Sekvenciranje cijelog genoma za dijagnozu neuroloških poremećaja ponavljajuće ekspanzije u Ujedinjenom Kraljevstvu: retrospektivna dijagnostička točnost i prospektivna studija kliničke validacije

Za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Sažetak

Pozadina

Poremećaji ponavljajuće ekspanzije pogađaju oko 1 od 3000 pojedinaca i klinički su heterogene bolesti uzrokovane ekspanzijama kratkih tandemskih ponavljanja DNA. Genetsko testiranje često je specifično za lokus, što dovodi do nedovoljne dijagnoze kod ljudi koji imaju atipične kliničke slike, posebno kod pedijatrijskih pacijenata bez prethodne pozitivne obiteljske anamneze. Sekvenciranje cijelog genoma sve se više koristi kao test prve linije za druge rijetke genetske poremećaje, a cilj nam je bio procijeniti njegovu učinkovitost u dijagnozi pacijenata sneurološkiponavljanje poremećaja ekspanzije.

metode

Retrospektivno smo procijenili dijagnostičku točnost sekvenciranja cijelog genoma kako bismo otkrili najčešće ponovljene lokuse ekspanzije povezane sneurološkiishode (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT i TBP) koristeći uzorke dobivene unutar Nacionalne zdravstvene službe u Engleskoj od pacijenata za koje se sumnjalo da imajuneurološkiporemećaji; prethodni rezultati PCR testa korišteni su kao referentni standard. Klinička točnost sekvencioniranja cijelog genoma za otkrivanje ponovljenih ekspanzija prospektivno je ispitana na prethodno genetski testiranim i nedijagnosticiranim pacijentima angažiranim 2013. – 2017. za 100 000 Genomes Project u Ujedinjenom Kraljevstvu, za koje se sumnjalo da imaju genetskuneurološkiporemećaj (obiteljski ili rani oblici ataksije, neuropatija, spastična paraplegija, demencija, bolest motoričkih neurona,parkinsonovacpokretporemećaji, intelektualne teškoće ili neuromuskularni poremećaji). Ako je ponovni poziv ekspanzije napravljen korištenjem sekvenciranja cijelog genoma, PCR je korišten za potvrdu rezultata.

Nalazi

Dijagnostička točnost sekvencioniranja cijelog genoma za otkrivanje ponovljenih ekspanzija procijenjena je u odnosu na 793 PCR testa koja su prethodno provedena unutar NHS-a na 404 pacijenta. Sekvenciranje cijelog genoma ispravno je klasificiralo 215 od 221 proširenog alela i 1316 od 1321 neproširenog alela, pokazujući 97·3 posto osjetljivosti (95 posto CI 94·2–99·0) i 99·6 posto specifičnosti (99·1–99 ·9) preko 13 lokusa povezanih s bolešću u usporedbi s rezultatima PCR testa. U uzorcima 11 631 pacijenata u projektu 100 000 Genomes Project, sekvencioniranje cijelog genoma identificiralo je 81 ponovljenu ekspanziju, koja je također testirana PCR-om: 68 je potvrđeno kao ponovljena ekspanzija u punom patogenom rasponu, 11 nije -patogena intermedijarna proširenja ili permutacije, a dva su bila neproširena ponavljanja (stopa lažnih otkrića od 16 posto).

Tumačenje

U našoj studiji, sekvencioniranje cijelog genoma za detekciju ponovljenih ekspanzija pokazalo je visoku osjetljivost i specifičnost i dovelo je do identifikacijeneurološkiponavljanje poremećaja ekspanzije u prethodno nedijagnosticiranih pacijenata. Ovi nalazi podupiru provedbu sekvenciranja cijelog genoma u kliničkim laboratorijima za dijagnozu pacijenata koji imajuneurološkiprezentacija u skladu s poremećajem ponovljene ekspanzije.

Financiranje

Vijeće za medicinska istraživanja, Odjel za zdravstvo i socijalnu skrb, Nacionalna zdravstvena služba Engleske, Nacionalni institut za zdravstvena istraživanja i Illumina.

Uvod

Unatoč nedavnom napretku u našem razumijevanju genetske osnove rijetkihneurološkiporemećaja, do 70 posto pacijenata s takvim poremećajima ostaje genetski nedijagnosticirano.1-3 Djelomično je to zbog tehničkih izazova testiranja složenih i ponavljajućih genetskih varijanti, uključujući ponovljene ekspanzije; Procjenjuje se da takve ekspanzije pogađaju oko 1 od 3000 ljudi (dodatak str. 1) i vodeći su uzrok više od 40 neurogenetskih poremećaja,4 uključujući Huntingtonovu bolest i fragilni X sindrom. Poremećaji ponovljene ekspanzije su klinički i genetski heterogeni, a ponovljena ekspanzija može biti povezana s različitim bolestima. Na primjer, ekspanzije u C9orf72 mogu se predstaviti ili kao amiotrofična lateralna skleroza ili frontotemporalna demencija.5 Ponovljene ekspanzije u različitim lokusima također mogu dati slične fenotipske značajke, što ih čini teškim klinički razlikovati: ponovljene ekspanzije u najmanje deset gena spinocerebelarne ataksije često prisutne u odrasloj dobi -početna ataksija,6 i one u C9orf72 i AR mogu uzrokovati bolest motoričkih neurona.7,8

