Pacijenti podvrgnuti vaskularnoj kirurgiji s povišenim omjerom neutrofila i limfocita imaju smanjenu ekspresiju RNK komplementa neutrofila

Povišen omjer neutrofila i limfocita (NLR) u pacijenata koji su podvrgnuti elektivnoj vaskularnoj operaciji (EVS) povećao je mortalitet neovisno o perioperativnim kirurškim ishodima. Kako bismo razumjeli zašto je visok NLR povezan s većom smrtnošću, istražili smo ekspresiju transkriptoma neutrofila i limfocita kod pacijenata koji su podvrgnuti EVS-u. Uzorci krvi prikupljeni su od pacijenata koji su podvrgnuti EVS-u i zdravih davatelja za izračun NLR-a. Uzorci RNA izolirani su iz pacijentovih neutrofila i limfocita i podijeljeni u NLR_Low (<3) and NLR_High (≥3) groups (n = 6 each). Paired samples with the highest RNA integrity number (mean = 9.8 ± 0.4) were sequenced and analyzed for differential expression. Normalized data were inputted for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). There was no clinical difference between the patient groups about clinical diagnosis, age, sex, history of hypertension, lipid abnormalities, diabetes mellitus, smoking, or statin use. The mean NLR was 4.37 ± 0.27 SEM in the NLR_High and 1.88 ± 0.16 for the NLR_Low groups. Significantly differentially expressed gene sets identified in the RNA sequence data were enriched highly (P = 1E-24) in the humoral immunity and complement systems. Neutrophils from NLR_High patients downregulated complement genes (C1QA, C1QB, C1QC, C1S, C2, CR2, C3AR1, C3, C8G, and C9 and complement regulatory genes CD59, SERPING1, C4BPA, CFH, and CFI). Downregulation of gene expressions of humoral immunity and complement within the neutrophils are associated with elevated NLR. It remains to be determined whether and how these changes contribute to increased late mortality previously observed in patients undergoing EVS.

koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav

Uvod

Kardiovaskularne bolesti (KVB) vodeći su uzrok smrti u svijetu. To je velikim dijelom posljedica aterogeneze i ateroskleroze koja je, uz individualnu genetiku i prehranu, posredovana upalnim i imunološkim mehanizmima.1-3 Nedavno je diferencijalni broj leukocita (neutrofila i limfocita) došao u fokus za predviđanje kardiovaskularnih (KV) ishoda. Omjer apsolutnog broja neutrofila i broja limfocita (NLR) prepoznat je kao prediktor ukupne smrtnosti u više malih studija akutnih koronarnih intervencija,4-6 hipertenzije,7,8 i zatajenja srca.9

Tablica 1. Kliničke karakteristike pacijenata elektivne vaskularne kirurgije pregledanih RNA-seq

Prethodna istraživanja također su pokazala da je NLR prediktor dugoročnih ishoda kod pacijenata s perifernom vaskularnom bolešću.10-13 Naše retrospektivne studije o populaciji pacijenata vaskularne kirurgije podupiru ovaj zaključak. U 1 studiji na 108 bolesnika s elektivnim endovaskularnim popravkom aneurizme abdominalne aorte, nije bilo razlike u 30--dnevnoj postoperativnoj smrtnosti između NLR-a od<4 and an NLR of >4 (P = .507). However, the 1-year, 3-year, and 5-year mortality between the groups were 4.2% vs 28.1%, 15.1% vs 64.9%, and 24% vs 90%, respectively.14 In a second study of 290 asymptomatic patients undergoing prophylactic carotid endarterectomy, the risk for stroke was noted to be significantly higher (P < .0001) in patients with an NLR of >3 (n=116 pacijenata, 42,6% rizik od moždanog udara) od onih s NLR od<3 (n = 174 patients, 9.3% stroke risk).15 In a third study with 488 patients who underwent percutaneous interventions of femoropopliteal arteries, the 30-day mortality rates increased significantly (P = .005) with increasing NLR (1.4%, 4.3%, and 7.0% for low [<3], mid [3-4], and high [>4] NLR skupine).16 Bolesnici s nižim prijeoperacijskim NLR-om postigli su značajno veće preživljenje bez amputacije u 4-godišnjem praćenju (niski NLR 65,5%, srednji NLR, 37,5%, i visoki NLR, 17,6 % [P < 0,0001]).16

U ovoj studiji proveli smo RNA sekvenciranje (RNA-seq) neutrofila i limfocita pacijenata koji su se kvalificirali za elektivnu vaskularnu kirurgiju (EVS) kako bismo odredili potencijalne mehanizme za povišeni NLR. Studije su ispitivale postoji li molekularna osnova za povišeni NLR. Naša istraživanja otkrivaju da se pacijenti s povišenim NLR-om koji su imali popravak EVS-a razlikuju po vrlo značajnoj smanjenoj regulaciji imunoglobulina i gena komplementa u neutrofilima.

