Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Nedostatak mitohondrijskog transkripcijskog faktora A ciljanog epitela bubrega rezultira progresivnim smanjenjem mitohondrija povezanim s teškom cističnom bolešću--I. dio

Ken Ishii^1,2,11 et al

Abnormalna funkcija mitohondrija dobro je poznata značajka akutnog i kroničnogbubreg bolesti. Dobiti uvid u ulogu mitohondrija ububreghomeostaze i patogeneze, ciljali smo na mitohondrijski transkripcijski faktor A (TFAM), protein potreban za replikaciju i transkripciju mitohondrijske DNA koji ima ključnu ulogu u održavanju mitohondrijske mase i funkcije. Ispitati posljedice poremećene funkcije mitohondrija ububregepitelne stanice, inaktivirali smo TFAM u homeoboxu povezanom sa sine oculisom 2-koji eksprimirabubregprogenitorske stanice. Nedostatak TFAM-a rezultirao je značajno smanjenom ekspresijom mitohondrijskih gena, smanjenjem mitohondrija, inhibicijom sazrijevanja nefrona i razvojem ozbiljne postnatalne cistične bolesti, što je rezultiralo preuranjenom smrću. To je bilo povezano s abnormalnom morfologijom mitohondrija, smanjenjem potrošnje kisika i povećanim glikolitičkim protokom. Nadalje, otkrili smo da je ekspresija TFAM-a smanjena kod miševa i ljudipolicistični bubrezi, što je bilo popraćeno smanjenjem mitohondrija. Stoga naši podaci sugeriraju da su disregulacija ekspresije TFAM-a i mitohondrijska deplecija molekularne značajkebubregcistična bolest koja može pridonijeti njenoj patogenezi.

KLJUČNE RIJEČI: glikoliza; razvoj bubrega; mitohondriji;policistična bolest bubrega; TFAM

cistancheje dobar zapolicistična bolest bubrega

Prijevodna izjava

Koristili smo genetiku miševa kako bismo razumjeli ulogu mitohondrijske disfunkcije ububreghomeostaza. Inaktivacija mitohondrijskog transkripcijskog faktora A (TFAM) u homeobox 2 epitelnim progenitorskim stanicama povezanim sa sine oculisom rezultirala jebubrežnineuspjehzbog teškihpolicistični bubreg bolest. Naša otkrića pokazuju da je progresivna mitohondrijska disfunkcija povezana s neispravnom diferencijacijom epitela ibubrežnicistogeneza. Nadalje, ustanovili smo da su ekspresija TFAM-a i broj mitohondrija smanjeni kod ljudipolicistični bubregtkivo. Naše studije pokazuju da terapijske strategije, koje imaju za cilj poboljšanje zdravlja mitohondrija, mogu biti korisne u liječenju pacijenata s autosomno dominantnimpolicistični bubregbolest.

Mitohondrijska (mt) disfunkcija dobro je poznata patološka značajka uobičajenihbubreg bolestii može izazvati oštećenje stanica, upalu i fibrozu.1 Ububreg, tubularne epitelne stanice jako ovise o adenozin trifosfatu (ATP) koji nastaje oksidativnom fosforilacijom (OXPHOS) jer obavljaju višestruke epitelne transportne funkcije koje troše energiju. Stoga je održavanje učinkovite proizvodnje mt ATP-a ključno za normalnu funkciju bubrega i sustavnu homeostazu elektrolita. Osim toga, nedavni dokazi pokazuju da mitohondriji imaju glavnu ulogu u regulaciji gena, staničnoj signalizaciji i staničnoj diferencijaciji putem stvaranja intermedijarnih metabolita i reaktivnih kisikovih vrsta (ROS).2 Unatoč ovom napretku, uloga mt signalizacije u patogenezi uobičajenihbubregbolestinije dobro shvaćeno.

