Zerumbone, seskviterpen tropskog đumbira iz Zingiber officinale Roscoe, smanjuje -MSH-induciranu melanogenezu u stanicama B16F10 1. dio

Sažetak:Pokazalo se da Zerumbone (ZER), aktivni sastojak obitelji Zingiberaceae, pokazuje nekoliko bioloških aktivnosti, poput protuupalnih, antialergijskih, antimikrobnih i antikancerogenih; međutim, nisu proučavana njegova antimelanogena svojstva. U ovoj studiji demonstriramo da su ZER i Zingiber oficinalni (ZO) ekstrakti koji značajno smanjuju nakupljanje melanina u mišjim melanogenim B16F10 stanicama stimuliranim hormonom koji stimulira melanocite (-MSH). Nadalje, kako bismo razjasnili molekularni mehanizam kojim ZER suzbija nakupljanje melanina, analizirali smo ekspresiju transkripcijskog faktora povezanog s melanogenezom, transkripcijski faktor povezan s mikroftalmijom (MITF), i njegove ciljne gene, kao što je tirozinaza, protein 1 povezan s tirozinazom ( TYRP1) i proteina 2 povezanog s tirozinazom (TYRP2), u stanicama B16F10 koje su stimulirane s -MSH. Ovdje smo otkrili da ZER inhibira MITF-posredovanu ekspresiju melanogenih gena nakon -MSH stimulacije. Dodatno, stanice tretirane različitim koncentracijama zerumbona i ZO pokazale su povećanu fosforilaciju kinaza 1 i 2 (ERK1/2) reguliranih izvanstaničnim signalom, koje su uključene u mehanizam razgradnje MITF-a. Farmakološka inhibicija ERK1/2 korištenjem U0126 dovoljno je poništila antimelanogeni učinak ZER-a, što sugerira da je povećana fosforilacija ERK1/2 potrebna za njegovu antimelanogenu aktivnost. Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da se ekstrakti ZER i ZO mogu koristiti kao aktivni sastojci u kozmetičkim proizvodima za izbjeljivanje kože zbog njihovog antimelanogenog učinka.

Prema relevantnim studijama, cistanča je uobičajena biljka koja je poznata kao "čudotvorna biljka koja produžuje život". Njegova glavna komponenta jecistanozid, koji ima različite učinke kao nprantioksidans,protuupalnoi promicanje imunološke funkcije. Mehanizam izmeđucistancheiizbjeljivanje koželeži u antioksidativnom učinku cistanheglikozidi. Melanin u ljudskoj koži nastaje oksidacijom tirozina koju kataliziratirozinaza, a reakcija oksidacije zahtijeva sudjelovanje kisika, pa radikali bez kisika u tijelu postaju važan čimbenik koji utječe na proizvodnju melanina. Cistanche sadrži cistanozid, koji je antioksidans i može smanjiti stvaranje slobodnih radikala u tijelu, stogainhibiranje proizvodnje melanina.

Kliknite na Kako koristiti Cistanche

Za više informacija:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Ključne riječi:cerumbone; Zingiber officinal Roscoe; melanogeneza; MITF; ERK1/2

