Urinarni egzosomi identificiraju upalne putove u akutnoj ozljedi bubrega povezanoj s vankomicinom

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Linda Awdishu 1,*, Amy Le 1, Jordan Amato 1, Vidhyut Jani 1, Soma Bal 2, Robert H. Mills 1, Marvic Carrillo-Terrazas 1, David J. Gonzalez 1, Ashita Tolwani 3, Anjali Acharya 4, Jorge Cerda 5, Melanie S. Joy 6,7, Paola Nicoletti 8, Etienne Macedo 2, Sucheta Vaingankar 2, Ravindra Mehta 2, Satish P. Ramachandra Rao 9 i u ime izravnih istražitelja †

1 Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of California, San Diego, CA 92093, SAD;a6le@ucsd.edu (AL); jegilmor@ucsd.edu (JA); vgjani@ucsd.edu (VJ); rhmills@health.ucsd.edu (RHM);mac215@health.ucsd.edu (MC-T.); djgonzalez@ucsd.edu (DJG)

2 Medicinski fakultet, Kalifornijsko sveučilište, San Diego, CA 92093, SAD; sobal@ucsd.edu (SB);emacedo@ucsd.edu (EM); svaingankar@health.ucsd.edu (SV); rmehta@ucsd.edu (RM)

3 School of Medicine, University of Alabama, Birmingham, AL 35233, USA; atolwani@uab.edu

4 Albert Einstein College of Medicine, The Bronx, NY 10461, USA; anjali2526@gmail.com

5 Albany Medical College, Albany, NY 12208, SAD; jorge.cerda82@gmail.com

6 Odjel za bubrežne bolesti i hipertenziju, Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical, Aurora, CO 80045, SAD; MELANIE.JOY@cuanschutz.edu

7 Medicinski fakultet, Sveučilište Colorado, Aurora, CO 80045, SAD

8 Medicinski fakultet Mount Sinai, New York, NY 10029, SAD; paola.nicoletti@mssm.edu

9 Odjel za staničnu i molekularnu medicinu Medicinskog sustava Sveučilišta Michigan, Ann Arbor, MI 48109, SAD; satishpr@med.umich.edu

* Dopisivanje: lawdishu@ucsd.edu; Tel.: plus 858-534-3919

† Članstvo u izravnim istražiteljima navedeno je u zahvalama.

Sažetak:

Pozadina:Vankomicin se obično koristi kao prva linija terapije za gram-pozitivne organizme kao što je Staphylococcus aureus otporan na meticilin. Vankomicinom izazvan akutnibubregozljeda(V-AKI) prijavljen je u do 43 posto bolesnika, osobito u onih s višim ciljanim najnižim koncentracijama. Precizan mehanizam ozljede kod ljudi ostaje nedokučiv, s nedavnim dokazima usmjerenim na apoptozu proksimalnih tubulnih stanica. U ovoj smo studiji istraživali sadržaj proteina u egzosomima mokraćnog sustava u pacijenata s V-AKI kako bismo dodatno razjasnili biomarkere mehanizama ozljede i potencijalnih odgovora. Metode: U analizu su uključeni uzorci urina pacijenata s V-AKI koji su bili uključeni u studiju DIRECT i koji su odgovarali zdravim kontrolama iz biorepozitorija UAB-UCSD O'Brien Center. Egzosomi su ekstrahirani korištenjem principa isključivanja otapala i taloženja izazvanog polietilen glikolom. Identitet i kvantifikacija proteina određeni su tekućinskom kromatografijom bez obilježavanja - masenom spektrometrijom (LC/MS). Prosječna vršna vrijednost kreatinina u serumu bila je 3,7 ± 1,4 mg/dL, a vrijeme dobubregozljedabio je 4.0 ± 3.0 dana. Pri otpustu je 90 posto pacijenata pokazalo djelomičan oporavak; 33 posto doživjelo je potpuni oporavak do 28. dana. Proteomske analize na pet V-AKI i 7 kontrolnih uzoraka otkrile su 2009 proteina u svim uzorcima i 251 protein značajno povezan s V-AKI (Pi-score > 1). Glavni diskriminirajući proteini bili su komplement C3, komplement C4, galektin-3-vezujući protein, fibrinogen, alfa-2 makroglobulin, imunoglobulin teška konstanta mu i serotransferin.

Zaključak:Urinarni egzosomi otkrivaju pojačanu regulaciju inflamatornih proteina nakon nefrotoksične ozljede kod V-AKI. Potrebne su daljnje studije za veliki uzorak pacijenata kako bi se potvrdili ovi nalazi za razjašnjavanje patofizioloških mehanizama i validacija potencijalnih biomarkera ozljede.

Ključne riječi:vankomicin; AKI; nefrotoksičnost; egzosomi; upala; upotpuniti, dopuna; imunološki putevi