cistanche koristi-jača imunološki sustav

Metode

Pacijenti

Blood samples were collected from candidate patients for EVS procedures and healthy volunteers for NLR calculation and RNA sequence studies of neutrophils and lymphocytes. In screening patients for participation, any individual with an active local or systemic infection or obvious inflammatory disease was excluded from participation. Peripheral blood collection was approved by the institutional review board of University Hospitals Cleveland Medical Center (#01-06-02). Informed consent was obtained from each patient and healthy volunteer. All patients for EVS seen in the outpatient department were eligible. Patients in the study were characterized for the type of vascular surgery, age, sex, hypertension (blood pressure >130/80 mm Hg), diabetes mellitus (fasting blood glucose >100 mg/dL), status pušenja, liječenje statinima, povijest bolesti kronične opstruktivne plućne bolesti, raka, kronične bubrežne bolesti, koronarne arterijske bolesti (CAD), periferne arterijske bolesti, cerebrovaskularne bolesti i kroničnog zatajenja srca. Svim je bolesnicima urađena kompletna krvna slika s diferencijalnom slikom leukocita. Pacijenti su podijeljeni na niski NLR (NLR_Niski [<3]) and high NLR (NLR_High [≥3]) groups (n = 6 each) and healthy volunteers aged 18 to 71 years (n = 6). Eleven of 12 patients' blood was drawn before surgery. One patient had blood drawn 4 months after surgery. 

Razdvajanje krvi

Puna krv (20 mL po pacijentu) sakupljena je u vakuumske epruvete od 10 mL antikoagulirane s EDTA, a krv je odvojena unutar jednog sata od prikupljanja. Stanične populacije neutrofila i limfocita izolirane su iz 8 mL krvi upotrebom kompleta EasySep za izravnu izolaciju ljudskih stanica (STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada) i Big Easy EasySep magneta (STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada) u skladu s protokolima proizvođača. Magnet je prije toga ohlađen na ledu, a krvne stanice i reagensi lagano su pomiješani okretanjem epruvete za razliku od pipetiranja. Omjeri reagensa također su prilagođeni na sljedeći način kako bi se optimizirao oporavak: 400 mL mješavine antitijela, 400 mL magnetskih kuglica i 4 mL fosfatno puferirane fiziološke otopine dodano je u krv prije prvog odvajanja, nakon čega je slijedilo 200 mL antitijela smjese i 400 mL kuglica prije drugog odvajanja i 200 mL kuglica prije trećeg i konačnog odvajanja. Mali alikvot od 200 mL uzet je iz konačnih volumena oporavka za brojanje stanica i pripremu stakalca. Ostatak dobivenog volumena je centrifugiran na 1000 okretaja u minuti tijekom 7 minuta da se stanice talože.

Slika 1. Cijeli transkriptom RNA iz neutrofila i limfocita prikupljenih od pacijenata s NLR-om, visokim (NLR_High), niskim (NLR_Low) ili kontrolnim (NLR_Control) . Slovni kod "N" ili "L" u nazivu uzorka znači da su ili neutrofili ili limfociti bili izvor RNA. Unutar svake kategorije bilo je 6 pacijenata. Plava=smanjena razina izražaja; crvena=visoka razina izražaja.

Brojanje stanica i priprema stakalca

Stanice resuspendirane u fiziološkoj otopini s fosfatnim puferom dalje su alikvotirane, pomiješane s tripan plavim i ručno prebrojane pomoću hemocitometra. Obično je izolirano 9 × 106 do 15 × 106 neutrofila i 3 × 106 do 10 × 106 limfocita po uzorku. Predmetna stakla izoliranih stanica pripremljena su korištenjem citocentrifuge, okretana na 600 okretaja u minuti tijekom 3 minute, a zatim obojena bojom Wright-Giemsa. Čistoća svake stanične populacije određena je ručnim brojanjem, pri čemu je razlučeno najmanje 1000 stanica po stakalcu. Prosječna čistoća odvajanja neutrofila i limfocita brojanjem stanica bila je 98,3%, odnosno 96,2%. Protočna citometrija provedena je na 1 uzorku para neutrofila i limfocita i pokazala je čistoću od 90,6%, odnosno 92,2%. Ostale stanice u preparatu neutrofila su razložene na limfocite (4%), monocite (2%), eozinofile (2,3%) i bazofile (0,3%). U preparatu limfocita ostale stanice bile su neutrofili (1,2%), monociti (1,4%), eozinofili (1,2%) i bazofili (1,8%). Skupni RNA-seq podaci iz svih pojedinačnih uzoraka također su korišteni za određivanje stupnja kontaminacije monocita u staničnim pripravcima određivanjem jesu li neutrofili ili limfociti iz NLR_High ili NLR_Low uzoraka značajno povećali CD14 , CD68, CD83 ili CD163. Nezavisno od toga, RNA-seq podaci uneseni su u procjenu udjela imunoloških stanica i stanica raka (EPIC), program osmišljen za procjenu udjela imunoloških stanica i stanica raka u skupnim podacima o ekspresiji gena.17 Korišteni referentni profil osigurao je EPIC za imunološke stanice koje cirkuliraju u krvi i sadrži profil za B stanice, CD4 i CD8 T stanice, monocite, neutrofile i prirodne stanice ubojice. Prijavljeni izlaz dan je kao stanični udio po uzorku.

Slika 2. Značajno različito izraženi geni iz neutrofila i limfocita. (A) Broj značajno različito izraženih gena u neutrofilima (plavo) i limfocitima (narančasto). (B) Dijagram analize glavne komponente značajno različito izraženih gena u neutrofilima (zeleni i ljubičasti) i limfocitima (crveni i plavi) u NLR_High (krugovi) i NLR_Low (kvadratići). (C) Toplinska karta značajno različito izraženih gena iz NLR_High vs NLR_Low neutrofilne RNA. (D) Toplinska karta značajno različito izraženih gena iz NLR_High vs NLR_Low limfocitne RNA.