Poremećaji ponavljajuće ekspanzije uzrokovani su povećanjem broja ponavljajućih kratkih tandemskih sekvenci DNA, a pragovi patogenosti za svaki poremećaj specifični su za lokus. Veličina ekspanzije varira od manje od 30 ponavljanja (npr. u CACNA1A) do nekoliko tisuća jedinica ponavljanja (npr. u FMR1, DMPK, C9orf72 i FXN, koje se mogu proširiti do veličine od 5 kb). Ponovljene ekspanzije pokazuju molekularnu nestabilnost, što može dovesti do promjena u veličini ponavljanja (općenito povećavajući duljinu) kroz generacije i tkiva.4 U tim uvjetima, povećanje broja ponavljanja često dovodi do ranijeg početka i teže bolesti u uzastopnim generacije.4 Pedijatrijski početak poremećaja ponovljene ekspanzije može se prezentirati kao multisistemski sindrom bez specifičnih fenotipskih znakova,9 i stoga je vjerojatnije da će djeca s ovim poremećajima biti nedovoljno dijagnosticirana kada obiteljska povijest poremećaja ponovljene ekspanzije nije prisutna nego kada je prisutna.10– 12

Laboratorijska procjena ponovljenih ekspanzija obično je ograničena na ciljanu molekularnu procjenu pojedinačnog lokusa vođenu sumnjivom kliničkom dijagnozom pomoću PCR-a ili Southern blot metoda,13 što može biti skupo i dugotrajno. Osim toga, zbog različitih i preklapajućih fenotipskih značajki ovih poremećaja, lokusi ponovljene ekspanzije povezani s bolešću mogu ostati neispitani.14

Sekvencioniranje cijelog genoma pojavljuje se kao dijagnostički alat prve linije kod bolesnika s rijetkim bolestima15, ali se donedavno smatralo da ima ograničenu sposobnost procjene lokusa koji sadrže ponovljene ekspanzije.16 Međutim, napredak u bioinformatici učinio je izvedivim otkrivanje bolesti -uzrokujući ponovljene ekspanzije iz podataka sekvenciranja sljedeće generacije.17-22 Ovdje izvještavamo o dijagnostičkoj procjeni pristupa sekvencioniranju cijelog genoma za otkrivanje ponovljenih ekspanzija korištenjem retrospektivnih PCR podataka i njegovoj kliničkoj validaciji kod pacijenata u Projektu 100 000 genoma koji imao sumnju na neurološki poremećaj, nedijagnosticiran prethodnim genetskim testiranjem.

metode

Dizajn studije i sudionici

Ova procjena sekvencioniranja cijelog genoma za otkrivanje ponovljenih ekspanzija uključivala je i dijagnostičku točnost i procjenu kliničke točnosti. Dijagnostička točnost procijenjena je korištenjem podataka pacijenata koji su prethodno bili testirani PCR-om na ponovljene ekspanzije za koje je poznato da uzrokuju neurološke bolesti.4 Pacijenti su identificirani iz dva izvora: 100 000 Genomes Project i Genomic Laboratory sa sjedištem u bolnicama Sveučilišta Cambridge ( Cambridge, UK). Za oba skupa pacijenata laboratoriji Nacionalne zdravstvene službe (NHS) proveli su PCR testiranje na uzorcima pacijenata kao dio rutinske kliničke procjene: za uzorke u Projektu 100 000 genoma, PCR testovi su učinjeni prije zapošljavanja u projektu od strane University College London Hospital Neurogenetics Laboratory (London, UK); uzorci s ponovljenim ekspanzijama potvrđenim PCR-om dobiveni su od pacijenata koje je testirao Genomski laboratorij sa sjedištem u Cambridgeu. Pacijenti s PCR-pozitivnim i PCR-negativnim rezultatima testa za ponovljene poremećaje ekspanzije identificirani su za uključivanje u našu studiju putem sustava laboratorijskih zapisa; svi su pacijenti dali pismeni informirani pristanak za korištenje njihovog uzorka za osiguranje kvalitete te u svrhe istraživanja i obuke, kao dio optimizacije i validacije kliničke usluge.

Sekvenciranje cijelog genoma svakog uzorka učinjeno je u jednom od dva laboratorija: Genomics England (Hinxton, UK) za uzorke Projekta 100 000 genoma (n=254) i Illumina Clinical Services Laboratory (ICSL; San Diego, CA, SAD) za uzorke dobivene od strane Genomskog laboratorija sa sjedištem u Cambridgeu (n=150). Sveukupno, ovaj skup podataka korišten je za dio studije dijagnostičke točnosti, a sastojao se od podataka PCR-a i sekvencioniranja cijelog genoma od 404 pacijenta, pokrivajući 13 lokusa koji predstavljaju najčešće poremećaje neurološkog ponavljanja: 11 lokusa povezanih s ataksijom i kasnim početni neurodegenerativni poremećaji (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 i FXN), jedan lokus povezan s intelektualnim invaliditetom (FMR1) i jedan lokus povezan s miotoničnom distrofijom (DMPK). Za svaki lokus bili su dostupni podaci PCR testa za najmanje jedan prošireni alel (dodatak str. 24).