1. Uvod

Melanogeneza, proizvodnja melanina od strane epidermalnih melanocita, stimulirana je hormonom koji stimulira melanocite (-MSH) koji se luči iz keratinocita nakon izlaganja ultraljubičastom (UV) zračenju [1,2]. Faktor matičnih stanica (SCF) još je jedan melanogeni čimbenik koji strogo kontrolira migraciju, proliferaciju i diferencijaciju melanocita za održavanje postnatalne kožne melanogeneze [3]. Transkripcijski faktor povezan s mikroftalmijom (MITF), koji je melanogeni transkripcijski faktor, aktivira se preko cAMP-PKA-CREB (vezujući protein odgovornog elementa cikličke adenozin monofosfat-protein kinaze A-cAMP) signalnog puta nakon -MSH stimulacije preko melanokortin 1 receptora (MC1R) u citoplazmatskim membranama epidermalnih melanocita [4]. Poznato je da nekoliko kemikalija, kao što su forskolin i IBMX (3-izobutil-1-metilksantin), aktiviraju signalni put cAMP-PKA-CREB, što dovodi do indukcije melanogeneze [5]. Nekoliko je studija otkrilo da kontinuirana aktivacija izvanstanično reguliranih kinaza 1 i 2 (ERK1/2), koja je uključena u molekularni mehanizam onkogeneze, potiče fosforilaciju MITF-a na Ser73 i njegovu naknadnu razgradnju putem proteolize ovisne o ubikvitinu [6,7]. ]. Doista, zabilježeno je da U0126, selektivni inhibitor puta ERK1/2, povećava ekspresiju MITF-a i aktivnost tirozinaze, što dovodi do proizvodnje melanina [6]. Stabilizirani i aktivirani MITF povećava ekspresiju melanogenih gena, poput tirozinaze, proteina 1 (TYRP1) i proteina 2 (TYRP2) povezanog s tirozinazom. Transformaciju tirozina u 3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA), što je početni korak melanogeneze, katalizira tirozinaza. Proteini povezani s tirozinazom (TRP) kataliziraju daljnje reakcije oksidacije i tautomerizacije [8]. Nakon sinteze melanina, zreli melanin se transportira iz epidermalnih melanocita u citoplazmu bazalnih keratinocita radi zaštite stanica od UV zračenja [2].

Abnormalno povećana melanogeneza uzrokuje više vrsta kožnih poremećaja, kao što su rak kože, kloazma i pjege [4]; stoga su male molekule ili prirodni proizvodi koji ciljaju ili na katalitičku aktivnost tirozinaze ili regulatore signalnih putova u melanogenezi, uključujući ERK1/2 ili MITF-posredovanu transkripciju melanogenih gena, identificirani kao aktivni sastojci koji se mogu iskoristiti u kozmetici industrija. Nekoliko malih molekula, poput kojične kiseline, arbutina i niacinamida, naširoko se koriste kao kozmetički sastojci zbog svojih antimelanogenih aktivnosti. Međutim, izvješća su pokazala da kojična kiselina uzrokuje višestruke nuspojave, uključujući citotoksičnost, dermatitis, rak kože i hepatocelularni karcinom, zbog svoje genotoksične aktivnosti [9]. Iako se arbutin koji je izoliran iz biljke medvjetke koristio za liječenje poremećaja hiperpigmentacije, nedavno je njegova upotreba kao kozmetičkog sastojka ograničena zbog nekoliko nuspojava [9]. Zabilježeno je da niacinamid ima antimelanogeno djelovanje, a to se djelovanje odvija inhibicijom prijenosa melanosoma iz melanocita u okolne keratinocite [10]. Stoga se općenito koristi kao spoj za izbjeljivanje kože u kozmetičkoj industriji. Kako bi se prevladala ograničenja utvrđenih sredstava za izbjeljivanje kože koja imaju nekoliko nuspojava, važno je razviti sigurne sastojke za izbjeljivanje kože dobivene iz prirodnih izvora. Na primjer, -tujaplicin, linderanolid B, 4-butil resorcinol i plumbagin identificirani su kao antimelanogeni spojevi zbog svojih inhibicijskih učinaka na tirozinazu [4,11]. Nobiletin, withaferin A, sesamol i chaetocin pokazuju antimelanogena svojstva modulirajući signalne intermedijere u putu melanogeneze [11].

Zerumbone (ZER) je prirodni proizvod koji je izoliran iz hlapljivih eteričnih ulja biljaka iz obitelji Zingiberaceae, kao što su Zingiber zerumbet Smith i Zingiber officinal Roscoe [12]. Nekoliko je studija pokazalo da ZER ima širok raspon bioloških aktivnosti, uključujući antimikrobna, antioksidativna, antidijabetička, antikancerogena, protuupalna, antialergijska i antiangiogena aktivnost [12]. Zanimljivo je da se pokazalo da ZER ima zaštitni učinak protiv oksidativnog oštećenja keratinocita kože izazvanog ultraljubičastim A (UVA) zračenjem, zahvaljujući svojoj sposobnosti uklanjanja reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) putem aktivacije nuklearnog faktora-E{{8} }povezani faktor-2 (Nrf2) [1,13]. To sugerira da se ZER može koristiti kao funkcionalni dodatak u kozmetici za njegu kože. Međutim, detaljan mehanizam antimelanogenih svojstava djelovanja ZER-a tek treba proučavati.

