Sažetak

Cilj:Da bi se istražili učinciverbaskozid (VB; poznat i kao akteozid)nazacjeljivanje tetive–kostikod štakora slijedećirekonstrukcija prednjeg križnog ligamenta (ACL)., te istražiti je liJanus kinaza 2 (JAK2)/prijenosnik signala i aktivator transkripcije 3 (STAT3)uključen je signalni put.

Metode:Štakori su nasumično raspoređeni u šest skupina:Varka, Model, mala doza VB (VB‑L), srednja doza VB (VB‑M), visoka doza VB (VB‑H), iVB‑H + AG490(inhibitor puta JAK2/STAT3). Osim skupine Sham, sve su skupine bile podvrgnute rekonstrukciji ACL-a kako bi se uspostavio postoperativni model.

Mikro-CTkorišten je za procjenu parametara koštane mikrostrukture koštanog tunela i za mjerenjepovršina poprečnog presjekafemoralnog i tibijalnog tunela.

Biomehanička ispitivanjaprocijenjeno rekonstruirano koljenoukočenostimaksimalno opterećenje.

ELISAizmjereni su upalni citokini i markeri oksidativnog stresa u tekućini za ispiranje koljena.

H&E bojenjeiSafranin O–Fast Green bojenjeprocijenjena patologija hrskavice.

Imunohistokemijaprocijenjen izraz ofkolagen tipa I (COL-I)imatrična metaloproteinaza-13 (MMP13).

Western blotispitao proteine ​​koji se odnose naJAK2/STAT3put.

Rezultati:U usporedbi sa skupinom modela, VB‑L/VB‑M/VB‑H povećao seomjer površine kosti i volumena, trabekularna debljina, iBV/TV, i smanjiobedreniipovršina poprečnog presjeka tunela tibije kosti, s najznačajnijim promjenama u skupini VB-H (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB‑L/VB‑M/VB‑H also increased ukočenostimaksimalno opterećenje, opet najistaknutije u VB‑H (str<0.05P < 0.05P<0.05). ELISA showed that VB reduced TNF‑, IL-6, IL-1, iMDA, dok se povećavaTRAVNJAKiGSH‑Px, pri čemu VB-H pokazuje najjači učinak (P<0.05P < 0.05P<0.05). Histology indicated improved cartilage damage with thicker cartilage layers, more orderly chondrocyte arrangement, reduced inflammatory infiltration, increased proteoglycan content, and clearer tidemark-most evident in VB‑H. Immunohistochemistry showed increased PUK-Ii smanjio seMMP13u VB skupinama (VB‑H najjača, P<0.05P < 0.05P<0.05). Western blot indicated increased p‑JAK2/JAK2ip‑STAT3/STAT3u VB skupinama (VB‑H najjača, P<0.05P < 0.05P<0.05). Compared with VB‑H, AG490djelomično poništio ova poboljšanja.

Zaključak:Verbaskozid može potaknuti zacjeljivanje tetive i kosti kod štakora nakon rekonstrukcije ACL-a, potencijalno krozaktivaciju signalnog puta JAK2/STAT3.

Ključne riječi:JAK2/STAT3 signalni put; verbaskozid (akteozid); rekonstrukcija ACL; zacjeljivanje tetive–kosti

Uvod

Puknuće ACL-a obično je uzrokovano sportom visokog intenziteta i mehaničkom traumom, obično se manifestira bolom, brzim oticanjem zglobova, nestabilnošću i smanjenom tolerancijom na tjelovježbu - što često dovodi do velikog funkcionalnog ograničenja. Rekonstrukcija ACL-a naširoko se koristi klinički, aliuspješan postoperativni oporavak uvelike ovisi o integraciji tetive i kostina granici presatak-kost.

Posljednjih su godina istraživači istraživali višestruke strategije za ubrzavanje zacjeljivanja tetiva i kostiju, kao što sufizička stimulacija(istezanje, pritisak, vibracija), implantacija biomaterijala i upotreba citokina ili pristupa tkivnog inženjeringa. Unatoč tome, zacjeljivanje može biti sporo, a rezultati ostaju promjenjivi, što potiče interes zanovi dodatni pristupi, uključujućibioaktivni spojevi s protuupalnim, antioksidativnim i zaštitnim svojstvima za kosti.

verbaskozid (akteozid)je feniletanoidni glikozid topiv u vodi koji se nalazi u raznim ljekovitim biljkama. Prijavljeno je da izlažeprotuupalno, antioksidans, ištiti kostiaktivnosti, uključujući supresiju osteoklastogeneze i ublažavanje erozije kosti u modelima upalnog artritisa.

