanjiti snagu kvercetina i rutina kao BACE1 inhibitora. Stoga smo skloniji podržati tvrdnju da smanjenje aktivnosti BACE u ovom in vivo modelu nije toliko posljedica inhibicije enzima već povećanja omjera GSH/GSSG. U svakom slučaju, smanjena aktivnost BACE1 mogla bi se protumačiti kao navodni pokušaj smanjenja proizvodnje -amiloida u TgAPP miševa. Što se tiče najznačajnijeg učinka kvercetina i rutina u hipokampusu na slabljenje aktivnosti BACE1, vrijedno je napomenuti da korteks ima znatno veću gustoću neurona od hipokampusa [31], a selektivno oštećenje proteasoma u patološkom fenotipu AD čini korteks ranjiviji i pogođeniji od hipokampusa [32].

Nakon utvrđivanja učinka tretmana na aktivnost enzima BACE1, zanimalo nas je procijeniti njegovu ekspresiju. Zanimljivo je da nisu pronađene značajne razlike u ekspresiji BACE1 između TgAPP miševa u usporedbi s WT miševima, a nisu primijećene nikakve primjetne promjene kod liječenja kvercetinom ili rutinom. Stoga se čini da povećanje aktivnosti enzima BACE1 nije povezano s povećanjem ekspresije. U ovom kontekstu, značajno je da su Apelt et al. [14] pronašli su povećanje kortikalne aktivnosti BACE1 u Tg2576 miševa u dobi između 9 i 13 mjeseci, dok se razina ekspresije BACE1 proteina i mRNA nije mijenjala s dobi. Nadalje, pronađeni su dokazi koji potvrđuju da fibrilarni amiloid A 1-42., umjesto topljivog amiloida A 1-42, može pojačati ekspresiju proteina BACE1, pa stoga male modifikacije u omjeru izoformi amiloida mogu modulirati konformacije amiloidnih agregata i oštećenje stanica [ 33]. Prema tome, odsutnost promjene u ekspresiji BACE1 nakon povećanja njegove aktivnosti koju smo otkrili može objasniti prevalenciju topljivog amiloida A 1-42 nad izoformom fibrilarnog amiloida A 1-42 u našem mišjem modelu TgAPP.

Nakon određivanja ekspresije gena enzima uključenih u procesiranje APP-a, procijenili smo učinak kvercetina i rutina na enzim -sekretazu uključenu u neamiloidogenu obradu APP-a. Usredotočili smo se na ADAM10 jer je to fiziološki najvažnija konstitutivna izoforma -sekretaze. ADAM10 sprječava stvaranje neurotoksičnih oligomernih A plakova putem cijepanja APP unutar A domene kako bi se proizveli sAPP i C-terminalni fragmenti (-CTF) [34,35]. Iako promjene u ekspresiji ADAM10 pronađene u našem istraživanju nisu bile statistički značajne, blago smanjenje ekspresije ADAM10 primijećeno je kod TgAPP miševa u odnosu na WT miševe. Uglavnom, tretman rutinom pokazao je tendenciju povećanja ekspresije gena ADAM10 u oba područja mozga koja su bila predmet istraživanja. Postina i sur. [36] pokazalo je da pojačana regulacija divljeg tipa ADAM10 u hipokampusu AD mišjeg modela posreduje izlučivanje sAPP, što dovodi do inhibicije stvaranja A plakova. Učinak kvercetina proučavan je na modelu AD štakora izazvanog aluminijevim kloridom pokazujući značajno pojačanje -sekretaze (ADAM10 i ADAM17) u hipokampusu u usporedbi s netretiranim. To ukazuje da kvercetin ima potencijal povećati neamiloidogeni put kroz aktivaciju gena -sekretaze [37]. Pretklinički podaci potvrđuju hipotezu da je povećanje razine sAPP u mozgu potencijalna strategija za poboljšanje simptoma povezanih s AD-om i ublažavanje sinaptičkih nedostataka. ADAM10 i BACE1 natječu se za cijepanje APP-a, stoga pojačavanje aktivnosti ADAM10 može inhibirati stvaranje neurotoksičnog amiloida. Štoviše, sAPP može spriječiti aktivaciju JNK-signalnog puta stresa, što dovodi do aktivacije aktivnosti fosforilacije izazvane NF-κB, što dovodi do degradacije proteasoma [38]. Stoga je stvaranje i nakupljanje proteinskih agregata povezanih s bolešću značajno smanjeno, a aktivnost staničnih proteasoma je pojačana, čime se pružaju dokazi o funkciji sAPP u regulaciji proteostaze [39]. Nadalje, dokazano je da sAPP posebno pojačava sintezu glutamat AMPA receptora i njegov promet [40]. U našoj smo studiji istražili ima li blagi porast ekspresije ADAM10 nakon tretmana rutinom neki utjecaj na glutamatergički sinaptički prijenos. Kao što je prikazano u odjeljku s dodatnim podacima, nikakvi značajni učinci na ekspresiju ovog ionotropnog receptora nisu primijećeni na kvercetinskoj i rutinskoj dijeti, možda zbog slabog povećanja ekspresije ADAM10, što nije dovoljno za regulaciju AMPA receptora (dodatni podaci , Slika S2 i Tablica S5).