Klinička je točnost procijenjena ispitivanjem podudarnosti ponovljenih ekspanzija, otkrivenih sekvenciranjem cijelog genoma, sa sumnjom na kliničku dijagnozu nakon potvrde PCR-om u bolesnika sa sumnjom na genetske neurološke poremećaje (obiteljski ili rani oblici ataksije, neuropatija, spastična paraplegija, demencija , bolest motornog neurona,parkinsonovacporemećaji kretanja, intelektualne teškoće ili neuromuskularni poremećaji) angažirani u Projektu 100 000 genoma 2013–17. Projekt 100 000 genoma britanski je program za procjenu vrijednosti sekvencioniranja cijelog genoma kod pacijenata s nezadovoljenim dijagnostičkim potrebama kod rijetkih bolesti i raka. Nakon etičkog odobrenja za Projekt 100 000 genoma od strane East of England Cambridge South Research Ethics Committee (referenca 14/EE/1112), uključujući analizu podataka i vraćanje dijagnostičkih nalaza pacijentima, te su pacijente regrutirali zdravstveni radnici i istraživači iz 13 Centara za genomsku medicinu u Engleskoj i bili su uključeni u projekt ako su oni ili njihov skrbnik dali pisani pristanak da se njihovi uzorci i podaci koriste u istraživanju, uključujući ovu studiju. Probandi i, ako je bilo izvedivo, drugi članovi obitelji bili su uvršteni u skladu s kriterijima podobnosti postavljenim za specifične rijetke bolesti (dodatak str. 5-11). Pacijenti su angažirani u projektu 100 000 genoma nakon standardnog genetskog testiranja u NHS-u, kao što je navedeno u kriterijima prihvatljivosti. Standardizirani osnovni klinički podaci zabilježeni su korištenjem ontologije ljudskog fenotipa (HPO)23 u usporedbi s modelima podataka specifičnih za bolest.24 Također je prikupljen status bolesti članova obitelji u odnosu na probandovu kliničku indikaciju za testiranje.

Kako bismo identificirali uzročne ponovljene ekspanzije u pacijenata s genetski nedijagnosticiranom bolešću, testirali smo pacijente sa sumnjom na genetske poremećaje koji su u skladu s bolešću ponovljene ekspanzije. Bolesnici su odabrani na temelju podudarnosti njihove bolesti i termina HPO s poremećajima povezanim s ponovljenom ekspanzijom. Podaci sekvenciranja cijelog genoma pacijenata ispitani su kako bi se potražila ekspanzija u određenim skupovima ponavljanja pomoću četiri različite ploče ekspanzije ponavljanja u skladu s njihovim kliničkim karakteristikama (dodatak str. 5). Ponovljene ekspanzije odabrane za uključivanje na ove ploče najčešći su lokusi ponovljene ekspanzije koji uzrokuju neurološke bolesti. Pacijenti s kliničkim značajkama potencijalno kompatibilnim s više od jednog poremećaja ponovljene ekspanzije testirani su na više ploča. Ako je učinjen poziv za ponovnu ekspanziju korištenjem sekvenciranja cijelog genoma, provedeno je potvrdno testiranje PCR-om.

Za svakog pacijenta s potvrđenom ponovljenom ekspanzijom, lokalni kliničar je obaviješten o potencijalnom dijagnostičkom rezultatu i procijenjen je doprinos ponovljene ekspanzije kliničkim značajkama pacijenta. Za ponovljena proširenja koja su u potpunosti ili djelomično objasnila kliničke karakteristike pacijenta, izdano je dijagnostičko izvješće u skladu s lokalnim standardnim postupcima.

Postupci

Za povijesne uzorke NHS-a korištene u dijelu naše studije o dijagnostičkoj točnosti, ponovljena proširenja prethodno su testirana pomoću PCR amplifikacije i analize fragmenata. Southern blot je izveden za velike C9orf72 ekspanzije. U dijelu naše studije koji se odnosi na kliničku točnost, ponovljene ekspanzije otkrivene sekvenciranjem cijelog genoma kod pacijenata iz projekta 100 000 Genomes Project testirane su PCR-om u uzorcima pohranjenim u genetskim laboratorijima NHS-a. Dodatni detalji, uključujući sekvence početnica, navedeni su u dodatku (str. 2–3, 25–26).

DNK je pripremljena za sekvenciranje cijelog genoma upotrebom TruSeq DNA PCR-Free pripravka biblioteke, a 150 bp ili 125 bp uparenih krajeva sekvenciranja je izvedeno na platformama HiSeq 2000 ili HiSeq X u postrojenju za genome visoke propusnosti za Genomics England i na ICSL-u. . Genomi su sekvencionirani do prosječne dubine od 35× (31× do 37×; dodatak str. 27). Genotipizacija s kratkim tandemskim ponavljanjem provedena je korištenjem softverskog paketa ExpansionHunter verzije 3.1.2.25,26 Ukratko, ExpansionHunter preusklađuje očitavanje sekvenciranja preko unaprijed definiranog skupa kratkih tandemskih ponavljanja kako bi se procijenila veličina oba alela pojedinca (dodatak str. 3).

Izlaz ExpansionHunter uključuje procjenu broja ponovljenih elemenata, ukupne veličine i granice pouzdanosti za svaki procijenjeni lokus. Smjernice Udruženja za medicinsku patologiju i Koledža američkih patologa preporučuju vizualni pregled varijantnih poziva tijekom rutinske procjene varijanti sekvenciranja visoke propusnosti.27

Međutim, varijante kratkog tandemskog ponavljanja ne mogu se adekvatno vizualizirati uobičajenim alatima za vizualizaciju kao što je Integrative Genomics Viewer.28 Za ispitivanje podataka sekvenciranja cijelog genoma koji se nalaze u osnovi svakog poziva genotipa, korišten je alat za vizualizaciju grafikona, koji omogućuje izravnu vizualizaciju haplotipova i odgovarajuće gomilanje čitanja genotipova ExpansionHunter (prilog str. 3, 15). Vizualna inspekcija pileup grafa obavljena je na svim kratkim tandemskim ponovljenim pozivima sekvenciranja cijelog genoma kako bi se potvrdilo da je ExpansionHunter predviđanje za alele u cijelosti sadržano u svakom čitanju (tj. sekvenca ponavljanja bila je manja od duljine čitanja sekvenciranja); potvrditi prisutnost monoalelne ili bialelne ekspanzije; otkrivanje navodnih lažno pozitivnih poziva; i za otkrivanje lažno negativnih alela u ekspanzijama bialelnog ponavljanja, kao što je FXN (dodatak str. 4, 16).