Ključni mehanistički kandidat jeJAK2/STAT3put, glavna unutarstanična signalna kaskada uključena u različite fiziološke i patološke procese. Prethodni rad sugerira da aktiviranje JAK2/STAT3 može povećati trabekularnu debljinu, krutost i maksimalno opterećenje u kontekstu ozljede kosti - podržavajući zacjeljivanje prijeloma.

Popis specifikacija ekstrakta cistanhe s visokim sadržajem akteozida

Služba podrške Wecistanche-Za više detalja o suradnji
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

 

 

Gdje Cistanche pristaje

Za čitatelje koji istražujuprirodne potporne strategije dobivene iz biljaka, korisno je to znatiCistanche(o kojoj se često raspravlja u tradicionalnom biljnom kontekstu) jedna je od biljaka koje se često spominju kao one koje sadržefeniletanoidni glikozidi, uključujućiakteozid (verbaskozid)u nekim preparatima. Ovo značineznači da je to dokazana ili odobrena postoperativna terapija za rekonstrukciju ACL-a - naprotiv, pruža botanički kontekst zašto je akteozid/verbaskozid privukao pozornost istraživanja. U kontroliranim životinjskim modelima kao što je ovaj u ovoj studiji, korištenje definiranog spoja (VB) omogućuje mehaničko testiranje - nešto što dodaci od cjelovitih biljaka ne mogu jamčiti zbog varijabilnosti u sastavu i dozi.

Ova studija stoga istražuje može li verbaskozid poboljšati zacjeljivanje tetive i kosti u modelu rekonstrukcije ACL-a štakora i je li taj učinak povezan sJAK2/STAT3 aktivacija.

Materijali i metode

1. Životinje

Muški štakori SPF SD (stari 7 tjedana, 200-220 g) dobiveni su iz Odjela za eksperimentalne životinje Medicinskog sveučilišta Hebei (licenca: SCXK (Hebei) 2025-005). Uvjeti držanja: vlažnost 55%–65%, temperatura 22–24 stupnja, 12-satni ciklus svjetlo/tama, slobodan pristup hrani i vodi. Studiju je odobrio Odbor za etiku životinja Medicinskog fakulteta Cangzhou (br. odobrenja . 2202130618).

2. Lijekovi i reagensi

Verbaskozid (čistoća 99,8%, HY‑N0021-107208), AG490 (čistoća 99,0%, HY-12000-09922): Shanghai Haoyuan Biopharmaceutical Technology Co., Ltd.

ELISA kompleti za TNF- (ml002859), IL-6 (ml102828), IL-1 (ml003057), SOD (EK-M26101), MDA (EK-M29370), GSH-Px (EK-M27911): Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd.

Antitijela: JAK2 (FNab04432), STAT3 (FNab08298) od Wuhan Fine Biotech; COL‑I (GTX82720), MMP13 (GTX100665), p‑JAK2 (GTX32203) iz GeneTexa; p-STAT3 (bsm-52210R) tvrtke Bioss; ‑aktin (48139) iz Nanjing Saigowe; HRP-kozji anti-zečji IgG (P0948) tvrtke Beyotime.

3. Instrumenti

Čitač mikropločica (EnVision), mikroskop (Olympus BX51), sustav za slikanje u gelu (Bio‑Rad GelDoc Go).

4. Uspostava modela, grupiranje i administracija

Modeliranje (ACL rekonstrukcija):Štakori su anestezirani intraperitonealnim 10% kloral hidratom (4 mL/kg). Učinjena je medijalna parapatelarna incizija kako bi se otkrio ACL, koji je presječen (pozitivan test ladice i Lachman). Tibijalni i femoralni tuneli izbušeni su na nativnom ACL otisku. Fiksni tetivni transplantat je provučen kroz tibijski tunel u zglobnu šupljinu i u femoralni tunel, zatim je zašiven i fiksiran na lateralno meko tkivo bedrene kosti blizu izlaza tunela. S koljenom savijenim pod 30 stupnjeva, tibijalni kraj je zašiven i fiksiran na koštani most tibijalnog tunela i okolno meko tkivo. Negativni ladičarski i Lachmanov test te dobra napetost transplantata upućuju na uspješnu rekonstrukciju. Rez je zatvoren, dezinficiran i ubrizgavan penicilin 3 dana kako bi se spriječila infekcija. Kriteriji uspješnosti: negativna ladica/Lachman i dobra napetost presatka.