Cistanche herbamože liječiti ozljedu bubrega

Chengdu Wecistanche imacistancheproizvodi za liječenje ozljeda bubrega

1. Uvod

Vankomicin je glikopeptidni antibiotik koji se koristi za liječenje infekcija Staphylococcus aureusom otpornih na meticilin u kritično bolesnih pacijenata. Nefrotoksičnost je ozbiljna nuspojava koja utječe na 10-20 posto liječenih pacijenata i povezana je s produženim trajanjem boravka u bolnici, 30-stopama ponovnog prijema u bolnicu po danu i 30-dnevnom smrtnošću od svih uzroka [1]. Vankomicin-povezan akutnibubregozljeda(V-AKI) ovisna je o dozi i počinje nakon 4-17 dana početka terapije. Iako je V-AKI dugo bio prepoznat kao glavna nuspojava vankomicina, mehanizmi nefrotoksičnosti ostali su nedovoljno poznati. Razumijevanje staničnih i molekularnih odgovora potaknutih vankomicinom od ključne je važnosti za razumijevanje mehanizama i razvoj strategija za smanjenje rizika od V AKI i povezanih troškova dok se maksimizira njegova učinkovitost u liječenju infekcija. Čini se da je toksični bubrežni odgovor uzrokovan izravnim učinkom vankomicina na epitel proksimalnih tubula [2]. Do danas su primijenjeni standardni toksikogenomski pristupi za proučavanje V-AKI na mišjim modelima, ali nedostaju studije na ljudima [3-5]. Životinjski modeli pokazuju da primjena vankomicina izaziva oksidativni stres koji može doprinijeti oštećenju bubrega [6,7]. Jedan od mogućih mehanizama ozljede je hvatanje lijeka u proksimalnim tubulnim stanicama budući da ga prenose organski kationski transporteri (OCT) preko bazolateralne membrane u proksimalne tubulne stanice, ali nisu identificirani aktivni mehanizmi prijenosa efluksa [6]. –8].

Egzosomi su mikrocitni vezikuli izvedeni iz membrane koji igraju ključnu ulogu u međustaničnoj komunikaciji i isporuci proteina/nukleinske kiseline i pružaju potencijal za otkrivanje novih biomarkera koji će pomoći u kliničkoj dijagnozibubregozljeda[9]. Predloženo je da egzosomi imaju veću specifičnost i osjetljivost za otkrivanje biomarkera, što se pripisuje stabilnosti uzoraka u usporedbi s transkriptomskim i proteomskim pristupima korištenjem konvencionalnih uzoraka seruma i urina [9]. U ovoj smo studiji testirali hipotezu da promjena proteina egzosoma u urinu kao odgovor na V-AKI pomaže razjasniti mehanizme ozljede i identificirati nove biomarkere među pacijentima s potvrđenom ozljedom bubrega izazvanom lijekovima. U tu smo svrhu angažirali subjekte iz studije Konzorcija bubrežne ozljede izazvane lijekovima (DIRECT), koja je međunarodna, multicentrična kohorta klinički ocijenjenih slučajeva akutne bolesti uzrokovane lijekovimabubregozljedai kontrole temeljene na populaciji za ispitivanje farmakogenomskih prediktora korištenjem povezanosti na cijelom genomu. Pojedinosti studije DIRECT opisane su u odjeljku Metode i nedavnoj publikaciji našeg laboratorija [10].

2. Rezultati

U analizu su uključeni uzorci urina 22 ispitanika, 10 slučajeva V-AKI i 12 kontrolnih. Demografski podaci pacijenata bili su slični između slučajeva V-AKI i kontrolne skupine i sažeti su u tablici 1. Kao što se očekivalo, prevalencija hipertenzije, dijabetesa i zatajenja srca bila je veća u slučajevima V-AKI u usporedbi s kontrolama (tablica 1).

Svi slučajevi V-AKI razvili su AKI stadija 2 ili višeg kako je definirano kriterijima za poboljšanje globalnih ishoda bolesti bubrega (KDIGO) (Slika 1) [11]. Početak V-AKI dogodio se 4.0 ± 3.0 dana nakon početka vankomicina. Vremenski tijek promjena kreatinina u serumu (Scr) nakon prijema u bolnicu do otpusta iz bolnice i nakon toga prikazan je na slici 1.

Slika 1. Promjene kreatinina u serumu tijekom tečaja V-AKI. Ova slika prikazuje promjene kreatinina u serumu u 10 slučajeva tijekom akutnog stanja povezanog s vankomicinombubregozljedaod prijema u bolnicu do 90. dana nakon ozljede. Vremenske točke odgovaraju vremenskim točkama studije Konzorcija za bubrežnu ozljedu uzrokovanu lijekovima (DIRECT). Kratice: SCr=serumski kreatinin, bolnica=prijem u bolnicu, predlijek=prije izlaganja lijeku, DIRI=ispunjena definicija oštećenja bubrega izazvana lijekom, DrugDC {{8} } prekid lijeka ili smanjenje doze, Nadir Scr=najniži serum nakon V-AKI, Hospital Disch= otpust iz bolnice

Osnovni čimbenici rizika u slučajevima V-AKI uključivali su sepsu (30 posto), bolest srca (30 posto), dijabetes melitus (30 posto), anemiju (20 posto), izloženost radiokontrastu (10 posto), bolest jetre (10 posto) i hipoalbuminemija (10 posto) (Slika 2).

U većini slučajeva, slučajevi V-AKI su primili epizode doziranja tri lijeka vankomicina. Dnevne doze vankomicina kretale su se od 1000 do 4000 mg. Prosječan (interkvartilni raspon (IQR)) broj dana provedenih u svakoj epizodi doziranja prikazan je na slici 3. Prosječna (standardna devijacija (SD)) najniža koncentracija vankomicina u plazmi povezana s epizodama doziranja 1-3 bila je povišena na 20,6 ± 8,1, 29,6 ± 16,3, odnosno 38,0 ± 13 mg/L. Međutim, razlika u koncentracijama između svake od epizoda nije bila statistički značajna (epizoda 1 naspram 2 p=0.5, epizoda 2 naspram 3 p=0.41)

Ostali podaci o ishodima sažeti su u tablici 2. S obzirom na težinu ozljede, 20 posto pacijenata je zahtijevalo nadomjesnu bubrežnu terapiju. Smrtnost u bolnici bila je 10 posto. Nakon otpusta iz bolnice, 90 posto pacijenata nije se oporavilo od V-AKI. Šest pacijenata imalo je Scr izmjeren 28. dana nakon ozljede, a četiri 90. dana. Do 28. dana, dva od šest (33 posto) pacijenata imala su AKD, ali niti jedan od četiri preostala pacijenta nije imao AKD do 90. dana.Bubregbiopsije su provedene u 20 posto slučajeva V-AKI (Tablica 2).