ExpansionHunter procjenjuje veličinu ponavljanja iz podataka o sekvenciranju cijelog genoma analizirajući čitanja sekvenciranja koja u potpunosti ili djelomično sadrže kratko tandemsko ponavljanje. Ako je kratki tandem ponovljeni alel kraći od duljine očitavanja, ExpansionHunter predviđa točnu veličinu; ako je kratki tandem ponovljeni alel duži od duljine očitavanja, ExpansionHunter procjenjuje veličinu ponavljanja unutar CI-ja, ovisno o sastavu sekvence lokusa, dubini sekvenciranja i kvaliteti sekvenciranja.

Statistička analiza

Ponavljanja smo klasificirali kao proširena sekvenciranjem cijelog genoma ako je veličina koju je ExpansionHunter predvidio bila iznad granične vrijednosti premutacije, ili kao neproširena ako je predviđena veličina bila ispod granične vrijednosti (dodatak str. 28).

Osjetljivost i CI za detekciju ponavljanja ekspanzije sekvenciranjem cijelog genoma izračunati su kao udio alela s proširenim ponavljanjima među alelima s proširenim ponavljanjima prethodno potvrđenim PCR-om. Specifičnost je procijenjena kao udio neproširenih alela među prethodno testiranim neproširenim ponavljanjima pomoću PCR-a. Potpuni opis statističkih formula nalazi se u dodatku (str. 1).

Za usporedbu veličina ponavljanja putem PCR-a s procjenama veličine ponavljanja sekvenciranjem cijelog genoma, aleli kvantificirani PCR-om uspoređeni su s veličinama ponavljanja koje je predvidio ExpansionHunter za alele kraće od duljine očitanja u svih 13 kratkih lokusa tandemskog ponavljanja. Podudarnost je izračunata postotkom veličina ponavljanja koje je predvidio ExpansionHunter i koje su bile u skladu s veličinom kvantificiranom PCR-om, uzimajući u obzir PCR pogrešku od plus ili minus jednog ponavljanja. Statistička analiza provedena je korištenjem R statističkog softvera verzije 3.6.3.

Uloga izvora financiranja

Dizajn studije, uključivanje pacijenata, prikupljanje podataka i sekvenciranje vodili su zaposlenici Genomics England i akademski istraživači. Zaposlenici Illumine proveli su sekvenciranje 150 uzoraka pacijenata kao planiranu komponentu studije dijagnostičke točnosti sekvenciranja cijelog genoma i razvili ExpansionHunter. Zaposlenici Genomics England, akademski istraživači i koautori RTH, ED i MAE izvršili su analizu i interpretaciju ponovljenih ekspanzija kod pacijenata regrutiranih u 100 000 Genomes Project. Izvori financiranja nisu imali nikakvu ulogu u interpretaciji podataka ili pisanju izvješća.

Rezultati

Dijagnostička točnost sekvencioniranja cijelog genoma za otkrivanje ponovljenih ekspanzija procijenjena je u odnosu na 793 PCR testa prethodno obavljenih unutar NHS-a na 404 pacijenta (64 pacijenta su testirana na više od jednog ponavljanja; slika 1). Od ovih testova, 183 su klasificirana kao testa s proširenim ponavljanjem, a 610 kao testa koji nemaju ponovljenu ekspanziju pomoću PCR-a, što je dalo ukupno 221 prošireni i 1321 neprošireni pojedinačni alel u 13 lokusa bolesti (dodatak str. 24, 28). Sekvenciranje cijelog genoma ispravno je klasificiralo 215 od 221 proširenog alela i 1316 od 1321 neproširenog alela u usporedbi s rezultatima PCR testa (dodatak str. 27, 29), pokazujući početnu osjetljivost od 97,3 posto (95 posto CI 94,2-99 ·0) i specifičnosti od 99·6 posto (99·1–99·9; tablica 1). Nakon vizualne korekcije svih poziva na temelju kvalitete očitanja, osjetljivost se povećala na 99·1 posto (96·8–99·9), a specifičnost na 100 posto (99·7–100; slika 2A, tablica 1). Vizualizacija ekspandiranih alela omogućila je detekciju lažno pozitivnih rezultata i reklasifikaciju svih lažno negativnih alela u FXN, od kojih je samo jedan alel ispravno klasificiran kao ekspandiran u uzorcima s bialelnim ekspanzijama (dodatak str. 17, 18).

Duljina ponavljanja je kvantificirana pomoću PCR-a u 509 PCR testova koji ispituju 945 alela preko 13 lokusa ponavljanja ekspanzije. Korelacije između ExpansionHunter i PCR za veličine ponavljanja kraće i veće od duljine očitavanja sekvenciranja (tj. 150 bp) prikazane su u dodatku (dodatak str. 19). Visoka podudarnost primijećena je za ponavljanja kraća od duljine očitavanja, s 92,7 posto (836 od 902) slaganja između PCR-a i ExpansionHuntera. Uočena je varijabilnost lokusa, s visokom podudarnošću između ExpansionHunter i PCR za ATXN2, ATXN7, CACNA1A i HTT, i niskom podudarnošću za DMPK ili TBP (dodatak str. 30). Duljine alela veće od očitane duljine ExpansionHunter je podcijenio, što je utjecalo na točnost poziva u DMPK, FMR1 i FXN (slika 2B, dodatak str. 19, 31).