U ovom su istraživanju proučavani inhibicijski učinci ZER-a i ekstrakta Zingiber officinala (ZO) na -MSH-stimuliranu melanogenezu i njihovi temeljni mehanizmi. Ovdje pokazujemo da ZER značajno potiskuje -MSH induciranu melanogenezu pojačavanjem fosforilacije ERK1/2 i inhibicijom ekspresije melanogenih gena posredovane MITF-om.

2. Rezultati

2.1. Zerumbone (ZER) potiskuje -MSH induciranu melanogenezu u stanicama mišjeg melanoma B16F10

Kako bismo proučili antimelanogeni učinak zerumbona (ZER), prvo smo procijenili njegovu citotoksičnost u stanicama B16F10 i HaCaT. Kemijska struktura ZER-a prikazana je na slici 1A. Uočeno je da ZER pri koncentracijama iznad 20 µM pokazuje snažan citotoksični učinak, dok pri koncentracijama ispod 20 µM ZER nije pokazao citotoksičnost u obje stanične linije (Slika 1B). Zatim smo istražili inhibitorne učinke ZER-a na -melanocite stimulirajući hormon (-MSH)-induciranu akumulaciju melanina i izlučivanje u stanicama B16F10. Pokazalo se da ZER snažno suzbija -MSH-induciranu intracelularnu akumulaciju melanina i njegovo izlučivanje u uzgojni medij (Slika 1C, D). Štoviše, otkrili smo da ZER ublažava melanogenezu učinkovitije od 1 mM arbutina ili 0,2 mM kojične kiseline, dobro poznatih aktivnih sastojaka kozmetike za izbjeljivanje kože (Slika 1D). Kako bismo razjasnili je li ZER dovoljan za suzbijanje melanogeneze u ljudskim stanicama, koristili smo stanice ljudskog melanoma G361 koje proizvode melanin. Kao što je prikazano na slici 1E, ZER značajno smanjuje izvanstanični i unutarstanični sadržaj melanina izazvan faktorom matičnih stanica (SCF). Ovi rezultati potvrđuju antimelanogenu aktivnost ZER-a u melanogenim mišjim B16F10 i ljudskim G361 stanicama.

2.2. Zerumbone suzbija ekspresiju gena faktora transkripcije melanogeneze, MITF, i njegovih ciljnih gena u G361 ljudskim stanicama melanoma 

Zabilježeno je da endotelin-1 i SCF signalizacija igraju bitnu ulogu u melanogenezi u ljudskim melanocitima i nekoliko podtipova melanoma [3,14-16]. U ovoj smo studiji otkrili da ZER potiskuje melanogenezu na melanogene podražaje, -MSH i SCF, u mišjim B16F10 i ljudskim stanicama melanoma G361 (Slika 1).

Stoga smo izmjerili promjene u razinama ekspresije gena i proteina povezanih s melanogenezom nakon SCF stimulacije u G361 ljudskim stanicama melanoma. Otkrili smo da ZER smanjuje SCF-induciran MITF i ekspresiju proteina tirozinaze 2-4 sata, odnosno 24-48 sati nakon SCF stimulacije (Slika 2A). Osim toga, genska ekspresija gena povezanih s melanogenezom, kao što su MITF, tirozinaza i protein 1 (TYRP1) je potisnut u G361 stanicama tretiranim ZER-om (Slika 2B, C). Ovi rezultati su otkrili vršno vrijeme za ekspresiju gena povezanih s melanogenezom nakon SCF stimulacije; Maksimalna MITF mRNA indukcija primijećena je unutar 1-2 h, a mRNA razine tirozinaze i TYRP1 dosegle su svoj maksimum 24-48 h nakon SCF stimulacije.