12 uzoraka koji su kvalificirani za analize nakon postavljanja filtra za usklađivanje peptida s njihovim srodnim spektrima, sadržavalo je ukupno 2009 proteina. Ovi proteini su dalje analizirani. Prvo je provedena analiza glavnih koordinata (PCoA) kako bi se usporedio ukupni proteom svakog uzorka. Ova je analiza otkrila značajno odvajanje (PERMANOVA p-vrijednost=0.037) između AKI i kontrolnih uzoraka (Slika 4), rekapitulirajući fenotip sistemske razine i na razini proteina egzosoma, čime se povećava naše povjerenje u ove skupove podataka . Snaga povezanosti između svakog proteina i statusa V-AKI rangirana je pomoću metrike pi-vrijednosti, koja kombinira značajnost p-vrijednosti s promjenom puta [12].

Slika 4. Sastav proteoma razlikuje urinarne egzosome pacijenata s V-AKI i kontrola. (A) Analiza glavnih koordinata uzorka proteoma. Bray-Curtisova metrika udaljenosti korištena je za izračunavanje razlika između uzorka proteoma i prikazan je glavni koordinatni dijagram. Razdvajanje duž osi 1 i 3 uočeno je između AKI uzoraka (crveno) i kontrolnih uzoraka (plavo). (B) Okvirni dijagram koji sažima Bray-Curtisovu udaljenost između kontrolnih i AKI uzoraka. Statističko razdvajanje između AKI i kontrolnih uzoraka prikazanih u (A) testirano je korištenjem permutacijske analize varijance testa (PERMANOVA). Prikazani su dijagrami koji sažimaju rezultate pri usporedbi udaljenosti kontrolnih ili AKI uzoraka s kontrolnim uzorcima.

Zatim, binarne usporedbe između V-AKI i kontrolnih uzoraka dale su 42 proteina značajno povezana s fenotipom AKI i 26 proteina povezanih s kontrolnim fenotipom (Pi rezultat > 1) (dodatna tablica S1). Dijagram vulkana koji ilustrira značaj i promjenu nabora povezanih sa svakim proteinom prikazan je na slici 5A. Glavni diskriminirajući proteini za slučajeve V-AKI bili su fibrinogen, komplement C3, komplement C4, galektin-3-vezujući protein, alfa-2 makroglobulin, imunoglobulin teška konstanta mu i serotransferin (Slika 5B). Analiza obogaćivanja skupa gena provedena je među značajnim proteinima kako bi se identificirale kategorije proteina promijenjenih u bolesnika s V-AKI, a rezultati su sažeti u Dodatnoj tablici S1. Pokazalo se da nekoliko proteina koji su bili povezani s AKI-fenotipom imaju funkcije povezane s upalom i/ili posredovanjem upalnog fenotipa. Kako bi se testiralo mogu li ove promjene proteina biti povezane s promjenama u osnovnoj signalizaciji citokina, izveden je zaključak o citokinu, koji je ukazao na snažnu vezu između proteina povezanih s AKI i citokina IL10, IL6 i TNF. Ovi citokini sadržavali su 2,8, 2,3 i 21-puta više veza s proteinima povezanim s AKI nego s proteinima povezanim s kontrolom, kao što je sažeto prikazano na slici 5C. Mreže protein-protein interakcija proteina povezanih s AKI-om i pretpostavljenih citokina pokazale su pretežno proupalne veze među proteinima povezanim s AKI-om kao što je sažeto prikazano na slici 5D.

Slika 5. Povezanost razine proteina s V-AKI. (A) Dijagram vulkana koji prikazuje značaj promjene nabora i t-testa svakog proteina za V-AKI status. Prvih 10 proteina povezanih s AKI i kontrolnim statusom prikazani su plavom i crvenom bojom. Ostali povezani proteini na temelju Pi rezultata > 1 prikazani su žutom bojom. (B) Pi rezultat, koji uzima u obzir značajnost promjene nabora i t-testa, izračunat je za svaki protein i proteini s najjačim vezama su nacrtani. (C) Topcitokini povezani s AKI ili kontrolnim proteinima. Primijenjen je mrežni pristup zaključivanju citokina i prikazani su citokini koji pokazuju najjače rezultate obogaćivanja bilo prema AKI-u bilo prema proteinima povezanim s kontrolom. Crvene trake predstavljaju citokine povezane s proteinima povezanim s AKI, plave trake predstavljaju citokine povezane s proteinima povezanima s kontrolom. (D) Mreža protein-protein interakcija proteina povezanih s AKI-om i pretpostavljenih citokina obogaćenih AKI-om. Vanjski rub proteinskih čvorova obojen je ovisno o povezanosti s pro ili protuupalnim citokinima. Veličina svakog čvora predstavlja snagu statističke povezanosti svakog proteina s AKI statusom.