Iako je ExpansionHunter uspio ispravno identificirati velike proširene alele u FMR1, DMPK, C9orf72 i FXN (dodatak str. 29), predviđene procjene veličine imale su tendenciju biti niže od onih dobivenih PCR-om jer se veličina ponavljanja povećavala unutar patogenog raspona, što je utjecalo na sposobnost razlikovanja između velikih i malih ekspanzija u DMPK, C9orf72 i FXN, ili između potpunih ekspanzija i permutacija u FMR1 (dodatak str. 31). Na primjer, lokusi s PCR-om procijenjenom duljinom ponavljanja većom od 200 ponavljanja u FMR1 i klasificirani kao puna mutacija imali su srednju veličinu ponavljanja koju je ExpansionHunter procijenio od 92·6 (SD 17·8; dodatak str. 31).

Kako bismo testirali sposobnost detekcije ponovljenog širenja sekvenciranjem cijelog genoma kako bismo razriješili dijagnozu prethodno testiranih i genetski nedijagnosticiranih pacijenata, testirali smo 11 631 pacijenata sa sumnjom na genetski neurološki poremećaj angažiranih u Projektu 100 000 genoma (slika 1). Podaci o sekvenciranju cijelog genoma procijenjeni su korištenjem četiri različite ploče za ponavljanje ekspanzije u skladu s kliničkim značajkama pacijenta. Broj pacijenata testiranih sa svakom od četiri ploče prikazan je u tablici 2.

Sve u svemu, detektirali smo i vizualno potvrdili ponovljene ekspanzije u uzorcima od 105 pacijenata (tablica 2, dodatak str. 20, 33). Od toga je 81 uzorak bio dostupan za potvrdno testiranje PCR-om, a za 68 je potvrđena ponovljena ekspanzija (0·6 posto prinosa): 45 (1,2 posto) od 3692 u panelu A, osam ({ {18}}·3 posto ) od 2743 u panelu B, pet (0·6 posto ) od 860 u panelu C, i deset (0·1 posto ) od 6731 u panelu D. Trinaest od 81 poziva za proširenje nisu potvrđene kao patogene ponovljene ekspanzije (stopa lažnih otkrića od 16 posto). Od toga, dva su bila neprošireni aleli u ATXN1 i ATXN2, četiri su bili FMR1 srednje veličine (dodatak str. 21), a sedam su bile FMR1 permutacije.

Klinički detalji 68 pacijenata s ponovljenim ekspanzijama potvrđenim PCR-om, uključujući njihovu kliničku sliku, identificiranu ponovljenu ekspanziju i doprinos ponovljene ekspanzije kliničkim značajkama pacijenta navedeni su u tablici 3; uvjeti HPO-a, veličina ponavljanja koju je procijenio ExpansionHunter i je li izdano dijagnostičko izvješće navedeni su u dodatku (str. 33).

Ekspanzije su primijećene kod pacijenata koji su imali širok raspon preklapajućih kliničkih prezentacija testiranih s panelom A (tablica 3, dodatak str. 22), uključujući ponovnu ekspanziju ATXN2 u bolesnika s ranom pojavom Parkinsonove bolesti koja reagira na levodopu i poviješću progresivne cerebelarne ataksije , i proširenja AR kod četiri pacijenta s kliničkom dijagnozom Charcot-Marie-Toothove bolesti, uključujući jednog s genetski potvrđenom demijelinizirajućom neuropatijom (tj. Charcot-Marie-Toothova bolest tip 1, pacijent 42; dodatak str. 33). Širok raspon prethodnih kliničkih dijagnoza uočen je u bolesnika s patogenim ponovljenim ekspanzijama.

Na primjer, kod sedam pacijenata s amiotrofičnom lateralnom sklerozom ili drugom bolešću motoričkih neurona, utvrđena su proširenja u AR (n=4) i C9orf72 (n=3). Kod pacijenata sa sumnjom na nasljednu ataksiju, identificirali smo ekspanzije u lokusima koji nisu bili procijenjeni kao dio rutinske dijagnostičke obrade unutar NHS-a u vrijeme zapošljavanja, uključujući ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP i HTT ( tablica 3). Također smo otkrili ponovljene ekspanzije u bolesnika s kliničkim značajkama koje su u skladu s alternativnim poremećajima ponovljene ekspanzije, uključujući ekspanziju C9orf72 u ranoj pojavi i obiteljskoj Parkinsonovoj bolesti (pacijent 24, tablica 3) i ponovljene ekspanzije u smanjenom rasponu penetracije u HTT (38 ponavljanja) u dvije sestre s poremećajem kretanja, demencijom, depresijom i poteškoćama s govorom (pacijenti 44 i 45), naglašavajući dijagnostički izazov koji predstavljaju ti poremećaji ponavljajuće ekspanzije.

Utvrđeno je da osmero djece testirane s panelom B imaju velika ponovljena proširenja CAG (slika 3), od kojih sedmero u potpunosti objašnjava kliničke značajke pacijenta. Šest pacijenata nije imalo informativnu obiteljsku anamnezu i nije im ponuđeno ponovljeno testiranje ekspanzije kao dio njihove kliničke procjene u vrijeme zapošljavanja (pacijenti 48-53; tablica 3, dodatak str. 33). Dvoje od te djece imalo je velike HTT ekspanzije (90-100 CAG ponavljanja). Važno je napomenuti da je jedno dijete naslijedilo ponavljanje od nepogođenog roditelja bez obiteljske povijesti Huntingtonove bolesti. Obiteljsko testiranje je u tijeku, ali alel smanjene penetracije identificiran je u proširenoj obitelji, što ukazuje da se ponavljanje proširilo za više od 60 jedinica ponavljanja u jednoj generaciji (pacijent 52). U vrijeme pisanja nitko u obitelji nije pokazivao nikakve znakove Huntingtonove bolesti, au tijeku je genetsko savjetovanje i testiranje roditelja. Dvoje djece mlađe od 5 godina imalo je velike ponovljene ekspanzije u ATXN7 i imalo je složenu višesistemsku bolest. Za jedno od te djece (pacijent 50), njihov je roditelj pokazao probleme s hodom 2 godine nakon uključivanja u Projekt 100 000 genoma. Slično tome, otkriveno je da djevojčica u dobi od 10 godina s intelektualnim teškoćama ima 99-ponovljenu ekspanziju u ATXN2, unatoč činjenici da su oba roditelja označena kao nezahvaćena, a nađeno je da djevojčica u dobi od 18 godina s demencijom nosi { {19}}ponovite proširenje u ATN1 (dodatak str. 33).