Treba uzeti u obzir da su in vitro studije pokazale veliki izbor supstrata ADAM10 [41], pa se stoga neželjeni učinci dobiveni nespecifičnim ciljanjem na ADAM10- mogu naći u proliferaciji raka, adheziji stanica, promociji prekursora T stanica/NK stanica i upale itd. [42]. Kako bi se zaobišlo ovo ograničenje, naša studija predlaže strategiju usmjerenu na promicanje otpuštanja sAPP-a na fiziološki način. Ovaj pristup bi se mogao temeljiti na dugotrajnom unosu aktivnog sastojka (kvercetina ili rutina), koji se konzumira zdravom ljudskom prehranom. Međutim, potrebna su daljnja istraživanja kako bi se otkrilo je li povećanje ADAM10 ovisno o dozi flavonoida i nadmašuju li potencijalni korisni učinci nad navodnim nuspojavama.

Što se tiče ekspresije APPswe, iako umetanje ljudskog APP transgena u mišji genom jamči da je APPswe prekomjerno izražen od rođenja, objavljeno je da razine APP mRNA i proteina u hipokampu pokazuju značajne fluktuacije tijekom razvoja životinja, maksimalne kada su miševi asimptomatska (starost od 1- mjeseci) i smanjuje se kada se pojavi potpuna simptomatologija [43]. Bez obzira na ovaj problem, ekspresija APP-a u korteksu i hipokampusu bila je znatno viša u usporedbi s ekspresijom WT miševa u našoj studiji. Daljnji tretman kvercetinom ili rutinom uspio je značajno smanjiti takvu ekspresiju i za mužjake i za ženke miševa, u oba područja mozga. Ovi su nalazi u skladu s onima koje su objavili Augustin i sur. [44] koji su proučavali standardizirani ekstrakt Ginkgo bilobe (Egb761), bogat flavonolima kao što je kvercetin, u 4-mjesečnih ženki TgAPP miševa, pronalazeći smanjene razine APP mRNA i proteina. Uzimajući u obzir da se regulacija translacije APP-a u Tg2576 miševa događa u prodromalnom i ranom simptomatskom stadiju [45], vjerojatno je da se obnova translacije APP kvercetinom ili rutinom mogla dogoditi u našim TgAPP miševima i, vjerojatno, u ranoj fazi simptomatski stadij, što rezultira smanjenjem kortikalne i hipokampalne razine APP, aktivnosti BACE1 i aktivacije kaspaze-3.