Cistanche tubulosamože liječiti ozljedu bubrega

3. Rasprava

Izvještavamo o novom pristupu korištenja urinarnih egzosoma za informiranje patofizioloških mehanizama uključenih u lijekom izazvanebubregozljedakoristeći vankomicin kao prototip bubrežnog toksikanta. Jedna od prednosti ove studije je uključivanje dobro karakteriziranih podataka na razini bolesnika iz studije DIRECT [10] razvijene za razjašnjavanje mehanizama uključujući genomiku lijekova induciranihbubregozljeda. Ispitanici sa stadijem 2 ili višim AKI bili su izloženi konvencionalnim čimbenicima rizika na početku. Svi subjekti studije imali su značajno povišene najniže koncentracije vankomicina u plazmi unatoč tome što su primali dnevne doze manje od općeprihvaćenog praga nefrotoksičnosti od 4 g dnevno [13]. Mnogi ispitanici nisu se potpuno oporavili od V-AKI pri otpustu iz bolnice i imali su akutnu bolest bubrega mjesec dana nakon ozljede. Kao što se očekivalo, malo je pacijenata primilo biopsiju bubrega.

Proteomika urinarnih egzosoma/izvanstaničnih vezikula (EV) pokazala je da ciljani diskriminirajući proteini za slučajeve V-AKI uključuju C3 komplement, C4 komplement, galektin-3-vezujući protein, fibrinogen, alfa-2 makroglobulin, imunoglobulin teški konstantni mu i serotransferin. Ovi nalazi egzosoma informiraju mehanizme ozljede na subcelularnoj/supra-molekularnoj razini za V-AKI i potencijalno služe kao biomarkeri duž kontinuuma procesa bolesti izazvane lijekovima.

Egzozomi, prisutni u krvi i urinu, imaju važnu ulogu u međustaničnoj komunikaciji, koagulaciji i upravljanju otpadom [14]. Nakon akutnog stanja povezanog s toksinimabubregozljeda, egzosomi otpušteni iz tubularnih epitelnih stanica mogu prenijeti signale ozljede za regrutiranje infiltracije makrofaga i promicanje tubulointersticijske upale [15]. Zaključili smo da bi se sadržaj proteina u egzosomima razlikovao između slučajeva V-AKI i zdravih kontrola. Dvjesto pedeset i jedan protein bio je disreguliran u V-AKI, a činilo se da su oni pretežno uključeni u upalne i koagulacijske putove. Među ovih 251 proteina, naša je analiza pokazala da su C3 komplement, C4 komplement, protein koji veže galektin-3-, fibrinogen, alfa-2 makroglobulin, imunoglobulin s teškom konstantom mu i serotransferin bili značajno povezani sa slučajevima V-AKI.

Na temelju naših rezultata da su C3 i C4 bili među najboljim diskriminirajućim V-AKI egzosomskim proteinima, predlažemo da je aktivacija sustava komplementa uključena u oštećenje bubrežnih tubula izazvano vankomicinom. To se također dobro slaže s objavljenom literaturom da aktivacija sustava komplementa igra ulogu u glomerulonefritisu imunološkog kompleksa i nizu različitih bubrežnih bolesti [16]. Oštećenje bubrega posredovano aktivacijom komplementa u AKI zbog ishemije ili izloženosti nefrotoksinu povezano je sa sustavnim upalnim događajima koji pokreću i doprinose ozljedi udaljenih organa i smrtnosti pacijenata [17]. U modelima ishemijsko-reperfuzijske (IR) ozljede, hipoksija, smanjenje ATP-a i oštećenje mitohondrija rezultiraju stvaranjem slobodnih kisikovih radikala nakon reperfuzije [18]. Citokini, kemokini i aktivacija komplementa pojačavaju upalu, dovodeći do akutne ozljede tubula. Osim toga, miševi s nedostatkom receptora C3a i C5a zaštićeni su od IR ozljeda [19,20]. Pokazalo se da IR ozljeda pojačava lokalnu proizvodnju komponenti komplementabubregendotelne i tubularne stanice [16,21]. Nekoliko studija na životinjskim modelima i ljudima identificiralo je povećano taloženje proteinskih proizvoda komplementa kao što su C3 i C4 duž tubularne bazalne membrane nakon traume ili ozljede ububreg. Nije utvrđeno da su ove povećane razine taloženja značajno prisutne u peritubularnoj regiji ili regiji glomerula, ali su jako koncentrirane u tubularnoj membrani, kao što se vidi u biopsijama bubrega ljudi i životinjskih modela [17]. Egzosomi i EV mogu prenositi cirkulacijske komponente komplementa kada je aktivacija komplementa disregulirana [22,23]. Nekoliko staničnih eksperimenata i kliničkih opažanja potvrdilo je da oslobođeni EV nose i moduliraju proteine ​​komplementa i, istovremeno, njihova proizvodnja u upalnim uvjetima također može utjecati na broj cirkulatornih vezikula [23]. Ova međuovisnost dvaju procesa dovodi do zaključka da EV-ovi pokazuju potencijal izvora biomarkera, ciljeva i terapeutskih sredstava za isporuku komplementa i imunomodulatornih spojeva koji su vrlo relevantni u opsegu upalnih mehanizama AKI. Naše otkriće da uzorci V-AKI u usporedbi sa zdravim kontrolama pokazuju ulogu imunoloških odgovora na izravnu toksičnost vankomicina u stanicama bubrežnih tubula. Uz sve gore navedene sadržaje proteina, egzosomi/EV izvedeni iz urina također predstavljaju potencijalne neinvazivne biomarkere kao alternativu biopsiji bubrega za otkrivanje i informiranje o ulozi sustava komplementa u lijekovima induciranombubregozljeda.