Za istraživanje mt funkcije ububrežnihomeostaze i patogeneze, ciljali smo na mitohondrijski transkripcijski faktor A (TFAM). TFAM je nuklearno kodirani čimbenik bitan za mt funkciju, održavanje broja mt kopija i strukturnu stabilnost mt DNK jer regulira replikaciju i transkripciju mt genoma savijanjem promotorske DNK.3,4 Mt DNK sisavaca sadrži 37 gena, 13 od kojih kodiraju proteinske podjedinice kompleksa respiratornog lanca, 22 kodiraju prijenosne RNA, a 2 ribosomalne RNA.3 Stoga je TFAM izravno uključen u regulaciju transporta mt elektrona i sintezu ATP-a putem transkripcije gena kao što je mitohondrijski kodirani citokrom b ( MT-CYB), mitohondrijsko kodiranu podjedinicu 1 citokrom c oksidaze (MT-CO1) i mitohondrijsko kodiranu podjedinicu membrane 6 ATP sintaze (MTATP6).3,5 Bez TFAM-a stanice gube svoju sposobnost proizvodnje ATP-a putem OXPHOS-a, ne mogu generirati značajne količine mt ROS i postaju progresivno osiromašeni mitohondrije.6-9 Genetske studije su pokazale da je TFAM neophodan za normalnu embriogenezu jer je globalna homozigotna inaktivacija Tfam rezultirala intrauterinom smrtnost do embrionalnog dana 10,5, dok heterozigotna deficijencija, iako je smanjila broj kopija mt za ~40 posto i dovela do nedostatka respiratornog lanca, nije dovela do embrionalne smrtnosti.6 Stoga je genetsko ciljanje TFAM-a korisna eksperimentalna strategija za ispitivanje uloge progresivne disfunkcije mt u staničnoj diferencijaciji i homeostazi tkiva. Uvjetna inaktivacija Tfam-a specifična za stanični tip ukazuje na to da je stvaranje OXPHOS-a i/ili mt ROS-a kritično za staničnu diferencijaciju, funkciju i normalnu fiziologiju.6-10

Primarni mt poremećaji zbog mutacije jezgre ili mt gena mogu se pojaviti sbubreg bolestnajčešće se očituje kao tubulointersticijska ozljeda ili izolirana tubularna disfunkcija.11,12 Iako je upletena u patogenezu određenih ljudskih bolesti kao što su neurodegenerativni poremećaji,13 specifične mutacije u TFAM-u uzrokujububrežnibolesti nisu prijavljene. Nedavno je smanjena ekspresija TFAM-a povezana s kroničnombubregbolest. Gubitak integriteta mt zbog inaktivacije Tfam uzrokovao je tubulointersticijsku bolest ibubrežni neuspjehu miševa, što je djelomično posljedica aktivacije mt DNA stresom izazvane cikličke GMP-AMP sintaze (cGAS)–stimulatora gena za interferon (STING)–ovisnih upalnih odgovora.14

Ovdje izvješćujemo da miševi s uvjetnom inaktivacijom Tfam-a u homeobox 2 (SIX2)-srodnim sine oculisu eksprimiraju progenitorske stanice nefrona15 koje razvijaju tešku cističnu bolest i prerano umiru odbubrežnineuspjehkao mladi mladi miševi.Tfam^-/- miševi su bili karakterizirani defektima u sazrijevanju nefrona, što je bilo povezano s smanjenjem mt, smanjenjem OXPHOS-a i metaboličkim pomakom prema glikolizi uTfam^-/- bubrežniepitel. S obzirom na težinu cistične bolesti uTfam^-/- miševa, analizirali smo 2 modela miševapolicistični bubregbolest(PKD), koje su rezultat mutacija bilo u policistinu-1 (PKD(policistična bolest bubrega)1) ili cistin-1 (Cys1), kao i ljudska tkiva pacijenata s autosomno dominantnom policističnom bolešću bubrega (ADPKD). To utvrđujemoTfam^-/- je disreguliran u cistama iz mišjeg i ljudskog PKD-a(policistična bolest bubrega), maramice. Uzevši zajedno, naše studije sugeriraju da su disregulacija TFAM-a i smanjenje mt-a karakteristične značajkebubrežnicističnih bolesti i može imati doprinos u njihovoj patogenezi.