Otkriveno je pet ekspanzija DMPK (ploča C), uključujući u djeteta i majke s kliničkom dijagnozom mišićne distrofije, u dvoje braće i sestara sa sumnjom na distalnu miopatiju i u adolescenta s kongenitalnom miopatijom (pacijenti 54–58). Ekspanzije FMR1 (ploča D) otkrivene su kod devet dječaka i jedne djevojčice, a dijagnoza sindroma fragile X u potpunosti je ili djelomično objasnila kliničke značajke (pacijenti 59–68).

Rasprava

Dijagnoza poremećaja ponovljene ekspanzije predstavlja izazov u zdravstvenoj skrbi zbog heterogenih i preklapajućih kliničkih značajki i nespecifičnih kliničkih nalaza, čija se ozbiljnost može povećati s godinama i u svakoj sljedećoj generaciji. Poremećaji ponavljajuće ekspanzije su među najčešćim uzrocima nasljednih neuroloških bolesti.4 Bez obzira na to, pacijenti mogu biti nedovoljno dijagnosticirani, bilo zato što nije obavljeno dovoljno genetskog testiranja ili zato što uzročne genetske varijante tek treba otkriti. Pristupi testiranju trenutačno su fragmentirani, a pacijentima se može testirati netočan ponovljeni lokus ekspanzije29 ili im se može izvršiti molekularni test za drugu klasu varijanti zbog preklapanja kliničkih značajki s drugim neurološkim genetskim poremećajima.30

Sekvenciranje cijelog genoma korišteno je u više okruženja kao dijagnostički test prve linije za rijetke neurološke poremećaje, ali se ranije smatralo da ima nisku sposobnost otkrivanja ponovljenih ekspanzija.16 Razvijeno je nekoliko alata za identifikaciju ponovljenih ekspanzija iz cijelog genoma sekvenciranje u istraživačkom okruženju,31 ali nijedan od ovih pristupa nije primijenjen na podatke o sekvenciranju cijelog genoma prikupljene od velikog broja pacijenata u jednoj zdravstvenoj službi. Predstavljamo dokaze da algoritam osmišljen za otkrivanje ponovljenih ekspanzija iz sekvenciranja cijelog genoma može pouzdano procijeniti najčešća ponovljena širenja koja uzrokuju bolest i riješiti prethodno genetski nedijagnosticirane slučajeve u velikoj skupini pacijenata s neurološkim poremećajima. Naši rezultati pokazuju da sekvencioniranje cijelog genoma može razlikovati ne-proširene i proširene alele s visokom osjetljivošću i specifičnošću preko 13 ponovljenih ekspanzijskih lokusa (što se može dodatno poboljšati vizualnim pregledom), može točno izračunati veličinu alela manjih od očitane duljine , i može podcijeniti veličinu velikih proširenja u FMR1, DMPK, FXN i C9orf72.

Kada je otkrivanje ponovljenih ekspanzija sekvencioniranjem cijelog genoma procijenjeno u odnosu na pozitivne i negativne rezultate prethodno dobivene u kliničkim dijagnostičkim genomskim laboratorijima korištenjem metoda zlatnog standarda, pronašli smo najmanje 97,3 posto osjetljivosti i 99,6 posto specifičnosti. Nadalje, pokazali smo da se i specifičnost i osjetljivost mogu poboljšati ručnim podešavanjem očitanog pileupa, omogućujući otkrivanje lažno pozitivnih rezultata i reklasifikaciju lažno negativnih alela u uzorcima s bialelnim ekspanzijama. Od 6731 pacijenta testiranog na FMR1 (ploča D), za 124 poziva predviđeno je proširenje. Uspjeli smo isključiti 97 vizualnim pregledom kao vjerojatno lažno pozitivne. To ukazuje da bi 1 od 54 testa sekvenciranja cijelog genoma imao FMR1 poziv koji bi trebao biti vizualno pregledan kako bi se odbacio potencijalni lažno pozitivan poziv. U tijeku je rad na poboljšanju metode genotipizacije ExpansionHunter kako bi se smanjio broj lažno pozitivnih poziva za FMR1.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 ponavljanja) uzrokuju težu bolest i spinocerebelarnu ataksiju tipa 36 (NOP56), za koju se proširenja veća od 650 ponavljanja smatraju patogenima, a veličine ponavljanja od 15–650 smatraju se srednjim i varijantama nesigurnog značaja.

Identificirano je više od 40 lokusa ponovljene ekspanzije; mnogi od ovih lokusa identificirani su tek nedavno i sada su povezani s prethodno neobjašnjivim stanjima, uključujući cerebelarnu ataksiju s neuropatijom i sindromom vestibularne arefleksije (RFC1) 32 i miokloničku epilepsiju (SAMD12).33 Najčešći lokusi ponovljene ekspanzije koji uzrokuju neurološke bolesti bili su odabrani za našu studiju na temelju dostupnosti pozitivnih i negativnih kontrolnih uzoraka.