Grupiranje:Korišteno je 120 štakora. Osamnaest je nasumično odabrano kao lažni (samo rez i zatvaranje). Od preostala 102 modelirana štakora, 90 ih je uspješno uspostavljeno (stopa uspješnosti 88,24%) i nasumično dodijeljeno (18 po skupini) u: Model, VB-L, VB-M, VB-H i VB-H+AG490.

Režim doziranja (jednom dnevno tijekom 8 tjedana):

VB-L/VB-M/VB-H: 50/100/200 mg/kg VB sondom + intraperitonealno fiziološka otopina u jednakom volumenu.

VB‑H+AG490: 200 mg/kg VB sondom + AG490 5.0 mg/kg intraperitonealno.

Lažna/model: jednaka doza fiziološke otopine pomoću sonde + fiziološka otopina intraperitonealno.

5. Mikro-CT

Nakon eutanazije, intaktni zglobovi koljena sa susjednom femurom i tibijom su sakupljeni i fiksirani u 4% paraformaldehidu na 4 stupnja tijekom 24 sata. Uzorci su zamotani u vlažan papir bez dlačica i skenirani mikro-CT-om od 360 stupnjeva (rezolucija od 10 μm; 70 kV; 114 μA; ekspozicija od 400 ms; 0,5 mm Al filter). Analizirani parametri:omjer površina/volumen kosti, BV/TV, trabekularna debljina; ipovršina poprečnog presjeka femoralnih i tibijalnih tunela.

6. Biomehanička ispitivanja

Rekonstruirana koljena montirana su u stroj za ispitivanje materijala. Primijenjeno je predopterećenje od 0,8 N da se ukloni labavost, nakon čega je uslijedilo ispitivanje rastezanja pri 5 mm/min dok opterećenje nije palo ~25% od vršne vrijednosti. Zabilježeno je opterećenje–pomak iukočenostproračunati.

7. ELISA za čimbenike upalnog i oksidativnog stresa u ispiranju koljena

Koljena su otvorena na suprapatelarnoj vrećici i isprana fiziološkom otopinom tri puta da se prikupi tekućina za ispiranje. Nakon centrifugiranja (2000 o/min, 15 min), supernatanti su korišteni za kvantificiranjeTNF‑, IL-6, IL-1i markeri oksidativnog stresaTRAVNJAK, GSH‑Px, MDApomoću ELISA.

8. H&E i Safranin O–Fast zeleno bojenje

Koljena su fiksirana, dekalcificirana, umetnuta u parafin, izrezana na 4 μm, deparafinizirana, rehidrirana i obojena s H&E i Safranin O–Fast Green za procjenu patologije hrskavice.

9. Imunohistokemija za COL‑I i MMP13

Nakon rutinske obrade, izvršeno je pronalaženje antigena i blokiranje. Sekcije su inkubirane s primarnim protutijelima protiv COL-I i MMP13 preko noći na 4 stupnja, zatim s HRP-konjugiranim sekundarnim protutijelima tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. DAB je korišten za razvijanje boje, obavljeno je suprotno bojenje hematoksilinom, a ekspresija je promatrana mikroskopski.

10. Western blot za proteine ​​puta JAK2/STAT3

Ukupni protein ekstrahiran je iz tkiva koljena, kvantificiran, denaturiran, odvojen elektroforezom, prebačen u PVDF i blokiran. Membrane su inkubirane s primarnim protutijelima protiv p-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3 i -aktina preko noći na 4 stupnja, nakon čega je slijedilo HRP-sekundarno protutijelo tijekom 1 sata. Trake su vizualizirane i analizirane denzitometrijom.