cistancheje dobar zapolicistična bolest bubrega

REZULTATI

Inaktivacija Tfam u stanicama loze SIX2 uzrokuje tešku cističnu bolest koja rezultirabubrežnineuspjehKako bi se istražila funkcija mt ububrežniepitela, inaktivirali smo Tfam u ŠEST2-progenitorskih stanica s ekspresijom, koje stvaraju sve segmente nefrona, osim sabirnog kanala (CD).15 Za to smo ukrstili Tfam floxed alel s bakterijskim umjetnim kromosomskim transgenim miševima koji ekspresiraju poboljšani zeleni fluorescentni protein/Cre rekombinazni fuzijski protein (eGFP/Cre) pod transkripcijskom kontrolom Six2 promotora (Slika 1a).16 Miševi homozigotni za Tfam floxed alel i heterozigotni za eGFP/Cre transgen (Šest2-eGFP/Cretg/^{tg plus}; Tfam^fl/fl) od sada se naziva Šest2-Tfam^-/- mutanti. Šest2-Tfam^-/- miševi su rođeni u očekivanim Mendelovim omjerima i nisu se mogli razlikovati od Cre kontrole iz legla vizualnim pregledom pri rođenju. Međutim, razlike u tjelesnoj težini između Six2-Tfam^-/- mutanti i kontrole srodnika iz legla Cre postali su očiti do postnatalnog dana (P) 14 (5,7 plus -0.3 g za mutante naspram 7.5 plus -0.3 g za kontrole, n=4 svaki, P =0.004; Dodatna tablica S1). Šest2-Tfam^-/- mutirani miševi karakterizirani su povećanimbubregau usporedbi s kontrolama (bubreg/omjer tjelesne težine od 1,45 posto plus -0.19 posto za mutante naspram 0.60 posto plus - 0.02 posto za kontrolu, n {{8} } svaki, P < 0,001;="" slika="" 1b,="" dodatna="" tablica="" s1)="" i="" umrli="" su="" u="" dobi="" između="" p20="" i="" p30="" (slika="" 1b).="" juvenilna="" smrtnost="" u="" kohorti="" mutanata="" bila="" je="" povezana="">bubrežnineuspjehod teške cistične bolesti s razinama dušika ureje u krvi od 68,40 plus -5.32 mg/dl za mutirane miševe naspram 16.8 2.0 mg/dl za kontrole ( n= 6 odnosno 7; P < 0.0001;="" slika="" 1b="" i="" c).="" nadalje,="" six2-tfam="" mutanti="" razvili="" su="" značajnu="" albuminuriju="" (omjer="" albumin/kreatinin="" u="" urinu="" 43,58="" plus="" -362.475,18="" mg/g="" u="" six2-tfam="" mutanti="" naspram="" 3,39="" mg/g="" u="" kontrolama="" na="" p14,="" n="6" odnosno="" 10;="" p="">< 0,0001).="" to="" je="" u="" skladu="" s="" obrascem="" ekspresije="" cre="" rekombinaze="" u="" six2="" nefronskim="" progenitorskim="" stanicama,="" koje="" dovode="" do="" cap="">bubrežnitubulima i podocitima.15 Za razliku od Six2-Tfam^-/- mutanti, miševi s heterozigotnim nedostatkom Tfam u SIX2 progenitorskim stanicama razvijali su se normalno, bili su plodni i nisu se očito razvijalibubregbolest(Dodatna slika S1).