Ovdje predstavljeni nalazi sugeriraju da bi ExpansionHunter trebao moći točno klasificirati neproširene i proširene alele na bilo kojem lokusu ponovljene ekspanzije ako su neprošireni aleli manji od očitane duljine (tj. 150 bp). Iako većina ponovljenih ekspanzijskih lokusa ima alele koji su manji od 150 bp kada nisu ekspandirani, neke lokuse za koje je veličina neekspandiranih alela blizu 150 bp (npr. NOTCH2NLC)34 može biti teže genotipizirati ovim pristupom. Za lokuse gdje je prošireno ponavljanje znatno veće od duljine očitanja, sekvenciranje cijelog genoma može detektirati patogene ekspanzije (npr. NOP56,35 RFC120,32). Tehnologije dugotrajnog sekvenciranja u nastajanju mogle bi ponuditi komplementarne pristupe pri genotipizaciji velikih ekspanzija.36

Procjena ponovljenih ekspanzija korištenjem sekvencioniranja cijelog genoma u 11 631 nedijagnosticiranih pacijenata angažiranih u 100 000 Genomes Project dala je 68 pacijenata s objašnjenjima. Pacijenti su regrutirani u 100 000 Genomes Project nakon standardnog genetskog testiranja; stoga, udio ponovljenih ekspanzija identificiranih u ovoj kohorti predstavlja povećanje dijagnostičkog prinosa od standardnog NHS testiranja, koje uključuje testiranje specifično za lokus za poremećaje ponavljajuće ekspanzije kao što su FXN ili DMPK. Treba napomenuti da se na neke dijagnoze nije posumnjalo na temelju kliničkih karakteristika pacijenta, uključujući šest pedijatrijskih pacijenata koji nisu imali poznatu obiteljsku povijest poremećaja ponovljene ekspanzije. Srednje veličine ponovljenih ekspanzija predviđene sekvenciranjem cijelog genoma u pedijatrijskih pacijenata opisanih u ovoj studiji znatno su veće od prosjeka u odraslih, u skladu s očekivanjem da su veća ekspanzije povezana s ranijim i težim početkom, čak i kod djece. Potreban je daljnji rad, ali ovo otkriće sugerira da bi procjena patogenosti ovisna o dobi i veličini mogla poduprijeti pedijatrijsku dijagnozu smanjenjem potencijalne opasnosti od identificiranja rizičnih alela u odrasloj dobi, što dovodi do neželjenog prediktivnog testiranja kod djece.

Naša otkrića omogućuju uspostavu kliničkog dijagnostičkog tijeka rada za sekvencioniranje cijelog genoma (dodatak str. 23). Predlažemo da se vizualni pregled obavi za sve pozive klasificirane kao proširene radi otkrivanja lažnih pozitivnih rezultata i za bialelne ekspanzije za koje je otkriven samo jedan prošireni alel (npr. FXN). Preporučujemo da laboratoriji koriste ExpansionHunter za procjenu prisutnosti ekspanzije bez pridržavanja procjene veličine i provedbu potvrdnog PCR testiranja kao standardne komponente tijeka testiranja.

Rijetke nasljedne bolesti uključuju širok raspon kliničkih karakteristika, zbog čega je genomsko testiranje specifično za lokus neučinkovito, naporno i skupo. Predstavljamo dokaze da se kliničko sekvencioniranje cijelog genoma s potencijalom za dijagnosticiranje niza rijetkih neuroloških bolesti koje se obično predstavljaju s varijantama s jednom bazom, indelom ili brojem kopija sada može proširiti na ponovljena proširenja. Budući da sekvencioniranje cijelog genoma pruža jedan test koji može identificirati najčešće ponovljene ekspanzije, kao i istovremeno omogućava testiranje točkastih mutacija i varijanti broja kopija u genima povezanim s ovim stanjima, nudi mogućnost identificiranja većine pacijenata s ovim heterogenim poremećajima koji nisu dijagnosticirani testiranjem specifičnim za lokus. U eri novih terapija za ove poremećaje, rano otkrivanje moglo bi postati ključno.37 Ovi rezultati podupiru provedbu sekvencioniranja cijelog genoma za otkrivanje ponovljenih ekspanzija u kliničkim dijagnostičkim laboratorijima, pristup koji je već uključen u NHS England National Genomic Katalog testova,38 za ispitivanje nedijagnosticiranih rijetkih neuroloških bolesti.

Reference

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H, et al. Dijagnostička gornja granica za sekvenciranje egzoma u cerebelarnoj ataksiji i srodnim neurološkim poremećajima. Hum Mutat 2020.; 41: 487–501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A, et al. Nasljedna spastična paraplegija u Grčkoj: karakterizacija prethodno neistražene populacije korištenjem sekvenciranja sljedeće generacije. Eur J Hum Genet 2016; 24: 857–63.

3 Graziola F, Garone G, Stregapede F, et al. Dijagnostički učinak ciljanog panela gena sljedeće generacije za sekvenciranje poremećaja kretanja u pedijatriji: 3--godišnja kohortna studija. Front Genet 2019; 10: 1026.

4 Paulson H. Bolesti ponavljanja ekspanzije. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105–23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 frontotemporalna demencija i/ili amiotrofična lateralna skleroza. Seattle, WA: Sveučilište Washington, 2015.

6 Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. Spinocerebelarna ataksija. Nat Rev Dis Primers 2019; 5: 24.

7 Shakkottai VG, Fogel BL. Klinička neurogenetika: autosomno dominantna spinocerebelarna ataksija. Neurol Clin 2013; 31: 987–1007.

8 La Spada A. Spinalna i bulbarna mišićna atrofija. U: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, ur. GeneReviews. Seattle, WA: Sveučilište Washington, 1999.