 

Tablica 6. Usporedba razina ekspresije proteina povezanih s signalnim putem JAK2/STAT3 u tkivima zglobova koljena svake skupine štakora (n=6n=6n=6, srednja vrijednost ± SD)

Skupina	p‑JAK2/JAK2	p‑STAT3/STAT3
Varka	0.95 ± 0.10	0.88 ± 0.10
Model	0.34 ± 0.04a^{a}a	0.25 ± 0.04a^{a}a
VB‑L	0.52 ± 0.06b^{b}b	0.43 ± 0.05b^{b}b
VB‑M	0,71 ± 0,08bc^{bc}bc	0,61 ± 0,07bc^{bc}bc
VB‑H	0,92 ± 0,10bcd^{bcd}bcd	0,83 ± 0,09bcd^{bcd}bcd
VB‑H + AG490	0.55 ± 0.06e^{e}e	0.46 ± 0.05e^{e}e

11. Statistička analiza

Podaci su bili normalno distribuirani i izraženi kao srednja vrijednost ± SD. Korišten je SPSS 29.0. Jednosmjerna ANOVA primijenjena je za usporedbe više grupa, a SNK‑q test za usporedbe parova. P<0.05P < 0.05P<0.05 indicated statistical significance.

Rezultati

1. Mikrostruktura koštanog tunela i površina poprečnog presjeka tunela

U usporedbi sa Shamom, grupa Model pokazala je padomjer površina/volumen kosti, trabekularna debljina, iBV/TV, i povećao sebedreniipovršina poprečnog presjeka tunela tibije (P<0.05P < 0.05P<0.05). Compared with Model, VB‑L/VB‑M/VB‑H increased bone microstructure parameters and decreased tunnel cross‑sectional areas (P<0.05P < 0.05P<0.05), with VB‑H being most significant. Compared with VB‑H, VB‑H+AG490 reduced these improvements and increased tunnel areas (P<0.05P < 0.05P<0.05).

2. Ukočenost koljena i maksimalno opterećenje

U usporedbi sa Shamom, grupa Model pokazala je smanjenu vrijednostukočenostimaksimalno opterećenje (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB‑L/VB‑M/VB‑H significantly increased both outcomes vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05), strongest in VB‑H. AG490 partially reversed the VB‑H benefits (P<0.05P < 0.05P<0.05).

3. Upalni citokini u ispiranju koljena

TNF-, IL-6 i IL-1 bili su povišeni u skupini modela u odnosu na Sham (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB treatment decreased these cytokines vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05). AG490 increased cytokine levels vs VB‑H (P<0.05P < 0.05P<0.05).

4. Markeri oksidativnog stresa u ispiranju koljena

Modeli štakora su se povećaliMDAi smanjio seTRAVNJAKiGSH‑Pxprotiv Shama (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB lowered MDA and raised SOD and GSH‑Px vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05). AG490 partially reversed these effects vs VB‑H (P<0.05P < 0.05P<0.05).

5. Patologija hrskavice (H&E i Safranin O–Fast Green)

H&E je pokazao ozbiljnu ozljedu hrskavice u grupi modela s gubitkom slojevite strukture, oštećenim i neorganiziranim površinskim stanicama i izraženom upalnom infiltracijom. VB skupine su pokazale明显 poboljšanje: deblja hrskavica, više kondrocita s urednim rasporedom i smanjena upala infiltracije; VB‑H je imao najjasnije poboljšanje.
Safranin O–Fast Green ukazao je na ozbiljan gubitak proteoglikana i nepravilan/odsutan plimni znak u modelu, dok je VB obnovio bojenje proteoglikana i integritet plimnog znaka; AG490 je pogoršao patologiju u odnosu na VB-H.

6. Ekspresija COL‑I i MMP13

U usporedbi sa Shamom, Model je pokazao smanjenjePUK-Ii povećanaMMP13 (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB increased COL‑I and decreased MMP13 vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05), strongest in VB‑H. AG490 partially reversed these changes (P<0.05P < 0.05P<0.05).

7. Proteini puta JAK2/STAT3

Modeli štakora smanjili sup‑JAK2/JAK2ip‑STAT3/STAT3protiv Shama (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB increased both ratios vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05), strongest in VB‑H. AG490 decreased both ratios vs VB‑H (P<0.05P < 0.05P<0.05).