Slika 1|Inaktivacija Tfam u stanicama loze SIX2 rezultira teškom cističnom bolešću i zatajenjem bubrega. (a) Shema koja prikazuje eksperimentalni pristup i lokaciju ciljanih sekvenci unutar Tfam floxed alela. Analiza lančane reakcije polimerazom ukupne genomske DNA bubrega izolirane iz kontrole srodnika iz legla (Cre ) i Six2-Tfam^-/-miševi u dobi postnatalnog dana (P) 7; nerekombinirajući Tfam floxed alel označen je s 2-lox (2); rekombinirani alel prema 1-lox, alel divljeg tipa prema wt; þ ili - označavaju prisutnost ili odsutnost šest2-eGFP/Cre transgena. (b) Lijevi paneli, fotografije bubrega iz kontrole Cre i Six2-Tfam^-/- miševi u dobi od P20. Težina bubrega (KW) izražena je kao postotak tjelesne težine (BW) (n= 4–14). Desne ploče, razine dušika uree u krvi (BUN) u Cre kontroli kolegu (co) i Six2-Tfam^-/-miševi u dobi P7 (n=7 odnosno 6) i Kaplan-Meierove krivulje preživljavanja za Cre kontrolu i Six2-Tfam^-/- miševa u usporedbi s log-rank testom (n=10–13). (c) Reprezentativne slike presjeka bubrega fiksiranih u formalinu i parafina iz Cre kontrole i Six2-Tfam^-/-miševi u dobi P7 i P29 obojeni hematoksilinom i eozinom (H&E) i analizirani imunohistokemijom na aktin a-glatkih mišića (ACTA2) i antigen diferencijacije klastera (CD) 31. Brojčani znakovi prikazuju cistične strukture, a zvjezdice prikazuju glomerule. Šipke ¼ 1 mm za poprečne presjeke cijelog bubrega, 100 mm za H&E slike velike snage i 50 mm za IHC slike. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost plus - SEM i analizirani su 2-tailed Studentovim t-testom. ***P <0,001. kako="" biste="" optimizirali="" gledanje="" ove="" slike,="" pogledajte="" internetsku="" verziju="" ovog="" članka="" na="">

Analiza Šest2-Tfam^-/- miševi, koji su također eksprimirali ROSA26-ACTB-tdTomato,-eGFP Cre reporter alel, ovdje označen kao Six2-mT/mG;Tfam^-/- miševa, što ukazuje da velika većina cističnih struktura uTfam^-/- bubrezi su izvedeni iz stanica s poviješću ekspresije Six2-eGFP/Cre (dodatna slika S2). Ciste u šest2-Tfam^-/- bubregapokazali su dokaze proliferacije kao što je prikazano prisutnošću Ki67-pozitivnih epitelnih stanica obloženih cistama (u prosjeku oko 40 posto svih epitelnih stanica obloženih cistama), dok stanice pozitivne na cijepanu kaspazu 3 nisu otkrivene unutar cista (dodatna slika S3 ). Ovi su nalazi u skladu s povećanim razinama fosforilirane kinaze regulirane izvanstaničnim signalom (p-ERK) i b-katenina u Six2-Tfam^-/- tkivo bubrega (dodatna slika S3). Uzeti zajedno, naši podaci pokazuju da šest2-Tfam^-/- bubrezi pokazuju molekularne značajke koje se često povezuju sbubrežnicistične bolesti.

Slika 3 |Tfam^-/-ciste ne izražavaju uobičajene markere specifične za segment nefrona. (a) Reprezentativne slike isječaka bubrega fiksiranih formalinom, u parafinu ugrađenih od šest2-mT/mG;Tfam^-/-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2 (AQP2) by immunofluorescence (IF). 4',6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 mm. (b) Reprezentativne slike isječaka bubrega fiksiranih u formalinu i parafinom od šest2-mT/mG;Tfam^-/-miševi u dobi P14 obojeni na eGFP i uromodulin pomoću IF. Zvjezdice prikazuju ciste s intraluminalnim uromodulinom. Prisutnost intraluminalnog uromodulina ispitivana je u cistama s najvećim promjerom od 50-100μm ili u cistama većim od 100 mm u maksimalnom promjeru. Šipke=(a,b) 100 mm. Kako biste optimizirali gledanje ove slike, pogledajte internetsku verziju ovog članka nawww.kidney-international.org.