Nadalje, drugdje je objavljeno da kod Tg2576 miševa (u odsutnosti gubitka neurona) dolazi do povećanja aktivacije kaspaze-3 u hipokampusu [46], kao što je utvrđeno u našoj studiji, na početku oštećenja pamćenja , zajedno sa smanjenjem dendritičnih bodlji prije taloženja izvanstaničnog amiloida [46]. Postoje dokazi koji podupiru neapoptotičku ulogu kaspaza u živčanom sustavu bez smrti neurona [47], a aktivnost kaspaze-3 je lokalizirana na dendritične bodlje gdje može povisiti razine kalcineurina. Zauzvrat, smatra se da defosforilacija GluR1 podjedinice AMPA-sličnih receptora, potaknuta kalcineurinom, dovodi do postsinaptičke disfunkcije. Naše vrijednosti ekspresije kaspaze-3, kao posljedice transgeneze, u skladu su s onima koje su dobili drugi istraživači koji su prijavili povećanje ekspresije kaspaze-3 na razini dendritičnih bodlji u hipokampusu TgAPP miševa [48]. Budući da APP sadrži tri različita mjesta cijepanja za kaspazu-3 u svojoj aminokiselinskoj sekvenci, od kojih su dva smještena na razini izvanstanične domene, a jedno u intracelularnom C-terminalnom dijelu repa APP [49], hidroliza APP pomoću kaspaze-3 može promijeniti proteolitičku obradu APP-a u korist amiloidogenog puta [50], što dovodi do oslobađanja citotoksičnog peptida izvedenog s C-terminala duljine 31 aminokiseline (C31), za primjer [51]. To sugerira da, budući da kaspaza-3 može posredovati u pojačavanju otpuštanja toksičnih fragmenata iz APP-a, smanjenje ekspresije kaspaze-3 kvercetinom ili rutinom može omogućiti uklanjanje agregiranog proteina. Osim toga, kao što je ranije spomenuto, istražili smo utjecaj i povećanja i smanjenja ekspresije kaspaze-3 u glutamatergičkoj sinaptičkoj transmisiji, na temelju sposobnosti kaspaze-3 aktivirane kalcineurinom da defosforilira podjedinicu GluR1 AMPA receptora na postsinaptičkoj razini. Ove molekularne modifikacije mijenjaju glutamatergičku sinaptičku transmisiju i neuronsku plastičnost na razini dendritičnih bodlji u hipokampusu [48]. Teoretski, farmakološka inhibicija aktivnosti kaspaze-3 u TgAPP miševa mogla bi spasiti fenotipove slične AD-u od mehanizma koji pokreće sinaptički neuspjeh. Međutim, unatoč povećanju ekspresije kaspaze-3 u našem TgAPP mišu, nismo pronašli značajne razlike u ekspresiji AMPA receptora u usporedbi s ekspresijom WT miševa, kao što je ranije spomenuto. Moguće je da promjene u ekspresiji kaspaze-3 nisu dovoljno istaknute da proizvedu značajne modifikacije u ekspresiji AMPA receptora (dodatni podaci, slika S2 i tablica S5).

Što se tiče vrijednosti ekspresije kaspaze-6, nisu pronađene značajne razlike između TgAPP i WT miševa. Aktivacija kaspaze-6 identificirana je kao važan posrednik neuronskog stresa koji cijepa važne citoskeletne proteine ​​(Tau i -tubulin), na taj način ometajući ubikvitin-proteasomsku degradaciju pogrešno savijenih proteina i nekoliko postsinaptičkih gustoća koje reguliraju aktin bjelančevine [52]. Nepromijenjena ekspresija kaspaze -6 u našoj studiji slaže se s odsutnošću karakterističnih znakova neurodegeneracije u dobi u kojoj su ti transgeni miševi procijenjeni, u usporedbi s WT miševima (dodatni podaci, slika S1).

Uočen je značajan porast neuroupalnih medijatora u pacijenata s AD-om, uglavnom oko senilnih plakova [53-55]. Astrociti su glavni dobavljač GSH mikroglije i neurona. Tijekom kronične upale i oksidativnog stresa, astrociti otpuštaju toksične upalne medijatore i slobodne radikale, ubrzavajući aktivaciju mikroglije i neurodegeneraciju [56]. Vrijedno je napomenuti da je smanjen intracelularni glutation povezan s aktivacijom upalnih puteva, p38 MAP-kinaze, Jun-N-terminalne kinaze (JNK), NF-κB, u ljudskoj mikrogliji i astrocitima [57]. U tom smislu, odlučili smo kvantificirati razine IL-1, IFN- i TNF- u našem životinjskom modelu i odrediti učinak kvercetina i rutina na njih. Kao što je poznato, upala potiče neispravnu obradu peptida A i APP, potičući agregaciju peptida A i zauzvrat modificirajući reaktivnost A [58]. Stoga smo u našoj studiji primijetili da TgAPP miševi imaju povećane razine mRNA proupalnih medijatora IL-1, TNF- i IFN-, u usporedbi s WT miševima, pokazujući da prekomjerna ekspresija APPswe može inducirati neuroupalne kaskade pokrećući niz molekularnih puteva u gliji i neuronima, koji bi aktivirali upalni odgovor. Kvercetin i rutin uspjeli su oslabiti ekspresiju gena IL-1 i kod muškaraca i kod žena te u proučavanim područjima mozga. Nekoliko dokaza podupire protuupalni učinak kvercetina na razini središnjeg živčanog sustava, budući da može inhibirati aktivaciju transkripcijskih čimbenika kao što je nuklearni faktor-kappa B (NF-κB) [59], uključen u indukciju iNOS-a, i stoga smanjite otpuštanje medijatora kao što su IL-1, TNF- i IFN- [60]. Što se tiče utjecaja GSH na upalni odgovor, treba napomenuti da je GSH uključen u održavanje optimalne razine citokina na takav način da ekspresija proupalnih citokina (TNF-, IL-1 i IL -6) povećani su zbog smanjenja GSH, dok je ekspresija protuupalnih citokina (tj. IL-10) ostala nepromijenjena. Ova promjena homeostaze GSH događa se zbog pojačane regulacije u NF-κB i JNK signalnim putovima koji bi mogli biti izvedivi apoptotski put prema smrti neuronskih stanica [61]. U našoj studiji, regulacija NF-κB kvercetinom i rutinom mogla bi biti vjerojatan mehanizam za oporavak GSH/GSSG homeostaze i stoga uzrok ravnoteže između proupalnih i protuupalnih citokina. Na kraju, budući da promotor BACE1 ima mjesto vezivanja NF-κB, aktivacija NF-κB izazvana upalom olakšava regulaciju ekspresije BACE1, a zatim povećava proizvodnju A [62]. Prema tome, ako dođe do regulacije NF-κB tijekom dijete s kvercetinom i rutinom, aktivnost BACE1 bi se smanjila kao rezultat regulacije otpuštanja proupalnih, a ne protuupalnih citokina.