RNA-seq i statistička analiza

Detaljne metode za ekstrakciju i sekvenciranje RNK prikazane su u dopunskim Metodama. Kvaliteta očitavanja sekvenciranja procijenjena je, a adapter je dotjeran pomoću TrimGalore! (Babraham Institute), omotna skripta za FastQC i CutAdapt. Očitavanja koja su prošla kontrolu kvalitete usklađena su s ljudskim referentnim genomom GRCh38 pomoću softvera za usklađivanje STAR. Usklađena očitavanja obrađena su pomoću Cufflinks verzije 2.2.1 za analizu diferencijalne ekspresije pomoću GENCODE genske napomene za GRCh38, a podaci o ekspresiji na razini gena prijavljeni su u fragmentima po transkriptu kilobaze po milijunu mapiranih čitanja.18 Značajno različito izraženi geni identificirani su pomoću lažne stopa otkrića cutoff P vrijednost<.05, after the Benjamini-Hochberg correction for multiple testing. Normalized fold-change and P values for all expressed genes were then used as input for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis (GSEA) using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). Additional figures including heat maps and scatterplots were generated in R and ClustVis.

Rezultati

Karakteristike bolesnika

Šest parova uzoraka pacijenata odabrano je od 7 NLR_visokih i 9 NLR_niskih na temelju najviše kvalitete RNA u paru prema procjeni broja integriteta RNA (RIN) (Tablica 1 ). Pregledano je i šest kontrolnih uzoraka od 8 zdravih darivatelja. Kod pacijenata uključenih u studiju, srednja vrijednost ± standardna devijacija NLR za NLR_Visoki iznosila je 4,37 ± 0.66 naspram za NLR_Nizak, 1,87 ± 0. 39 (P < .0001). Srednja vrijednost ± standardna devijacija dobi pacijenata bila je 61,0 ± 17,0 godina za NLR_visoku i 64,5 ± 7,5 godina za NLR_nisku (P= 0,68). Svi osim 1 pacijenta imali su aneurizme aorte, 9 su bile torakalne/torakoabdominalne, a 2 su bile abdominalne. Oba pacijenta s aneurizmom abdominalne aorte bila su u NLR_niskoj skupini. Jedanaest od 12 pacijenata imalo je povijest hipertenzije. Četiri od 6 pacijenata u obje skupine NLR_Visoki ili NLR_Niski imali su medicinsku povijest abnormalnosti lipida. Četiri pacijenta u NLR_Visokoj i 3 pacijenta u NLR_Niskoj skupini bili su bivši pušači. Jedan pacijent u NLR_niskoj skupini bio je aktivni pušač. Pet pacijenata u NLR_High i 4 u NLR_Niskim skupinama bili su na statinima. Samo 3 pacijenta u obje skupine su bili dijabetičari. Jedan pacijent u svakoj skupini imao je povijest CAD-a, a 2 pacijenta u NLR_niskoj skupini imala su perifernu arterijsku bolest.

Slika 3. RNA-seq podaci u ovom istraživanju korišteni su kao neovisno sredstvo za određivanje druge stanične kontaminacije u pripravcima neutrofila i limfocita. Prikazani su samo podaci iz neutrofila. Provedena je EPIC analiza za procjenu udjela imunoloških stanica i stanica raka u skupnim podacima o ekspresiji gena. Ova analiza je dala postotak neutrofila, monocita, B stanica, CD4 T stanica, CD8 T stanica, prirodnih stanica ubojica (NK) i drugih stanica u pripravku neutrofila.

Cijeli prijepis

Uočili smo globalne razlike u cijelom transkriptomu pri usporedbi profila ekspresije gena između neutrofila i limfocita (Slika 1). Ovo otkriće nije bilo iznenađujuće jer je ekspresija gena specifična za stanični tip ranije bila okarakterizirana kao drugačija.19 U odjeljku neutrofila, kod pacijenata u NLR_visokoj, NLR_niskoj i NLR{{ 4}}Kontrolne skupine, bilo je mnogo gena s pojačanom regulacijom koji očito nisu bili regulirani naviše u dijelu limfocita i obrnuto. Na razini cjelokupnog transkriptoma, stanično-specifične razlike između neutrofila i limfocita bile su jasne i dominantne bez obzira na NLR ili na pacijenta ili kontrolu. Međutim, pomnijim ispitivanjem počele su se pojavljivati ​​razlike. Dijagram analize glavnih komponenti pokazao je da se kontrola NLR_bilo za neutrofile bilo za limfocite preklapa s NLR_visokim i NLR_niskim u obje stanice (dodatna slika 1). Istraživanja su potom nastojala pronaći dodatne razlike između skupina NLR_High i NLR_Low u značajno različito izraženim genima. Uočeno je da je 900 (74,5%) značajno različito izraženih gena primijećeno u neutrofilima u NLR_High naspram NLR_Low skupinama (Slika 2A). Za usporedbu, limfociti su imali samo 190 (15,7%) značajno različito izraženih gena. Dijagram analize glavnih komponenti gena NLR_High vs NLR_Low gena u neutrofilima i limfocitima otkrio je da je skupina NLR_High vs NLR_Low gena u neutrofili su se razdvojili u 2 različita područja, dok su se geni limfocita NLR_High i NLR_Low preklapali (Slika 2B). Opet, kao i s podacima o cijelom transkriptomu, NLR_Kontrola se preklapa s NRL_High i NLR_Low značajno različito izraženim genima i u neutrofilima i u limfocitima (dodatna slika 2). Većina značajno različito eksprimiranih gena u NLR_High neutrofila bila je regulirana naniže od NLR_Low (Slika 2C). Sličan, ali mnogo manji broj gena bio je smanjen u NLR_High limfocita nego kod neutrofila (Slika 2D). Ovi podaci sugeriraju da su razine NLR uglavnom povezane s promijenjenom ekspresijom gena u neutrofilima. Nadalje, trebalo ju je usporediti s pacijentima iz njegove skupine bolesti NLR_Niska, ne NLR-kontrola, jer se prva skupina jasno odvojila od NLR_Visoke, ali ne i NLR_Kontrole ( Slika 2B; dodatna slika 2).