cistancheje dobar zabubreg

Sazrijevanje nefrona je neispravno u Six2-Tfam^-/-miševi

Budući da može proći i do nekoliko tjedana prije nego što miševi s tkivno specifičnom inaktivacijom Tfam razviju patologiju,17 zatim smo ispitali vremenski tijekbubrežnirazvoj bolesti u Six2-Tfam^-/-miševi. Prikupili smo bubrege kontrolnih i mutiranih miševa u dobi P0, P7 i P14 i upotrijebili histološke metode, imunofluorescentno (IF) bojenje i analizu ekspresije gena u cjelinibubregizvode za procjenu. IF bojenje za SIX2 i E-kadherin u dobi P0 pokazalo je da bubrezi iz kontrole i šest2-Tfam^-/-bili su histološki slični. Formiranje struktura kortikalne nefrogene zone, kao što je mezenhim SIX2þ kapice, vrhovi uretera koji eksprimiraju E-kadherin i novonastale strukture nefrona kao što sububrežnivezikula i tijela u obliku zareza i S-oblika nije blokirana u Six2-Tfam^-/-bubrega (Slika 2a). Ovi histološki nalazi bili su u skladu s razinama ekspresije gena koji kodiraju nefrogene markere. Six2, upareni okvir 2 (Pax2), LIM homeobox protein 1 (Lhx1) i spalt-kao transkripcijski faktor 1 (Sall1) razine mRNA nisu se značajno razlikovale između kontrole i Six2-Tfam^-/- miševa ukupnobubreghomogenati iz P0bubrega(Slika 2b). To je sugeriralo da inaktivacija TFAM-a u SIX2 nefronskim progenitorima nije značajno utjecala na stvaranje nefrogenih struktura.

Iako formiranje novonastale strukture nefrona nije bilo inhibirano, bojanje alcian plavim/periodnom kiselinom–Schiff i lektinom lotus tetragonolobusa ukazalo je na neispravno sazrijevanje terminalnog nefrona u Six2-Tfam^-/-miševi u dobi P{{0}}. Alcian blue/periodna kiselina–Schiff, koja boji tubularne bazalne membrane i četkastu granicu, i lotus tetragonolobus lektin, koji identificira specifične oligosaharide u četkastoj granici proksimalnih tubulnih stanica, smanjeni su u mutiranim bubrezima. Slika 2c prikazuje bojanje alcian blue/periodna kiselina–Schiff u vremenskim točkama P0, P7 i P14. Histokemija lektina Lotus tetragonolobusa i IF bojenje za protein Wilms tumor 1 u vremenskim točkama P{{10}}, P7 i P14 prikazani su na Dodatnoj slici S4. U dobi P0, relativno područje koje je pozitivno obojeno lektinom lotos tetragonolobusa bilo je 2,10 posto, 0.51 posto i {{30}}.39 posto 0,1 posto u dobi P7 naspram 6,25 posto, 0,28 posto i 6,2 posto, odnosno 1,1 posto za kontrole (n=3–4, P=0,0004 odnosno 0,0007; dodatna slika S4). U skladu s ovim histološkim nalazima značajno je smanjenje ekspresije gena koji kodiraju markere specifične za segmente glomerula i nefrona podocin, nefrin, akvaporin 1 (Aqp1), natrij-fosfatni kotransporter 2a (NaPi2a), uromodulin, natrij-kalijev klorid kotransporter 2 ( Nkcc2) i kotransporter natrijevog klorida (Ncc) osjetljiv na tiazide u Six2-Tfam^-/-miševi (Slika 2b). Uzeti zajedno, ovi podaci sugeriraju da šest2-Tfam^-/- bubregapokazuju progresivno smanjenje broja zrelih proksimalnih segmenata nefrona i glomerula.