Iako su se mnoge prethodne studije (pogledajte sljedećih nekoliko rečenica za posebne reference) usredotočile na ulogu galektina-3 (Gal-3) ububregozljeda, malo je podataka o proteinu koji veže galektin-3 (Gal-3-bp). Gal-3 se eksprimira u sabirnim tubulima bubrega i djeluje tako da potiče nefrogenezu, modulira interakcije stanica-stanica i stanica-matriks te regulira upalu [24-26]. Henderson i sur. pregledao je ulogu Gal-3 u upali i otkrio da je Gal-3 ključna komponenta u kroničnoj upali i ako se ozljeda tkiva ponavlja. Olakšava "ograđivanje" ozljede tkiva, odgađajući širenje ozljede [27]. Nadalje, Nishiyama et al. pokazali su kod štakora s ishemijskim AKI da je Gal-3 mRNA regulirana na gore, a sljedeća reperfuzija, imunohistokemija otkrila je povećani Gal-3 u segmentima nefrona [25]. Tsuchiyama i sur. otkrili su da je primjena Gal-3 štakorima s nefrotoksičnim serumskim nefritisom dovela do smanjenja izlučivanja proteina mokraćom, stvaranja polumjeseca i smanjene infiltracije makrofaga u glomerule [28]. To sugerira da nakon ishemijske ili imunološki posredovane ozljede Gal-3 igra ulogu u regeneraciji. Kao srodni partner Gal-3, temeljna uloga Gal-3-bp i razlog njegove pojačane regulacije u nefrotoksičnim ozljedama uzrokovanim vankomicinom i drugim agensima, bit će imperativ u fokusu budućih istraživanja.

Naša je studija također otkrila da su sve tri podjedinice fibrinogena disregulirane, što se dobro slaže s prethodno objavljenim podacima. Fibrinogen je topljiva dimerna molekula plazme, a svaki dimer se sastoji od tri polipeptida: alfa, beta i gama [29]. Ima ključnu ulogu u hemostazi i koagulaciji, ali se također pokazalo važnim u regulaciji stanja posredovanih upalom [30-32]. Ajay i sur. pokazalo je da je dostupnost fibrinogena važna za rad bubrega, upalu i preživljavanje [33]. Nadalje, fibrinogen može imati antiadhezivni učinak na epitelne stanice bubrega koji može biti koristan jer pomaže u sprječavanju tubularne opstrukcije [34]. Fibrinogen je značajno povećan i reguliran prema gore u AKI i prethodno je procijenjen kao potencijalni biomarker za rano otkrivanje AKI [29]. Hoffman i sur., proučavali su promjenu u fibrinogenu nakon ishemije/reperfuzije i primjene cisplatina u štakora, a mRNA je pojačana 30 minuta nakon obostrane IR ozljede i dosegla je vrhunac 48-72 h, dok je kod primjene cisplatina ekspresija mRNA fibrinogena bila povećana. otkriven u 24 h [29]. Fibrinogen u mokraći otkriven je već 3 sata nakon ishemijske reperfuzijske ozljede i 24 sata nakon primjene cisplatina, što odgovara velikim porastimabubregozljedamolekula 1 (KIM-1) [29].

Cistanche koristi: može liječitiozljeda bubrega

Povijesno gledano, opće su prihvaćena dva različita patofiziološka mehanizma za V-AKI, akutna tubularna nekroza zbog izravnih toksičnih učinaka i akutni intersticijski nefritis. Bubrežni proksimalni tubularni epitel prolazi kroz gubitak cjelovitosti citoskeleta, nekrozu i apoptozu u akutnoj tubularnoj nekrozi [35]. Nekrotične stanice oslobađaju molekule koje pojačavaju urođeni imunološki sustav izazivajući upalu i ubrzavajući ozljedu tubula [35]. U trenutnoj studiji pokazali smo upalne markere u urinarnim EV-ovima pacijenata s V-AKI. Osim toga, pronašli smo proupalni odnos između citokina IL10, IL6 i TNF-a i naših vrhunskih proteina koji razlikuju AKI. Uzeti zajedno, ovi podaci sugeriraju da je patofiziologija V-AKI tubularna toksičnost s pojačanom regulacijom upale tijekom razdoblja od 24 do 72 sata nakon ozljede.

Postoji nekoliko ograničenja naše studije. Mala veličina uzorka od 22 pacijenta koji su bili muškarci i pretežno bijelci ograničava mogućnost generalizacije naših nalaza na druge spolove, rase i etničke pripadnosti. Drugo ograničenje naše studije bilo je to što je uzorak egzosoma u urinu svakog pacijenta imao različite količine ukupnih proteina, što je otežavalo mjerenje specifičnih proteina, posebno onih s nižim apsolutnim količinama. Iako to nije nužno ograničenje ove studije samo po sebi, budući da je sposobnost svakog pojedinca da pakira proteine ​​u svoje egzosome u urinu prirodno promjenjiva, niže količine proteina kod nekih pojedinaca ograničavaju našu sposobnost za daljnje analize i izvođenje smislenih zaključaka koji se mogu generalizirati na veće populacije. Treće ograničenje je uzorak jedne vremenske točke koji ograničava naše razumijevanje staničnih promjena koje se događaju u različitim fazama kontinuuma AKI, npr. faza neposredne ozljede, faza popravka itd. Sekvencijalno uzorkovanje će unaprijediti naše razumijevanje vremenskog tijeka sadržaja egzosoma promjene, oksidativni stres izazvan nakupljanjem lijeka i regulacija imunoloških putova u oporavku. Trenutna studija uključivala je pacijente kako je definirano Scr pragovima. Serumski kreatinin je nesavršen biomarker funkcije bubrega budući da povišenje Scr često kasni za ozljedom [36]. To ograničava osjetljivost i specifičnost Scr za rano otkrivanjebubregozljeda[36], a pojavile su se studije koje identificirajububregozljedabiomarkeri kao što sububreg ozljedamolekula 1 (KIM1) i lipokalin povezan s neutrofilnom želatinazom (NGAL) za rano otkrivanje nefrotoksičnosti [37,38]. Kao što je ranije objavljeno, biomarkeri imaju potencijal za otkrivanje i otvorenih i subkliničkih razina lijekom izazvanihbubregozljeda[39,40].