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Prije istraživanja diferencijalne ekspresije gena i obogaćivanja skupa gena, dodatne studije karakterizirale su stupanj kontaminacije monocita u pripravku neutrofila. Koristeći RNA-seq podatke, primijetili smo da se ekspresija monocitnih markera CD14, CD68, CD83 i CD163 u NLR_High naspram NLR_Low neutrofila ili preparata limfocita nije značajno razlikovala. EPIC analiza neutrofilnih RNA-seq podataka pokazala je da su neimune stanice ("ostale stanice") i CD4 T stanice glavni kontaminanti u pripravcima neutrofila (Slika 3). Osim NLR{{10}}niskih CD4 T stanica i B stanica, nijedna druga kontaminirana stanica nije se značajno razlikovala u NLR_niskim neutrofilima u odnosu na NLR_visokim neutrofilima . U preparatu neutrofila, kontaminacija monocita prema EPIC analizi bila je samo 0.17% ± 0.05% za NLR_Nisko u odnosu na 0,1% ± 0,033% za NLR_Visoke pripreme (P=.12). Ova vrijednost pokazuje da je kontaminacija monocita bila red veličine niža kada je određena analizom podataka RNA-seq u odnosu na protočnu citometriju.

Slika 4. Dijagram raspršenih mjehurića značajno izraženih kategorija skupa gena GO za biološke procese između NLR_High i NLR_Low. Omjer k:K na apscisi je broj gena koji su značajno različito izraženi (k) u usporedbi s ukupnim brojem gena u kategoriji (K). Ordinata je značajnost obogaćenja izražena kao log (P vrijednost). (A) Skupovi GO gena izvedeni iz RNA-seq neutrofila uspoređujući NLR_High s NLR_Low. (B) GO setovi gena izvedeni iz limfocitne RNA-seq. Skupovi gena u donjem lijevom kutu oba dijagrama su najmanje značajni. Najznačajniji su skupovi gena u gornjem desnom kutu oba dijagrama.

Slika 4 (nastavak)

Kako bismo ispitali prirodu različito izraženih gena, proveli smo GSEA s kategorijama genske ontologije (GO) za biološke procese koristeći značajno različito izražene skupove gena između NLR_High i NLR_Low. Rezultati su prikazani u dijagramima raspršenih mjehurića (Slika 4). Segregacija skupova gena u gornji desni dio svakog dijagrama pokazuje (1) visok postotak gena u setovima gena koji su značajno promijenjeni i (2) visok stupanj značaja za obogaćivanje skupa gena. U našem uzorku, dijagrami raspršenih mjehurića pokazali su obogaćivanje kategorija GO komplementa i humoralnog odgovora neovisno i za neutrofile i za limfocite. U neutrofilima, skupovi gena za klasični put aktivacije komplementa, regulaciju kaskade aktivacije proteina i humoralni imunološki odgovor posredovan cirkulirajućim imunoglobulinom bili su najznačajniji s najvećim postotkom članova skupa gena koji su značajno promijenjeni (Slika 4A). Neovisno o tome, također je uočeno da identični setovi gena u limfocitima imaju visok omjer značajno promijenjenih gena i stupanj značajnosti kao u studijama neutrofila (Slika 4B).

Tablica 2. Imunološki setovi gena u neutrofilima i limfocitima

Tablica 2 navodi najznačajnije promijenjene setove imunoloških gena u neutrofilima (Tablica 2, Slika A) i limfocitima (Tablica 2, Slika B). Ova studija uspoređivala je ekspresiju gena u neutrofilima ili limfocitima između uzoraka NLR_High i NLR_Low uzoraka. Zdravi NLR_Kontrolni uzorci nisu uspoređivani jer su se njihove razine ekspresije preklapale s NLR_Visokim i NLR_Niskim uzorcima pacijenata u cijelom transkriptomu i značajno različito izraženim skupovima gena. Osim toga, zdravi NLR_kontrolni uzorci nisu bili podudarni u dobi, bolesti i kirurškom stanju (dodatne slike 1 i 2). I u neutrofilima (Tablica 2) i u limfocitima (Tablica 2), podaci su pokazali da je ekspresija skupova gena povezanih s imunološkim sustavom bila vrlo značajno različita kada se NLR_Visoki uspoređuje s NLR_Nizak . Na RNA sequ, svaka vrsta stanice ima iste nalaze kao i druga vrsta stanice. U obje ploče, razine značajnosti glavnih skupova gena maksimizirane su na P < 1E-24. Ti su podaci bili vrlo značajni bez obzira jesu li ispitivani neutrofil ili limfocit. Kako bismo se usredotočili na vrlo značajno područje sadržaja ovog istraživanja RNA-seq, ispitana je značajno različito izražena ekspresija gena imunoglobulina. Prvo, dijagram analize glavnih komponenti neutrofilnih gena pokazao je da su za NLR_High vs NLR_Low, značajno različito izraženi imunoglobulinski geni razdvojeni u 2 skupine (dodatna slika 3A). Alternativno, geni limfocita NLR_High vs NLR_Low preklapaju se (dodatna slika 3A). Zatim je uspoređena kombinirana toplinska karta ekspresije gena povezanih s imunološkim sustavom između NLR_High i NLR_Low u neutrofilima i limfocitima (Slika 5). Sveukupno, kada se ispita cijela toplinska karta, postoji očita smanjena regulacija cijele obitelji gena imunoglobulinskih gena u skupini neutrofila NLR_High u usporedbi s onom kod NLR_Low. Većina gena (69/156, 44%) bili su povezani s imunoglobulinima. Samo 12 od 156 (7,7%) gena bilo je povezano s komplementom: C1QA, C1QB, Serping1, C2, C2R, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CFH, CFD i CD59. U skupini limfocita također je došlo do smanjene regulacije većinom imunoglobulinskih gena u NLR_High kategoriji.