Budući da aktivnost Six2-eGFP/Cre rezultira segmentima nefrona koji potiču iz mezenhima kape s nedostatkom TFAM-a, predvidjeli smo da sazrijevanje epitelnih stanica CD-a, koje potječu iz pupoljka uretera, neće biti pogođeno u Six{{2} }Tfam^-/-bubrega. U skladu s ovom predodžbom je da je bojanje aglutininom Dolichos biflorus, koji reagira s N-acetil-D-galaktozom u distalnom tubulu i CD-u, ukazalo na relativnu prekomjernu zastupljenost aglutinin-pozitivnih struktura Dolichos biflorusa u Six2-Tfam^-/-bubrega. U dobi P7, pozitivno obojena područja za Dolichos biflorus aglutinin činila su 13,91 posto 0.9 posto ukupne površine za mutante naspram 1,93 posto 0.1 posto za kontrolu (n=3, P={ {10}}.0002; Dodatna slika S4). Ekspresija mRNA epitelne 1 alfa podjedinice natrijevog kanala (Scnn1a) ili akvaporina 2 (Aqp2), koji su oba izražena u CD epitelnim stanicama, nije značajno smanjena u usporedbi s kontrolom (Slika 2b). Za razliku od Six2-Tfam^-/-bubrega, inaktivacija Tfam u homeobox B7 (HOXB7) progenitorskim stanicama, koje stvaraju CD epitelne stanice, što rezultira gubitkom ekspresije CD nefronskog markera i blagom tubularnom dilatacijom, ali ne i cistogenezom (dodatna slika S5). Uzeti zajedno, naši podaci pokazuju da gubitak funkcije TFAM u SIX2 progenitorskim stanicama ne blokira razvoj novonastalih struktura nefrona, ali inhibira terminalno sazrijevanje nefrona.

Tfam^-/-ciste su manjkave u uobičajenim markerima segmenta nefrona

Za karakterizaciju histogenetskog podrijetlaTfam^-/- bubrežniciste, napravili smo IF analizeTfam^-/- bubregaat age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide sensitive sodium chloride cotransporter (distal tubule), and aquaporin 2 (CD). The majority of cysts with a maximal diameter of >50 mm did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation (Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 mm karakterizirale su intraluminalne naslage uromodulina, što je upućivalo na podrijetlo iz segmenata nefrona distalno od proksimalnog tubula i Henleove silazne petlje (Slika 3b).

Progresivne abnormalnosti u funkciji i morfologiji mtTfam^-/- epitelne stanice

Kako bismo okarakterizirali vremenski tijek metaboličkih posljedica delecije Tfam-a, prvo smo ispitali razine mRNA Tfam-a i TFAM-reguliranih mt-Co1, mt-Cyb i mt-Atp6 uTfam^-/- bubregau dobi P0, P7 i P14. Kao što se očekivalo, razine mRNA Tfam, mt-Co1, mt-Cyb i mt-Atp6 značajno su smanjene (Slika 4a).Tfam^-/-epitelne stanice označene s eGFP (šest{{0}}mT/mG; Tfam / miševi) pokazale su značajno smanjenje ekspresije proteina MT-CO1 (dodatna slika S7). Broj kopija mt DNK smanjen je za 63 posto, što je u skladu s smanjenjem mt, obilježjem nedostatka TFAM (Slika 4a). Nasuprot tome, ekspresija nuklearnih gena koji kodiraju nikotinamid adenin dinukleotid: ubikinon oksidoreduktaza jezgrena podjedinica 3 (Ndufs3) i sukcinat dehidrogenaza kompleks flavoproteinska podjedinica A (Sdha) nije bila pogođena u dobi P0, ali je smanjena u dobi P7 i P14 (Slika 4a). Ovi nalazi iz analize mt gena i proteina u skladu su s progresivnim gubitkom broja kopija mt u Tfam/epitelu.