4. Materijali i metode

4.1. Odabir pacijenata

U analizu su uključeni uzorci urina 10 pacijenata s V-AKI, koji su bili uključeni u studiju DIRECT [10] i 12 zdravih kontrolnih uzoraka urina iz biorepozitorija UAB-UCSD O'Brien centra. Kontrolni subjekti bili su usklađeni prema spolu, rasi i desetljeću starosti s ispitanicima i nisu bili izloženi vankomicinu ili poznatimbubregozljeda. Studija DIRECT međunarodna je studija koja ispituje farmakogenetske prediktore lijekova izazvanihbubregozljedakorištenjem studije povezanosti slučajeva i populacijskih kontrola na cijelom genomu [10]. Studiju DIRECT odobrio je institucionalni istraživački odbor (IRB #121651) i dobiven je pisani informirani pristanak od svih sudionika prije upisa, što je uključivalo i korištenje pohranjenih uzoraka za buduće analize. AKI je definiran u DIRECT-u kao naglo smanjenje funkcije bubrega prikazano bilo kojim od sljedećih kriterija: (1) apsolutno povećanje serumskog kreatinina (Scr) (veće ili jednako 0,3 mg/dL ili veće ili jednako 26,4 µmol/ L) (unutar 48-h vremenskog okvira) od referentne vrijednosti Scr, (2) postotak povećanja Scr od Većih ili jednakih 50 posto (1,5 puta od referentne vrijednosti) unutar sedam dana, (3) smanjenje količine urina učinak (dokumentirana oligurija<0.5 ml/kg/h="" for="">6 h) unatoč odgovarajućoj reanimaciji tekućinom kada je primjenjivo, (4) apsolutno smanjenje Scr od veće ili jednako 0,3 mg/dL ili veće ili jednako 26,4 µmol/L (unutar 48- h vremenski prozor) od referentnog Scr, i (5) relativno smanjenje Scr veće od ili jednako 50 posto (1,5 puta od referentnog) unutar sedam dana. U studiju su bili uključeni pacijenti sa stupnjem 2 AKI ili višim nakon izlaganja vankomicinu. Klinički podaci uključujući demografiju, povijest bolesti, nalaze fizičkog pregleda, vitalne znakove, kemijske analize krvi i urina, rezultate biopsije i podatke o doziranju lijeka prikupljeni su u sljedećim vremenskim točkama: (1) prijem u bolnicu, (2) početak liječenja vankomicinom, ( 3) vrhunac ozljede, (4) prekid primjene lijeka ili smanjenje doze, (5) rješavanje ozljede, (6) otpust iz bolnice, (7) 28 dana - i (8) 90 dana nakon ozljede. Epizoda doziranja vankomicina definirana je kao promjena doze ili učestalosti. Akutna bubrežna bolest (AKB) definirana je kao postojanost stadija 1 AKI ili većeg više od ili jednako 7 dana nakon izlaganja [41]. Pacijenti su kategorizirani s AKD-om pri otpustu iz bolnice ako je AKI stadija 1 ili više postojao i vrijeme od izloženosti do otpusta iz bolnice bilo je dulje od sedam dana. Uzorci urina i cijele krvi uzeti su od svih sudionika. O svim slučajevima V-AKI presudila su dva neovisna nefrologa (EM, JC, RL) kako bi se utvrdila uzročnost. Potpuni opis metoda već je objavljen [10].

4.2. Priprema egzosoma i prikupljanje proteomskih podataka

Uzorci urina i krvi prikupljeni su od sudionika DIRECT studije i uzorci su zamrznuti na -80 ◦C prije pripreme egzosoma. Uzorci urina korišteni u ovoj analizi odabrani su iz vremenskog razdoblja najbližeg oštećenju bubrega u rasponu od 24 do 72 sata nakonbubregozljeda. Egzozomi su ekstrahirani iz smrznutih uzoraka urina AKI korištenjem internog protokola razvijenog na temelju principa isključivanja otapala korištenjem taloženja izazvanog polietilen glikolom (PEG), kako je opisano u Rao et al. stranica nedavne objave [42] egzosomalnih proteina učinjena je prije tripsinizacije gela upotrebom NuPAGE bisTris10 posto akrilamidnog gela s 12 jažica za razdvajanje 40 µL proteina iz egzosoma kontrolnih i AKI uzoraka urina.