Skupovi gena komplementa u neutrofilima i limfocitima detaljno su prikazani u tablici 3. I u neutrofilima (tablica 3) i u limfocitima (tablica 3), ekspresija gena u 3 seta gena povezana sa sustavom komplementa značajno se razlikuje (P < 1E{{ 5}}) kada su NLR_Visoki uzorci uspoređeni s NLR_Niskim uzorcima. Ovo opažanje bilo je isto bez obzira radi li se o usporedbi RNK iz neutrofila ili limfocita. 3 skupa gena uključuju aktivaciju komplementa, klasični put aktivacije komplementa i regulaciju aktivacije komplementa. Dijagram analize glavnih komponenti neutrofilnih gena ponovno je pokazao da su za NLR_High vs NLR_Low, značajno različito eksprimirani geni komplementa razdvojeni u 2 skupine (dodatna slika 3B). Alternativno, limfocitni geni NLR_High vs NLR_Low preklapaju se (dodatna slika 3B).

Slika 5. Toplinska mapa značajno različito eksprimiranih gena u skupu gena imunoglobulina u neutrofilima (lijevo) i limfocitima (desno). Geni navedeni s desne strane svake toplinske karte članovi su imunoglobulina

Toplinska karta ekspresije neutrofila i limfocita skupa gena povezanog s komplementom uspoređujući NLR_High s NLR_Low prikazana je na slici 6. U neutrofilima, ogroman broj gena bio je reguliran naniže u NLR_Visoka naseljenost. U ovom skupu gena, slično skupu gena za imunoglobulin, većina gena (69/ 86, 80%) bila je povezana s imunoglobulinom. Samo 12 od 86 (14%) bili su komponenta komplementa i regulatorni geni (C1QA, C1QB, SERPING1, C2, CR2, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CD59, CFH i CFD). U skupini limfocita općenito, bilo je manje ekspresije gena komplementa, a geni imunoglobulina bili su nešto niže regulirani u skupini NLR_High. Budući da postoji bolje razumijevanje gena sustava komplementa u usporedbi s genima imunoglobulinskog sustava, pozornost je usmjerena na sustav komplementa kao potencijalnog kandidata za ciljne gene povezane s visokim i niskim NLR-om. Pripremljena je kompozitna toplinska karta koja uspoređuje NLR_High s NLR_Low pokazujući ekspresiju sustava komplementa i srodnih gena u uzorcima neutrofila i limfocita (Slika 7). Limfocit većinom nije sustav stanica spremnika za sustav komplementa. Većina gena komplementa nije pojačano regulirana u limfocitima. Samo su C1S, CR2, C5, C8G, C5 i CFB bili prisutni s razlikom u ekspresiji između NLR_High i NLR_Low limfocita (Slika 7). CD81 u limfocitima je tetraspanin B-stanica. Čini se da su ekspresije C1S i C8G znatno veće u limfocitnom NLR_Visoke nego one u limfocitnom NLR_Niske, slično KLKB1, genu za prekalikrein u plazmi.

Nasuprot tome, u neutrofilima, NLR_High pokazao je smanjenu regulaciju komplementarnih gena C1QA, C1QB, C1QC, SERPING1, C1R, C4BPA, C3 i C3AR1 i njihovih komplementarnih regulatornih (inhibitornih) gena CD59, CFB i CFI . Samo su geni C2 i CFD bili pojačano regulirani u bolesnika s NLR_High_N. CD59 i C9 relativno su pojačani u neutrofilnom NLR_niskom_N u usporedbi s onima u NLR_visokom_N. FGFR4 je receptor faktora rasta. CFH je bio prisutan, ali se činilo da na njega ne utječu NLR neutrofila_Visoki ili NLR_Niski. Jače je izražen u limfocitima.

koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav

Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda za jačanje imuniteta

【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Rasprava

NLR na diferencijalnom broju leukocita postao je široko korišten, jednostavan marker za prepoznavanje potencijalnih štetnih ishoda u širokom rasponu poremećaja, uključujući KVB, solidne tumore i upalne poremećaje kao što su sistemski lupus eritematozus i sistemska skleroza. U našim vlastitim retrospektivnim istraživanjima pacijenata s aterosklerotičnim CVD-om primijetili smo da pacijenti s visokim NLR-om imaju višu kasnu stopu smrtnosti nakon elektivnog popravka aneurizme aorte, višu kasnu stopu moždanog udara/smrtnosti nakon profilaktičke karotidne endarterektomije i smanjeno preživljenje bez amputacije nakon elektivna femoralno-poplitealna revaskularizacija ako im je NLR povišen.14-16 Ova istraživanja pokrenuta su kako bi se pronašla mehanička osnova za visoki NLR. limfom, multipli solidni tumori i upalni poremećaji kao što su sistemski eritematozni lupus i sistemska skleroza. U našim vlastitim retrospektivnim istraživanjima pacijenata s aterosklerotičnim CVD-om primijetili smo da pacijenti s visokim NLR-om imaju višu kasnu stopu smrtnosti nakon elektivnog popravka aneurizme aorte, višu kasnu stopu moždanog udara/smrtnosti nakon profilaktičke karotidne endarterektomije i smanjeno preživljenje bez amputacije nakon elektivna femoralno-poplitealna revaskularizacija ako im je NLR povišen.14-16 Ova istraživanja pokrenuta su kako bi se pronašla mehanička osnova za visoki NLR.

Tablica 3. Setovi gena komplementa u neutrofilima i limfocitima

Kako bismo razvili nepristran pristup mehanizmu(ima) različitih učinaka NLR-a na KV ishode, proveli smo RNA-seq na neutrofilima i limfocitima istih pacijenata. Za ovu studiju, svi pacijenti s bolešću aorte prospektivno su prikupljeni i grupirani u NLR kategorije prema svojim rezultatima. Posljednjih 6 uzoraka u svakoj od 2 vrste stanica odabrano je prema najvišoj razini njihovog RIN-a u pripremljenoj RNA uparenih uzoraka neutrofila i limfocita bez obzira na spol, dob ili prethodna medicinska stanja. Kao što se može vidjeti u tablici 1, pacijenti u skupinama NLR_High i NLR_Low bili su prilično slični i razlikovali su se samo po svom NLR-u.

Kvaliteta RNA korištene u ovoj studiji prikazana je RIN-om i potpunom segregacijom obrasca ekspresije gena između neutrofila i limfocita u svim prikupljenim skupinama pacijenata (visoki NLR, nizak NLR i kontrole) (Slika 1). Dijagram analize glavne komponente pokazuje da su NLR_kontrolni podaci bili irelevantni u ovom istraživanju jer se NLR pacijenata preklapao s NLR_Visoki i NLR_Niski u pacijentovim populacijama neutrofila i limfocita . GSEA analiza pružila je izvrstan uvid u to koji su skupovi gena obogaćeni skupovima gena GO bioloških procesa, a dijagram raspršenih mjehurića to je jasno pokazao iscrtavanjem logaritamske značajnosti u odnosu na omjer broja promijenjenih gena i ukupnog broja gena u setovima gena. Kada su pregledani, skupovi gena koji se izdvajaju iz cijelog popisa bili su oni u humoralnom (imunoglobulinskom) imunitetu i sustavu komplementa (tablice 2 i 3) na temelju omjera i statističke značajnosti u pristupu nepristranog otkrića.

Teško je raditi s velikim brojem gena imunoglobulina humoralne imunosti koji su uključeni jer važne razlike između tih gena nisu dobro poznate. Alternativno, puno se više zna o sustavu komplementa, a fokus na klasični sustav komplementa koji aktivira imunoglobulin je prepoznatljiva meta za upale i bolesti povezane s imunoglobulinima. Naši podaci sugeriraju da su geni klasične komponente komplementa C1QA, C1QB, C1R, CR1, C1S, SERPING1, C2, C4BPA, C3 C3AR1, C8G, C9 i nekoliko regulatornih gena (CD59, CFB CFI i CFH) smanjeni u neutrofilima pacijenata s visokim NLR (Slika 7). Ovi nalazi su upečatljivi iz 3 razloga. Prvo, uključeni geni su uglavnom oni koji pripadaju klasičnom putu komplementa. Drugo, kod pacijenata s visokim NLR-om, ti su geni komplementa većinom smanjeni u usporedbi s onima pacijenata s niskim NLR-om. Na kraju, više F12 se eksprimira u neutrofilima iz NLR_High nego onih iz NLR_Low uzoraka. Enzimski oblici proteinskog produkta F12 (faktor XII [FXII]) aktiviraju klasični put komplementa i neutrofila.20 Nasuprot tome, PLG, gen za plazminogen i aktivator FXII, smanjen je u limfocitima i neutrofilima pacijenata unutar NLR{ {21}}Visoka, sugerira da sama aktivacija FXII može biti regulator aktivacije komplementa.

Osim toga, pokazalo se da je klasični sustav komplementa uključen u ubrzanu KVB. Komponenta komplementa 1q (C1q) početni je čimbenik putanje komplementa, koji ima važnu ulogu u urođenom i stečenom imunološkom sustavu.21 Pokazalo se da C1q ima dvostruku ulogu, pozitivne i negativne učinke na aterosklerozu.22 U klasičnom putu komplementa, C1q ima zaštitnu ulogu u ranom stadiju ateroskleroze reguliranjem molekularnog signala makrofaga kroz put neovisan o komplementu, modulirajući unos aterogenog lipoproteina, posredujući u apoptotičnim stanicama i eliminaciji staničnih ostataka.23,24 Nedavna studija Jia et al23 ukazuje da je smanjeni C1q u serumu povezan s CAD. Druga studija koju su proveli Guo i suradnici24 pokazuje da je povećana aktivnost C1q povezana s CAD-om. Konačno, nedavne studije pokazuju da pacijenti s dijabetesom sa smanjenim C1q imaju skraćeno preživljenje.25 Ovi podaci pokazuju da ispitivanje sustava komplementa može biti važno u razumijevanju upalom posredovane patogeneze KVB.