Zatim smo istražili metaboličke učinke inaktivacije Tfam-a u primarnim epitelnim stanicama proksimalnih tubula (PTEC) izoliranim u dobi P7.Tfam^-/- PTEC-ovi su pokazali značajna smanjenja bazalnih stopa potrošnje kisika (40.77 4.10 za mutante naspram 61.75 5.18 pmol/min/104 stanica za kontrole, n=3 svaka, P =0.034), disanje povezano s ATP-om (33.11 3.91 za mutante naspram 46.92 4.91 pmol/min/104 stanica za kontrole, n{{18} } svaki, P=0.093), maksimalno disanje (116.8 14.19 za mutante naspram 225.5 13.55 pmol/min/104 stanica za kontrole, n{{ 28}} svaki, P=0.005) i rezervni respiratorni kapacitet (76.05 10.18 za mutante naspram 163.7 8.61 pmol/min/104 stanica za kontrole , n =3 svaki, P=0.003; Slika 4b).

Da bismo dalje karakterizirali stupanj smanjenja i oštećenja mt, ispitali smoTfam^-/- bubregaprijenosnom elektronskom mikroskopijom i {{0}}dimenzionalnom strukturiranom iluminacijskom mikroskopijom (3D SIM). U dobi P7, mitohondriji su pokazali nepravilne oblike i baloniranje, što je u skladu s prethodnim nalazima u Tfam nokaut miševa. Transmisijska elektronska mikroskopska analiza pokazala je da su strukturne abnormalnosti mitohondrija, kao što su povećana veličina i abnormalne kriste, napredovale postnatalno jer su morfološke razlike između mutanata i kontrole bile manje vidljive u dobi P0 i postale su ozbiljnije s godinama (Slika 4c ). 3D SIM korišten je za ispitivanje mt volumena i veličine mreže u šest2-mT/mG; Tfam / mutanti u usporedbi s šest2-mT/mG kontrolnim miševima u dobi P7; mt volumen mjeren je u poprečnim presjecima od 5 do 8 tubula po presjeku, ispitivanjem 25 do 40 eGFP-pozitivnih kortikalnih epitelnih stanica obojenih na naponski ovisan anion-selektivni kanal 1 IF bojenjem. Otkrili smo da je ukupni mt volumen po eGFP pozitivnoj stanici značajno smanjen (62.66 16.46 mm3/ stanici za mutante naspram 177.4 30.17 mm3/stanici za kontrole, n=3 svaka , P ¼ 0.0289) i bio je povezan s promjenom u omjeru ukupnog volumena mt po ukupnom volumenu stanice s 0.230 0.01 u kontrolama na 0.{{ 33}}.016 u šest2-Tfam / mutanata (n=3 svaki, P=0,0017; Slika 4c). Maksimalna veličina mt mreže, koja mjeri najveću mt mrežu koja se susreće u svim ispitanim eGFP-pozitivnim stanicama, smanjena je u šest2-Tfam^-/- bubrega(143.2 23.2 mm3 za mutante naspram 318.3 49.45 mm3 za kontrole, n=3 svaka, P=0.0327). Uzeti zajedno, ultrastrukturni i SIM nalazi te nalazi analize mt gena i proteina u skladu su s progresivnim gubitkom broja kopija mt uTfam^-/- epitel.

Cistancheje dobar zapolicistična bolest bubrega

Nedostatak TFAM-a pomiče metabolizam bubrežnog epitela prema glikolizi

PTEC-ovi ububregkoriste b-oksidaciju masnih kiselina i OXPHOS za stvaranje ATP-a i glukoneogenetski su.18 Kako bismo dobili dodatne uvide u metaboličke promjene povezane s inaktivacijom Tfam-a, proveli smo analizu RNA sekvenciranjabubregaod šest2-Tfam^-/-i kontrolni miševi Cre iz legla u dobi P7. Otkrili smo da su ključni regulacijski geni uključeni u glikolizu, kao što su heksokinaza 2 (Hk2) i enolaza 2 (Eno2), regulirani prema gore. Nasuprot tome, smanjena je ekspresija većine gena uključenih u ciklus trikarboksilne kiseline (npr. izocitrat dehidrogenaza 1 [Idh1]), kao i ekspresija gena uključenih u b-oksidaciju masnih kiselina, kao što je acetil-koenzim A aciltransferaza 1B ( Acaa1b), acil-koenzim A dehidrogenaza srednjeg lanca (Acadm) (Slika 5a i b, Dodatna slika S8). U skladu sa smanjenom ekspresijom gena uključenih u oksidacijske gene ciklusa trikarboksilne kiseline bilo je nakupljanje neutralnih lipida što je otkriveno bojenjem uljano crvenim O u smrznutojbubregodjeljci u dobi P14 (Slika 5c).