 

Rasprava

Tetive povezuju mišić s kostima i bitne su za obnavljanje funkcije zgloba. U postavkama rekonstrukcije ACL-a, integracija tetive i kosti glavna je odrednica mehaničke stabilnosti i funkcionalnog oporavka. U ovom modelu, operacija je narušila mikroarhitekturu i biomehaniku kosti (niži BV/TV, trabekularna debljina, krutost, maksimalno opterećenje; veća područja tunela), što je u skladu s odgođenim sazrijevanjem sučelja.

Upala igra dvostruku ulogu u cijeljenju tetive i kosti: kontrolirani upalni odgovor može očistiti ostatke i podržati staničnu proliferaciju i stvaranje kolagena, dok prekomjerna upala potiče oštećenje tkiva, adhezije i stvaranje ožiljaka. Ovdje su TNF-, IL-6 i IL-1 značajno porasli nakon rekonstrukcije, što ukazuje na proupalno okruženje koje je vjerojatno nepovoljno za organizirano zacjeljivanje sučelja.

Oksidativni stres je jednako važan. Povišen MDA sa smanjenim SOD i GSH‑Px ukazuje na povećanu peroksidaciju lipida i smanjenu antioksidacijsku obranu. Oksidativni stres može poremetiti osteogenezu i narušiti remodeliranje matriksa. Paralelno, povećani MMP13 i smanjeni COL-I impliciraju ubrzanu degradaciju izvanstaničnog matriksa, što može odgoditi stabilizaciju sučelja tetive i kosti.

Zašto je verbaskozid (akteozid) zanimljiv u "prirodnim" strategijama

Verbaskozid je spoj biljnog podrijetla s protuupalnim i antioksidativnim svojstvima, što je u skladu s idejom da moduliranje upalnog i oksidativnog mikrookruženja može pomoći u zacjeljivanju sučelja. U ovoj studiji, VB je poboljšao mikrostrukturu kosti, smanjio proširenje tunela, povećao mehaničku čvrstoću, smanjio upalne citokine, poboljšao redoks markere, povećao COL-I i smanjio MMP13 - što sugerira koordinirani pomak prema konstruktivnom preoblikovanju, a ne destruktivnoj upali.

JAK2/STAT3 kao mehaničko čvorište

Put JAK2/STAT3 aktivira se kada izvanstanični signali vežu receptore citokina, promičući fosforilaciju JAK2, regrutiranje/fosforilaciju STAT3, dimerizaciju STAT3 i nuklearnu translokaciju za regulaciju gena uključenih u upalu, odgovor na oksidativni stres i stvaranje kostiju. Sadašnji rezultati pokazali su smanjenu aktivaciju puta nakon modeliranja, ali VB je povećao p-JAK2/JAK2 i p-STAT3/STAT3. Važno je da je blokiranje puta s AG490 djelomično poništilo prednosti VB-a u pogledu mikro-CT-a, biomehanike, markera upale/oksidacije, proteina remodeliranja matriksa i uključivanja u put koji podržava histologiju.

 

Praktični "prirodni" kontekst: Cistanche i botanički proizvodi bogati akteozidom

Za publiku zainteresiranu za strategije ljekovitog bilja,Cistanchečesto se raspravlja kao botanički izvor feniletanoidnih glikozida, uključujući akteozid/verbaskozid u nekim pripravcima. Iz prevoditeljske perspektive, ključna znanstvena točka je dadefiniranu dozu pročišćenog VBmože se mehanički potvrditi na životinjskim modelima, dok proizvodi od cjelovitog bilja mogu varirati u sastavu, metodi ekstrakcije i bioraspoloživosti. Stoga, dok je Cistanche relevantan za razgovor o botaničkim proizvodima bogatim akteozidom, dokazi u ovom rukopisu posebno podupiruverbaskozid kao spoju kontroliranom postoperativnom modelu štakora, nije klinička preporuka.

Opći zaključak:Verbaskozid može poboljšati zacjeljivanje tetiva i kostiju nakon rekonstrukcije ACL-a u štakora, potencijalno aktiviranjem JAK2/STAT3 signalizacije i poboljšanjem upalnog/oksidativnog mikrookruženja, dok pogoduje integritetu kolagenskog matriksa.

 

Reference

(Prevedeni popis sačuvan takav kakav jest iz vašeg rukopisa; mogu ih oblikovati u ciljni stil časopisa ako mi kažete časopis.)