9 Gousse G, Natural H, Touraine R, et al. Letalni oblik spinocerebelarne ataksije tipa 7 s ranim početkom u djetinjstvu. Arch Pediatr 2018; 25: 42–44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A, et al. Agregacija i ubikvitinacija ataksina-7 u infantilnom SCA7 sa 180 CAG ponavljanja. Ann Neurol 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB, Chapieski L, McDonald RO, Fernandez F, Malphrus AD. Spinocerebelarna ataksija tipa 2 s kognitivnom regresijom u djetinjstvu. J Child Neurol 2008; 23: 999–1001.

12 Mitchell N, LaTouche GA, Nelson B, Figueroa KP, Walker RH, Sobering AK. Spinocerebelarna ataksija 3 s početkom u djetinjstvu: distonija jezika kao rana manifestacija. Tremor Drugi hiperkinetički Mov 2019; objavljeno online 13. rujna.

13 Ptica TD. Miotonična distrofija tipa 1. U: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, ur. GeneReviews. Seattle, WA: Sveučilište Washington, 2019.

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. Učestalost ponavljanja ekspanzija SCA8, SCA10, SCA12, SCA36, FXTAS i C9orf72 u bolesnika s SCA negativnim za najčešće podtipove SCA. BMC Neurol 2018; 18:3.

15 Turro E, Astle WJ, Megy K, et al. Sekvencioniranje cijelog genoma bolesnika s rijetkim bolestima u nacionalnom zdravstvenom sustavu. Priroda 2020; 583: 96–102.

16 Ashley EA. Prema preciznoj medicini. Nat Rev Genet 2016; 17: 507–22.

17 Liu HY, Zhou L, Zheng MY, et al. Dijagnostička i klinička korisnost sekvenciranja cijelog genoma u kohorti nedijagnosticiranih kineskih obitelji s rijetkim bolestima. Sci Rep 2019; 9: 19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. Profiling the genome-wide landscape of tandem repeat expansions. Nucleic Acids Res 2019; 47: e90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. Otkrivanje ekspanzija tandemskih ponavljanja u kohortama sekvencioniranim podacima kratkog čitanja sekvenciranja. Am J Hum Genet 2018; 103: 858–73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF, et al. Identifikacija proširenih ponavljanja temeljena na bioinformatici: nereferentna ekspanzija introničkog pentamera u RFC1 uzrokuje CANVAS. Am J Hum Genet 2019; 105: 151–65.

21 Gross AM, Ajay SS, Rajan V, et al. Varijante broja kopija u kliničkom sekvencioniranju genoma: primjena i tumačenje za rijetke i nedijagnosticirane bolesti. Genet Med 2019; 21: 1121–30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM, et al. Detekcija tandemskih DNK ponavljanja koja su proširena kod autizma na cijelom genomu. Priroda 2020; 586: 80–86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. Ontologija ljudskog fenotipa: alat za označavanje i analizu ljudske nasljedne bolesti. Am J Hum Genet 2008; 83: 610–15.

24 Genomics England. Modeli kliničkih podataka o stanjima rijetkih bolesti. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (pristupljeno 4. kolovoza 2021.).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ, et al. Detekcija ekspanzija dugog ponavljanja iz podataka sekvence cijelog genoma bez PCR-a. Genome Res 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F, et al. ExpansionHunter: alat temeljen na grafikonu sekvenci za analizu varijacija u kratkim tandemskim regijama ponavljanja. Bioinformatika 2019.; 35: 4754–56.

27 Roy S, Coldren C, Karunamurthy A, et al. Standardi i smjernice za validaciju bioinformatičkih cjevovoda sljedeće generacije za sekvenciranje: zajednička preporuka Udruge za molekularnu patologiju i Koledža američkih patologa. J Mol Diagn 2018; 20: 4–27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, et al. Preglednik integrativne genomike. Nat Biotechnol 2011; 29: 24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD, et al. Fenotipska homogenost prezentacije nalik Huntingtonovoj bolesti u obitelji SCA17. Neurologija 2006; 67: 1701–03.

30 Schneider SA, Bird T. Huntingtonova bolest, slične Huntingtonovoj bolesti i benigna nasljedna koreja: što je novo? Mov Disord Clin Pract 2016; 3: 342–54.

31 Bahlo M, Bennett MF, Degorski P, Tankard RM, Delatycki MB, Lockhart PJ. Najnoviji napredak u detekciji ponovljenih ekspanzija sa sekvenciranjem sljedeće generacije kratkog čitanja. F1000Res 2018; 7: 736.

32 Cortese A, Simone R, Sullivan R, et al. Bialelna ekspanzija introničkog ponavljanja u RFC1 čest je uzrok ataksije s kasnim početkom. Nat Genet 2019; 51: 649–58.

33 Ishiura H, Doi K, Mitsui J, et al. Ekspanzije introničkih TTTCA i TTTTA ponavljanja u benignoj obiteljskoj miokloničkoj epilepsiji odraslih. Nat Genet 2018; 50: 581–90.

34 Ishiura H, Shibata S, Yoshimura J, et al. Nekodirajuće ekspanzije ponavljanja CGG-a u neuronskoj intranuklearnoj inkluzijskoj bolesti, okulofaringgodistalnoj miopatiji i preklapajućoj bolesti. Nat Genet 2019; 51: 1222–32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Papa K, et al. Brza dijagnoza spinocerebelarne ataksije 36 u obitelji od tri generacije korištenjem podataka o sekvenciranju cijelog genoma kratkog čitanja. Mov Disord 2020; 35: 1675–79.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. Long-read sekvenciranje koje se pojavljuje u medicinskoj genetici. Front Genet 2019; 10: 426.

37 Ellerby LM. Poremećaji ponavljajuće ekspanzije: mehanizmi i terapija. Neurotherapeutics 2019; 16: 924–27.

38 Nacionalni zdravstveni sustav. Nacionalni imenik genomskih testova: kriteriji testiranja za rijetke i nasljedne bolesti. listopada 2021.