2.3. Zerumbone suzbija ekspresiju melanogenih gena i enzima u mišjim B16F10 stanicama

Kako bismo istražili molekularni mehanizam kojim ZER potiskuje melanogenezu, izmjerili smo ekspresiju gena faktora transkripcije melanogeneze, MITF, i njegovih ciljnih gena, kao što su protein 1 (TYRP1), tirozinaza i protein 2 (TYRP2) povezan s tirozinazom. u nedostatku ili prisustvu ZER. Budući da je vršno vrijeme za ekspresiju gena povezanih s melanogenezom nakon SCF i -MSH stimulacije poznato za ljudske G361 (Slika 2) i mišje B16F10 stanice melanoma [4], dodatno smo izmjerili ekspresiju MITF-a, tirozinaze, TYRP1 i TYRP2 u ZER tretiranim mišjim B16F10 stanicama melanoma nakon 2 h ili 48 h inkubacije s -MSH. Slika 3A pokazuje da je ZER dovoljan da oslabi -MSH-induciran MITF, TYRP1, TYRP2 i ekspresiju tirozinaze u stanicama B16F10. Slično, razine ekspresije proteina MITF, tirozinaze i TYRP2 smanjene su nakon liječenja ZER-om. Fosforilacija CREB-a posredovana protein kinazom A (PKA) glavni je signalni put koji povećava MITF na transkripcijskoj razini nakon stimulacije -MSH [4]. Stoga smo ovdje analizirali može li smanjena fosforilacija CREB-a pomoću ZER-a posredovati u supresiji MITF-a. Otkrili smo da liječenje ZER-om nije utjecalo na -MSH-induciranu CREB fosforilaciju, što sugerira da ZER potiskuje -MSH-induciranu MITF ekspresiju neovisno o osi PKA-CREB signalnog puta (Slika 3B). Budući da je tirozinaza enzim koji ograničava brzinu, koji regulira sintezu melanina [2,4,11], dodatno smo analizirali unutarstanične razine proteina tirozinaze i njezinu enzimsku aktivnost nakon tretmana arbutinom, kojičnom kiselinom i ZER-om. Slika 3C pokazuje da ZER dovoljno smanjuje -MSH-induciranu razinu proteina tirozinaze u stanicama B16F10. Osim toga, slika 3D otkriva da 10 µM ZER učinkovitije suzbija oksidaciju L-DOPA od inhibitora tirozinaze, arbutina i kojične kiseline, što sugerira da je oksidacija L-DOPA u dopakinon kroz enzimatsku aktivnost tirozinaze suprimirana u stanicama tretiranim ZER-om . Ovi rezultati pokazuju da ZER ublažava -MSH-posredovanu melanogenezu supresijom genske ekspresije MITF-a, transkripcijskog faktora povezanog s melanogenezom, i njegovih ciljnih gena.