Smanjena ekspresija TFAM-a u mišjim i ljudskim PKD tkivima povezana je s deplecijom mt

Jer Šest2-Tfam^-/- bubregajako je podsjećao na PKD(policistična bolest bubrega) bubrega, zatim smo procijenili je li TFAM nereguliran u PKD-u(policistična bolest bubrega)tkiva. Prvo smo ispitali TFAM i ekspresiju gena reguliranu TFAM-om u 2 dobro utvrđena genetička PKD mišja modela. Razine Tfam mRNA značajno su smanjene u homogenatima cijelog bubrega iz Pkd^-/- i Cys^cpk/cpkmiševi, koji nose mutacije bilo u PKD1(policistična bolest bubrega)ili Cysl. To je bilo povezano sa smanjenjem ekspresije mitohondrijskih i nuklearno kodiranih mt gena, kao i disreguliranom ekspresijom glikolitičkog gena. Slično kao Six2-Tfam^-/-bubrega, PKD(policistična bolest bubrega)^-/- i Cys^cpk/cpk bubregakarakterizirani su povišenim Eno2 i Hk2 i značajno smanjenim razinama transkripta fosfoglicerat kinaze (Pgk) 1, piruvat dehidrogenaze kinaze (Pdk) 1 i Pdk4 (Slika 6a). Ekspresija proteina TFAM, procijenjena IF bojanjem, bila je smanjena u epitelnim stanicama koje oblažu ciste u usporedbi s epitelnim stanicama iz susjednih necističnih tubula (Slika 6b). To je bilo povezano sa smanjenom ekspresijom mt-Co1 i mt-Atp6 in situ hibridizacijom RNA fluorescencije (Slika 6b, Dodatna slika S9); mt volumen, kako je određeno 3D SIM-om, smanjen je za 55 posto u usporedbi s epitelnim stanicama iz susjednih, necističnih tubula ili PTEC-ovima iz normalne kontrolebubrega. Nisu pronađene razlike u volumenu mt između normalnih kontrolnih PTEC-a i PTEC-a iz necističnih tubula (Slika 6c).

Ispitati je li gubitak ekspresije TFAM-a uobičajena molekularna značajka ljudskog PKD-a(policistična bolest bubrega), analizirali smo uzorke nefrektomije 5 bolesnika s ADPKD-om imunohistokemijom, IF bojenjem, fluorescencijom RNA in situ hibridizacijom i 3D SIM-om. Smanjena ekspresija TFAM-a primijećena je u 75,2 posto plus -7.5 posto odbubrežniciste analizirane imunohistokemijski. To je bilo povezano sa smanjenom ekspresijom MT-CO1 i MT-ATP6 in situ hibridizacijom RNA fluorescencije (Slika 7a, Dodatna slika S10); mt volumen u epitelnim stanicama koje oblažu ciste smanjen je za približno 70 posto prema procjeni 3D SIM-a (Slika 7b). Uzeto zajedno, analiza 2 PKD(policistična bolest bubrega)mišji modeli i ljudska ADPKD tkiva sugeriraju da su nedostatak TFAM-a i deplecija mt uobičajeni nalazi kod PKD-a(policistična bolest bubrega)tkiva i vjerojatno će utjecati na patogenezububrežnicistična bolest.

cistanche je dobar zapolicistična bolest bubrega

Rasprava

Kliknite ovdje za informacije o dijelu II (Rasprava) ovog članka.

Izvadak iz: 'BubregNedostatak epitelno ciljanog mitohondrijskog transkripcijskog faktora A rezultira progresivnim smanjenjem mitohondrija povezanim s teškom cističnom bolešću' Ken Ishii1,2,11 et al.

---BubregInternational (2021) 99, 657–670