4. Materijal i metode

4.1. Pokusne životinje

Transgeni miš (Tg2576, B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) koji izražava švedsku dvostruku mutaciju ljudskog amiloidnog prekursorskog proteina (hAPP) korišten je kao životinjski model eksperimentalne AD [14]. Miš je knock-in heterozigotna linija koja eksprimira ljudski izoform A PP695 s dvostrukom švedskom mutacijom (K670N/M671L; Lys670→Asn i Met671→Leu) pod kontrolom promotora prionskog proteina hrčka [63]. Kao rezultat toga, ovaj miš pokazuje razine ljudskog amiloidnog prekursora proteina (A PP), šest puta veće od razine A PP kod miševa. Osim toga, ovaj miš pokazuje više razine A 40 i A 42. Naslage A počinju u dobi od 9 mjeseci [63]. U hipokampusu i korteksu Tg2576 ekspresija transgena APPswe primarno je neuronska [64].

Kao negativna kontrola korišteni su miševi divljeg tipa (WT) iz iste kolonije [65,66]. Kolonija miša Tg2576 (B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) razvijena je u našem laboratoriju od Tg2576 heterozigotnih mužjaka i ženki divljeg tipa. Transgene roditelje donirala je dr. Diana Frechilla iz Odjela za neuroznanost u Centru za primijenjena medicinska istraživanja na Sveučilištu Navarra (Pamplona, ​​Španjolska) [67].

Životinje su bile smještene u pojedinačno ventiliranim kavezima i držane na 22-24 ◦C u ciklusu 12-h svjetlo/tama uz 50-60 posto vlažnosti. Protokole za životinje odobrio je Institucionalni odbor za skrb i korištenje životinja (IACUC) pri Sveučilištu Complutense u Madridu i bili su u potpunosti u skladu s Europskom direktivom 2010/63/o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe i španjolskim zakonodavstvom o dobrobiti životinja ( Kraljevski dekret 53/2013, 1. veljače 2013.).

4.2. Analize genotipizacije miševa

Transgenost je određena unutar 30 dana od rođenja biopsijom repa. Genotipske analize životinja provedene su PCR metodom. S obzirom da je Tg2576 (TgAPP) heterozigotna linija, kao pozitivna reakcija reakcije korišten je insercijski gen (PrP, iz prionskog proteina). Genomska DNA ekstrahirana je iz mišjih repova digestiranih proteinazom K (0.1 µg/µL) u NID puferu (50 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM MgCl2, 0,05 posto želatine, 0,45 posto NP-40 i 0,4 posto Tween 20) na 56 ◦C tijekom 3 sata i protreseno. DNA fragmenti su istaloženi izopropanolom i isprani 70 postotnim etanolom. DNA precipitati su otopljeni u 30 µL TE pufera (10 mM Tris-1 mM EDTA). Čistoća i koncentracija DNA određene su na 260 i 280 nm.

PrP i APP geni umnoženi su PCR-om. Sekvence početnica korištenih za pregled transgenih miševa bile su sljedeće: PrP naprijed: CCTCTTTGTGACTATGTGGACTGATGTCGG; PrP revers: GTGGATACCCCCCCCCCCCAGCCTAGACC; APP naličje: CCAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATG. Koraci PCR reakcije bili su sljedeći: denaturacija na 94 ◦C tijekom 90 s, 39 ciklusa na 60 ◦C tijekom 60 s i 72 ◦C tijekom 90 s, zatim konačna ekstenzija na 72 ◦C tijekom 7 minuta.