2.4. Antimelanogeni učinak Zerumbona je kroz fosforilaciju ERK1/2

Poznato je da aktivacija protein kinaze B (AKT) i kinaza reguliranih izvanstaničnim signalom (ERK1/2) čimbenicima rasta ili melanogenim podražajima potiskuje melanogenezu kroz smanjenu ekspresiju MITF-a i njegovih ciljnih gena [11]. Fosforilacija MITF-a na Ser73 i Ser409 kao odgovor na signalni put ERK1/2 potiče njegovu razgradnju ovisnu o proteasomu [17,18]. Stoga smo istražili regulira li ZER fosforilaciju ERK1/2 u B16F10 mišjim i G361 ljudskim stanicama melanoma. Povećana fosforilacija ERK1/2 (p-ERK1/2), ali ne i ukupna ERK1/2 (T-ERK1/2) opažena je nakon liječenja ZER-om ovisno o vremenu i dozi (Slika 4A, B). Zanimljivo je da je uočeno da se fosforilacija ERK1/2 brzo povećava unutar 10-30 minuta i 1-2 sata nakon tretmana ZER-om u mišjim B16F10 i ljudskim G361 stanicama melanoma (Slika 4A). Međutim, fosforilacija AKT i MEK nije uočena nakon liječenja ZER-om, što sugerira da fosforilacija ERK1/2 izazvana ZER-om može potisnuti MITF (Slika 4B). Budući da fosforilacija ERK1/2 potiče fosforilaciju i proteasomalnu degradaciju MITF-a [17,18], istražili smo sprječava li inhibitor proteasoma smanjenje MITF-a pomoću ZER-a. Supresija MITF-a pomoću ZER-a nije primijećena u prisutnosti MG132, što potvrđuje da ZER smanjuje ekspresiju MITF-a putem proteasomalne degradacije (Slika 4C). Zatim smo istražili fosforilira li ZER MITF na Ser73, koji je ciljni ostatak ERK1/2. Da bi se otkrio fosforilirani MITF, stanice su bile izložene -MSH i MG132. Ovdje smo otkrili da je fosforilirani MITF (Ser73) značajno povećan pomoću ZER u prisutnosti -MSH i MG132 (Slika 4D). U0126, selektivni inhibitor protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK) [19], ukinuo je fosforilaciju MITF izazvanu ZER (Slika 4D). Štoviše, ukupne razine MITF proteina u lizatima cijelih stanica (WCL) nisu bile promijenjene ZER i U0126 u prisutnosti MG132 (Slika 4D). Ovi rezultati pokazuju da je ERK1/2-posredovana MITF (Ser73) fosforilacija i proteasomalna degradacija ključni mehanizam u ZER-posredovanoj supresiji MITF-a. Nadalje, slika 4E pokazuje da je U0126 značajno obnovio smanjene razine MITF proteina u stanicama tretiranim ZER-om. Dosljedno, smanjeni unutarstanični sadržaj melanina pomoću ZER-a vraćen je pomoću U0126 na približno 40 posto (Slika 4F), što sugerira da je aktivacija ERK1/2 potrebna za antimelanogeni učinak ZER-a.

2.5. Antimelanogeni učinak ekstrakata Zingiber Offificinale (ZO).

ZER je fitokemikalija dobivena iz nekoliko biljnih vrsta iz obitelji Zingiberaceae, kao što su Zingiber zerumbet i Zingiber officinal [12]. Stoga smo inicijalno mjerili vitalnost stanica u odsutnosti ili prisutnosti ZO ekstrakta u stanicama B16F10 i HaCaT. Slika 5A pokazuje da preživljavanje stanica nije promijenjeno tretmanom ZO ekstraktom. Dodatno smo analizirali antimelanogene učinke ekstrakta Zingiber officinala (ZO). Budući da je ZER smanjio ekspresiju MITF-a i njegovih ciljnih melanogenih gena preko aktiviranog signalnog puta ERK1/2 (slike 2 i 3), provjerili smo potiskuje li ekstrakt ZO-MSH-induciran MITF i ekspresiju njegovih ciljnih melanogenih proteina u stanicama B16F10. Slično antimelanogenom učinku ZER-a, -MSH-inducirani MITF, tirozinaza i TYRP2 značajno su smanjeni ekstraktom ZO na način ovisan o dozi (Slika 5B). Zanimljivo je da je fosforilacija ERK1/2 također povećana u stanicama tretiranim ZO ekstraktom (Slika 5B). Ekspresija MITF-a i njegovih ciljnih gena, kao što su tirozinaza, TYRP1 i TYRP2, značajno je smanjena nakon tretmana s 5 µg/µL ZO ekstrakta (Slika 5C). Štoviše, izvanstanični i unutarstanični sadržaj melanina značajno je smanjen na približno 40 posto nakon tretmana ZO ekstraktom od 5 µg/µL (Slika 5D). Osim toga, opažena je smanjena aktivnost tirozinaze u stanicama koje su tretirane ZO ekstraktom (Slika 5E). Ovi rezultati sugeriraju da ekstrakt Zingiber officinala (ZO) potiskuje melanogenezu slabljenjem ekspresije melanogenog gena posredovane MITF-om.

Za više informacija: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501