Slika 6. Toplinska mapa značajno različito eksprimiranih gena u setu gena komplementa u neutrofilima (lijevo) i limfocitima (desno). Geni navedeni s desne strane svake toplinske karte članovi su skupa gena komplementa. RNA je iz neutrofila ili limfocita prikupljenih od pacijenata s visokim (NLR_High) ili niskim (NLR_Low) NLR. Šest pojedinačnih uzoraka iz NLR_High uspoređuje se sa 6 pojedinačnih uzoraka iz NLR_Low iz neutrofila i limfocita.

Slika 7. Kompozitna toplinska karta komplementa i srodnih gena iz neutrofila ili limfocita NLR_Visoka ili NLR_Niska. U svakoj kategoriji, kompozitna toplinska karta pripremljena je od 6 pojedinačnih uzoraka RNA-seq iz svakog tipa stanica.

Recently, a retrospective investigation of the data from the CANTOS, JUPITER, SPIRE-1, SPIRE-2, and CIRT trials on 60 087 patients was conducted to determine whether NLR predicts major adverse CV events and is modified by anti-inflammatory therapy.26 NLR modestly correlated (ie, r 2 ≤ 0.26) with interleukin 6, C-reactive protein, and fibrinogen levels but minimally with lipids.25 In all 5 trials, NLR predicted incident CV events and death in patients with NLR >3.08.26 Iako snižavanje lipida nije imalo utjecaja na NLR, protuupalna terapija s kanakinumabom, inhibitorom interleukina 1, smanjila je NLR (P < 0,0001).26 Ovi podaci sugeriraju da bi NLR mogao biti marker za KVB neovisno o lipidima i utjecaj statina. Ova ad hoc analiza višestrukih prospektivnih randomiziranih studija sugerira da bi NLR mogao biti neovisni čimbenik rizika za smrtnost kod KVB.

Postoje neka ograničenja u ovoj studiji. Naši preparati neutrofila imali su kontaminaciju od 4% limfocita i 2% monocita protočnom citometrijom. Budući da nije poznato da neutrofili sintetiziraju imunoglobulin, promjene gena za neutrofilni imunoglobin mogle bi biti uzrokovane kontaminacijom B stanica. U EPIC analizi došlo je do značajnog povećanja kontaminacije B-stanica NLR-Low uzoraka. Ovo opažanje sugerira da povećanje razine imunoglobulinskih gena u uzorcima NLR_niskih neutrofila može nastati zbog kontaminacije B-stanica. Stoga, smanjeni imunoglobulinski geni u NLR_High uzorcima mogu biti posljedica povećanog broja B stanica u NLR_Low uzorcima, a ne nužno smanjene razine imunoglobulinskih gena u NLR_High uzorcima. Isto tako, nije poznato da su neutrofili stanice koje proizvode komplement. Kontaminacija od dva posto monocitima mogla bi biti izvor gena komplementa. Međutim, koristeći podatke o RNA sequ, primijetili smo da nema značajne razlike u kontaminaciji monocitima u pripravcima neutrofila između NLR_Low i NLR_High. Nadalje, provođenje EPIC analize RNA-seq podataka pokazuje da je kontaminacija monocita bila<0.1% (<1:1000) of the neutrophil preparations, indicating that the RNA-seq was unlikely influenced by contaminating monocytes (Figure 3). The contaminating B cells in the NLR_Low samples do not influence the complement data observed. Finally, even now, it is not known that the changes we observed in complement and immunoglobulin genes are specific to vascular surgery patients with high NLR or older patients in general. NLR and genetic studies need to be performed on healthy age- and sex-matched patients without CVD.

koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav

Ukratko, glavni nalaz u ovom istraživanju je da su, u stanjima visokog NLR-a, mnogi geni komponente komplementa i neki od njihovih regulatora regulirani na niže u neutrofilima. Nejasno je sveukupno značenje i stanje aktivacije identificiranih komplementarnih gena s niskom regulacijom. Budući da su setovi gena komplementa izrazito smanjeni, nagađamo da osobe s NLR_visokim i skraćenim postoperativnim preživljavanjem imaju gubitak glavnih KV zaštitnih mehanizama koje osiguravaju sustavi komplementa. Ovu procjenu treba ispitati prospektivno u kliničkim ispitivanjima za temeljni mehanizam(e) za ovaj ishod.

Reference

1. Ross R. Ateroskleroza–upalna bolest. N Engl J Med. 1999;340(2):115-126.

2. Getz GS. Tematski pregledni niz: imunološki sustav i aterogeneza. Imunološka funkcija u aterogenezi. J Lipid Res. 2005;46(1):1-10.

3. Hansson GK, Hermansson A. Imunološki sustav kod ateroskleroze. Nat Immunol. 2011;12(3):204-212.

4. Duffy BK, Gurm HS, Rajagopal V, Gupta R, Ellis SG, Bhatt DL. Korisnost povišenog omjera neutrofila i limfocita u predviđanju dugoročne smrtnosti nakon perkutane koronarne intervencije. Am J Cardiol. 2006;97(7):993-996.