U svim su slučajevima uzete u obzir negativne kontrole (bez DNA plijesni) i pozitivne kontrole gena APP. Dobiveni PCR produkti odvojeni su elektroforezom u 1,5 postotnom agaroznom gelu u 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA, Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka) puferu na 70 V (konstantni napon) i zatim snimljeni bojenjem s GelRed (Millipore).

4.3. Liječenje životinja

TgAPP miševi i divlji tip legla, oboje stari 6-7 tjedana s početnom tjelesnom težinom od 16,2 ± 0,8 g, randomizirani su u sljedeće četiri skupine (n=8/skupina): ( a) Neliječeni TgAPP; (b) TgAPP tretiran kvercetinom; (c) TgAPP tretiran rutinom; i (d) netretiranog divljeg tipa. Budući da su proučavani i mužjaci i ženke miševa, uspostavljene su dvije grupe. U dobi od 45 tjedana, miševi su počeli dobivati ​​kvercetin ili rutin tijekom 4 tjedna.

Kvercetin (3,30,40,5,7-pentahidroksiflavon) i rutin hidrat (kvercetin-3-O-rutinozid hidrat) imali su veću ili jednaku čistoću od 95 posto i kupljeni od Sigma–Aldricha. Svaki od flavonoida uključen je u standardnu ​​prehranu (Harlan Ibérica, Barcelona, ​​Španjolska) u koncentraciji od 200 ppm, što odgovara unosu od 30 mg flavonoida/kg tjelesne težine/dan. Netretirani miševi primali su isključivo standardnu ​​prehranu bez suplemenata. Dijeta i voda bili su osigurani za unos ad libitum.

4.4. Priprema moždanog tkiva za biokemijske i histološke pretrage

Na kraju tretmana, miševi su izgladnjeli preko noći, eutanazirani su korištenjem cervikalne dislokacije, a cijeli mozak je brzo uklonjen. Mozak je ispran fiziološkom otopinom na 4 ◦C i pažljivo je uklonjena arahnoidna membrana. Zatim su izolirani hipokampus i korteks. Uzorci su odmah pohranjeni na -80 ◦C do daljnje uporabe.

Cjelokupni mozgovi nekih životinja korišteni su za dobivanje histoloških presjeka, za koje su, nakon eutanazije korištenjem cervikalne dislokacije, mozgovi zamrznuti uranjanjem u izopentan na -80 ◦C. Odmah nakon toga napravljeni su koronalni presjeci mozga (debljine 30 µm) od olfaktornog bulbusa do malog mozga, međusobno razmaknuti 120 µm u kriostatu (Leica CM1850, Nussloch, Njemačka). Cijeli postupak je izveden na -20 ◦C. Histološki isječci sakupljeni su na stakalcima i držani na -80 ◦C do analize (vidi Dopunske metode).

4.5. Glutation

Za testove glutationa, uzorci cerebralnog korteksa i hipokampusa homogenizirani su u puferu za gašenje redoks -5 posto triklorid octene kiseline (RQB-5 posto TCA) (prethodno propuhan s N2 15 minuta na ledu) pri koncentraciji od 25 mg/mL (w/v). Uzorci su resuspendirani ultrazvukom tijekom 10 sekundi, zatim centrifugirani na 12,000× g tijekom 10 minuta na 4 ◦C, a supernatanti su sakupljeni.

Zatim su u dobivenom supernatantu usvojene spektrofluorometrijske metode za određivanje razina GSH i GSSG koristeći o-ftalaldehidnu metodu, koju su opisali Senft i sur. [68]. Vrijednosti GSH i GSSG korigirane su za spontanu reakciju u odsutnosti biološkog uzorka. U oba slučaja, supernatanti su inkubirani 30 minuta na sobnoj temperaturi i nakon toga je mjerena fluorescencija pomoću čitača mikropločica FLUOSTAR (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Njemačka), s ekscitacijskim filtrom postavljenim na 360 nm (propusnost 5 nm) a emisijski filtar postavljen na 460 nm (propusnost 5 nm). Koncentracija GSH i GSSG u svakom uzorku je interpolirana iz poznatih GSH standarda. Koncentracije i GSH i GSSG izražene su kao nmol GSH/mg proteina, što je omogućilo izračun redoks omjera glutationa GSH/GSSG.

Preostale pelete su vorteksirane dok se potpuno ne otope u 240 µL 0,1 M NaOH da se izmjeri koncentracija proteina metodom bicinhoninske kiseline (BCA), koristeći goveđi serumski albumin kao standard.

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】