Ekstrakti gela kombinirani su s puferom za sprječavanje proteolize koji je sadržavao 75 mM NaCl (Sigma, St. Louis, MO, SAD), 3 posto natrij dodecil sulfata (SDS, Fischer, Arnold AFB, Tullahoma, TN, SAD), 1 mM NaF (Sigma, St. Louis, MO, SAD), 1 mM beta glicerofosfat (Sigma, St. Louis, MO, SAD), 1 mM beta-glicerofosfat (Sigma, Sigma, St. Louis, MO, SAD), 1 mM natrij ortovanadat (Sigma, St. Louis, MO, SAD), 10 mM natrij pirofosfat (Sigma, St. Louis, MO, SAD), 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF, Sigma) i 1× kompletna mini EDTA tableta slobodnog inhibitora proteaze sve u 50 mM HEPES (Sigma, St. Louis, MO, SAD), pH 8,5. Za denaturaciju proteina dodan je jednaki volumen 8 M uree u 50 mM HEPES-a, pH 8,5 i sonikacija je izvedena korištenjem dva 10- intervala s amplitudom od 25 posto. Proteini su reducirani, alkilirani i ugašeni korištenjem ditiotreitola i jodoacetamida, kao što je prethodno opisano [43]. Proteini su taloženi dodavanjem trikloroctene kiseline (Sigma, St. Louis, MO, SAD) uzorcima na ledu i taloženjem proteina centrifugiranjem na 4 ◦C. Proteinske pelete su dva puta isprane ledeno hladnim acetonom. Proteinske pelete su osušene na 56 ◦C tijekom 30 minuta, zatim resuspendirane u 1 M uree u 50 mM HEPES-a, a zatim digestirane preko noći na sobnoj temperaturi sa 6 µg LysC (Wako, Richmond, Commonwealth of Virginia, SAD), a zatim {{27} }h digestija s tripsinom stupnja sekvenciranja (Promega, Fitchburg, WI, SAD) na 37 ◦C. Uzorci su odsoljeni kroz C18 Sep-Paks i kvantificirani su proteini [44]. Ukupno 1,0 ug proteina po uzorku analizirano je tekućinskom kromatografijom-tandemom masene spektrometrije (LC-MS [2]) korištenjem gradijenta tekućinske kromatografije od 85 minuta na Easy-nLC 1000 (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, SAD) povezan u liniji s spektrometrom mase Orbitrap Fusion (Thermo Fischer Scientific).

Kromatografija je provedena na stupcu od 30 cm koji je izvučen iz kuće i napunjen je trostruko s 0.5 cm, 0.5 cm i 30 cm 5 µm C4, 3 µm C18, odnosno 1,8 µm C18, i zagrijani na 60 ◦C. Peptidi su najprije napunjeni pri 500 bara nakon čega je uslijedio kromatografski gradijent u rasponu od 6 do 25 posto acetonitrila tijekom 70 minuta nakon čega je slijedio 5-min gradijent do 100 posto acetonitrila, koji je držan 10 minuta. Ionizacija elektrosprejom provedena je primjenom 2000 V kroz T-spoj od nehrđajućeg čelika koji povezuje analitičku kolonu i Easy-nLC sustav. Nakon svakog uzorka uslijedila su dva ispiranja počevši s gradijentom od 3 do 100 posto acetonitrila tijekom 15 minuta s dodatnih 10 minuta na 100 posto acetonitrila. Raspon mase do naboja (m/z) od 375-1500 skeniran je za peptide sa stanjima naboja između 2-6. Centroidizirani podaci korišteni su za kvantifikaciju vrhova. Akvizicija je provedena u modu pozitivnih iona ovisnom o podacima. Neobrađeni spektri pretraženi su u Proteome Discoverer verziji 2.1 prema UniProt (www.uniprot.org (pristupljeno 5. studenoga 2017.)) referentnoj bazi podataka za Homo sapiensa korištenjem Sequest algoritma [18] uz obrnuti pristup bazi podataka koji se koristi za kontrolu peptida i lažnih otkrića stope (FDR) na 1 posto [17]. In silico probava tripsina kako je navedeno u parametrima pretraživanja uz minimalnu duljinu peptida od šest aminokiselina. Postavke pretraživanja također su uključivale dinamičku modifikaciju za oksidaciju metionina i statičku modifikaciju karbamidometilacije cisteina. Tolerancija mase prekursora postavljena je na 50 ppm, a tolerancija mase fragmenta na 0,6 Da.

Osim spektralnih podudaranja i proteina na koje je ograničeno<1% fdr,="" peptide="" matches="" were="" further="" screened="" to="" only="" include="" peptide="" spectral="" matches="" (psms)="" identified="" with="" high="" confidence.="" the="" summed="" abundance="" of="" the="" area="" under="" the="" curve="" of="" ms1="" peaks="" associated="" with="" psms="" was="" used="" to="" represent="" protein="" abundances.="" to="" help="" account="" for="" run-to-run="" variation="" in="" lc-ms2="" experiments,="" the="" raw="" protein="" abundances="" were="" next="" normalized="" by="" a="" two-step="" process.="" in="" the="" first="" step,="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" average="" abundance="" of="" a="" given="" protein="" throughout="" the="" experiment="" divided="" by="" the="" median="" of="" the="" protein="" averages="" observed="" throughout="" the="" experiment.="" in="" the="" second="" step,="" the="" adjusted="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundances="" observed="" within="" their="" respective="" samples="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundance="" observed="" in="" the="" entire="" experiment.="" records="" of="" the="" normalization="" and="" analysis="" of="" proteomics="" data="" are="" available="" in="" a="" jupyter="" notebook="" form="" at="">