5. Tamhane UU, Aneja S, Montgomery D, Rogers EK, Eagle KA, Gurm HS. Povezanost između prijelaznog omjera neutrofila i limfocita i ishoda u bolesnika s akutnim koronarnim sindromom. Am J Cardiol. 2008;102(6):653-657.

6. Gibson PH, Croal BL, Cuthbertson BH, et al. Preoperativni omjer neutrofila i limfocita i ishod koronarne premosnice. Am Heart J. 2007;154(5):995-1002.

7. Fici F, Celik T, Balta S, et al. Usporedni učinci nebivolola i metoprolola na širinu raspodjele crvenih krvnih zrnaca i omjer neutrofila/limfocita u bolesnika s novodijagnosticiranom esencijalnom hipertenzijom. J Cardiovasc Pharmacol. 2013;62(4):388-393.

8. Karaman M, Balta S, Ay SA, et al. Usporedni učinci valsartana i amlodipina na razine vWf i omjer N/L u bolesnika s novodijagnosticiranom hipertenzijom. Clin Exp Hypertens. 2013;35(7):516-522.

9. Uthamalingam S, Patvardhan EA, Subramanian S, et al. Korisnost omjera neutrofila i limfocita u predviđanju dugoročnih ishoda kod akutnog dekompenziranog zatajenja srca. Am J Cardiol. 2011;107(3):433-438.

10. Bhat TM, Afari ME, Garcia LA. Omjer neutrofilnih limfocita u perifernoj vaskularnoj bolesti: pregled. Stručnjak Rev Cardiovasc Ther. 2016;14(7):871-875.

11. Bhutta H, Agha R, Wong J, Tang TY, Wilson YG, Walsh SR. Omjer neutrofila i limfocita predviđa srednjoročno preživljenje nakon elektivne velike vaskularne operacije: studija presjeka. Vasc Endovasc Surg. 2011;45(3):227-231.

12. Appleton ND, Bailey DM, Morris-Stiff G, Lewis MH. Omjer neutrofila i limfocita predviđa perioperativnu smrtnost nakon otvorenog elektivnog popravka aneurizme abdominalne aorte. Vasc Endovasc Surg. 2014;48(4):311-316.

13. Bath J, Smith JB, Kruse RL, Vogel TR. Omjer neutrofila i limfocita predviđa težinu bolesti i ishod nakon zahvata na donjim ekstremitetima. J Vasc Surg. 2020;72(2):622-631.

14. King AH, Schmaier AH, Harth KC, et al. Povišeni omjer neutrofila i limfocita predviđa smrtnost nakon elektivnog endovaskularnog zahvata aneurizme. J Vasc Surg. 2020;72(1):129-137.

15. King AH, Kim AH, Kwan S, et al. Povišeni omjer neutrofila i limfocita povezan je s lošijim ishodima nakon karotidne endarterektomije u asimptomatskih bolesnika. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2021;30(12):106120.

16. King AH, Kwan S, Schmaier AH, et al. Povišeni omjer neutrofila i limfocita povezan je sa smanjenim preživljenjem bez amputacije nakon femoropoplitealne perkutane revaskularizacije. Int Angiol. 2021;40(5):442-449.

17. Racle J, de Jonge K, Baumgaertner P, Speiser DE, Gfeller D. Simultano nabrajanje tipova stanica raka i imunoloških stanica iz podataka o ekspresiji gena tumora. Elife. 2017;6:e26476.

18. Trapnell C, Roberts A, Goff L, et al. Diferencijalna analiza ekspresije gena i transkripta RNA-seq eksperimenata s šeširom i manžetama. Nat Protoc. 2012;7(3):562-578.

19. Palmer C, Diehn M, Alizadeh AA, Brown PO. Profili genske ekspresije leukocita u ljudskoj perifernoj krvi specifični za stanični tip. BMC Genomics. 2006;7:115.

20. Stavrou EX, Fang C, Bane KL, et al. Faktor XII i uPAR pojačavaju funkcije neutrofila kako bi utjecali na zacjeljivanje rana. J Clin Invest. 2018;128(3): 944-959.

21. Dunkelberger JR, Song WC. Komplement i njegova uloga u urođenom i adaptivnom imunološkom odgovoru. Cell Res. 2010;20(1):34-50.

22. Speidl WS, Kastl SP, Huber K, Wojta J. Komplement kod ateroskleroze: prijatelj ili neprijatelj? J Tromb Hemost. 2011;9(3):428-440.

23. Jia Y, Wen W, Yang Y, et al. Klinička uloga kombiniranog serumskog C1q i hsCRP u predviđanju bolesti koronarnih arterija. Clin Biochem. 2021;93:50-58.

24. Guo S, Mao X, Li X, Ouyang H, Gao Y, Ming L. Aktivnost C1q komplementa u serumu povezana je s opstruktivnom koronarnom arterijskom bolešću. Front Cardiovasc Med. 2021;8:618173.

25. Cavusoglu E, Kassotis JT, Anwar A, et al. Korisnost komplementa C1q za predviđanje 10--godišnjeg mortaliteta u muškaraca s dijabetes melitusom upućenih na koronarnu angiografiju. Am J Cardiol. 2018;122(1):33-38.

26. Adamstein NH, MacFadyen JG, Rose LM, et al. Omjer neutrofila i limfocita i incidentni aterosklerotski događaji: analize iz pet suvremenih randomiziranih ispitivanja. Eur Heart J. 2021;42(9):896-903.