4.3. Analiza podataka o proteomici

Zapisi analize proteomičkih podataka preneseni su u Jupyter notebook format na Github repozitorij (pristupljeno 3. ožujka 2021.)). Analiza osnovnih koordinata (PCoA) provedena je pomoću Qiime2 (verzija 2019-7) [45]. Naredba core-metrics vremenske raznolikosti korištena je za izračunavanje udaljenosti između uzoraka pomoću Bray-Curtisove metrike i vizualizacije pomoću PCoA. Statistička analiza udaljenosti između kontrolnih i V-AKI uzoraka provedena je korištenjem parnog PERMANOVA testa kroz naredbu "qiime diversity beta-group significance". Boxplot vizualizacija ovih rezultata stvorena je putem paketa seaborn (pristupljeno 3. ožujka 2021.)). Binarne usporedbe slučajeva V-AKI i kontrolnih subjekata provedene su pomoću paketa scipy ((pristupljeno 3. ožujka 2021.)) pomoću neovisnog t-testa s nejednakom varijancom. Snaga povezanosti između svakog proteina i statusa V-AKI rangirana je pomoću metrike pi-vrijednosti koja kombinira značajnost p-vrijednosti s promjenom puta [12]. Kao što je prethodno opisano [46], najbolje rangirane, značajne povezanosti definirane su kao one koje imaju pi-vrijednost > |1|. Svaka povezanost proteina sa statusom V-AKI ucrtana je u dijagram vulkana kako bi se dodatno istaknula lokacija najbolje-10 rangiranih proteina. Analiza obogaćivanja skupa gena provedena je korištenjem DAVID poslužitelja [47], uspoređujući značajne proteine ​​(pi-vrijednost > |1|) s pozadinom svih proteina identificiranih u skupu podataka. Skupine povezanih funkcionalnih obogaćenja prikazane su u Dodatnoj tablici S1.

To test for a relationship between V-AKI-associated proteins and inflflammatory cytokines, a recently developed network-based cytokine inference approach was utilized [48]. Briefly, a list of cytokines (TGFb, TNF, IFN, IL1-40, CXCL1-16, CCL1-27) was submitted alongside signifificantly altered proteins (pi-value > |1|) to the STRING-db tool [49]. Connections between proteins were determined using all interaction sources and a minimum interaction score >0.4. Citokini su najprije filtrirani kako bi imali najmanje pet veza sa značajno promijenjenim proteinima. Zatim je udio veza između svakog citokina i proteina povezanih s V-AKI ili kontrolom povezanih s ukupnim brojem veza između proteina povezanih s V-AKI ili kontrolom. Kako bi se uzele u obzir razlike u broju veza koje svaki citokin ima s drugim proteinima, ova vrijednost je zatim uspoređena s brojem veza koje svaki citokin ima sa svim značajno promijenjenim proteinima. Rezultati obogaćivanja za odabrane citokine su nacrtani za njihovu povezanost s V-AKI- ili kontrolnim proteinima. Konačno, profinjena pretraga proteina povezanih s V-AKI i citokina s obogaćenim vezama s proteinima povezanim s V-AKI vizualizirana je za njihove interakcije pomoću Cytoscape verzije 3.5.1 [50]. Mreže protein-protein interakcije su ukrašene dimenzioniranjem svakog proteina povezanog s V-AKI prema njihovoj povezanosti pi-score sa statusom V-AKI i obojene pretpostavljenom vezom s obogaćenim citokinima s pro ili protuupalnim učincima.

zmajevo bilje cistanchemože liječitiozljeda bubrega

5. Zaključci

Nastojali smo bolje razumjeti mehanizam ozljede za V-AKI iz klinički ocijenjenih slučajeva i, zanimljivo, otkrili smo da su komplement, protein koji veže galektin-3 i fibrinogen bili značajno povezani s V-AKI. Rezultati prethodnih studija i naši sugeriraju ulogu sustava komplementa i upalnih putova u V-AKI. Dok su potrebne veće studije kako bi se potvrdili molekularni procesi u oštećenju izazvanom vankomicinom i posljedični putovi popravka, rezultati pokazuju da urinarni egzosomi mogu doprinijeti važnim informacijama o patofiziološkim mehanizmima i mogu poslužiti kao biomarkeri za lijekove izazvanebubregozljeda.

Doprinosi autora:

Konceptualizacija, LA i SPR, metodologija, SV, SPR, DJG, RM; softver, DJG, RHM, formalna analiza, LA, AL, RHM; istraga, AL, JA, VJ, SB, MC-T., PN; pisanje—priprema izvornog nacrta, AL, JA, VJ, LA; pisanje—recenzija i uređivanje, RHM, DJG, MC-T., AT, AA, JC, MSJ, EM, RM, PN; nadzor, SV, SPR; administracija projekta, LA; prikupljanje sredstava, LA Svi su autori pročitali i složili se s objavljenom verzijom rukopisa.

Financiranje:

Ovo istraživanje financirao je Međunarodni konzorcij za ozbiljne neželjene događaje. MCT je dobio potporu T32 Training Grant DK007202.

Izjava Institucionalnog odbora za reviziju: Studija je provedena u skladu sa smjernicama Helsinške deklaracije i odobrena od strane Institucionalnog odbora za reviziju (ili Etičkog odbora) Sveučilišta u Kaliforniji, Program zaštite ljudskih subjekata u San Diegu (IRB#121651).

Izjava o informiranom pristanku: Informirani pristanak dobiven je od svih subjekata uključenih u studiju

Zahvale:

Željeli bismo zahvaliti na doprinosima DIRECT istraživača: Dinna Cruz, Stuart Goldstein, Patrick Murray, Andrew Davenport, Andrew Lewington, DavidSelewski, Michael Zappitelli, Marlies Ostermann, Li Yang, Bhavna Pandya, Patrick Brophy, DanielaPonce, Julia Steinke, Josee Bouchard, Carlos Irarrazabal, David Askenazi, Nitin Kolhe, RolandoClaure-Del Granado, Nadine Benador, Clare Castledine, Jonathan Barratt, Sunil Bhandari, AlyssaRiley, Ayse Akcan-Arikan, TK Davis, Christopher Farmer, Mark Thomas, Fred Pang, Kar Hui Ng , Hansjoerg Rothe.

Sukob interesa:

Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Iz: 'Urinarni egzosomi identificiraju upalne puteve u akutnoj ozljedi bubrega povezanoj s vankomicinom' Linda Awdishu

---Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 2784