Izoksazoli na bazi trifluorometiliranih flavonoida kao antidijabetici i sredstva protiv pretilosti: sinteza, in vitro inhibicijska aktivnost amilaze, molekularno spajanje i analiza odnosa strukture i aktivnosti

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comznati više

Faisal K. Algethami 1,*, Ilyes Saidi 2, Hani Nasser Abdelhamid 3, Mohamed R. Elamin 1, Babiker Y. Abdulkhair 1, Amani Chrouda 4 i Hichem Ben Jannet 2,*

Sažetak:Dijabetes melitus je veliki zdravstveni problem u svijetu. Upravljanje probavom ugljikohidrata predstavlja alternativni tretman.Flavonoidičine najveću skupinupolifenolnihspojeve koje proizvode biljke koje se široko konzumiraju kao hrana i/ili koriste u terapeutske svrhe. Kao takvi, izoksazoli su privukli pozornost medicinskih kemičara zbog svoje značajne bioaktivnosti. Stoga je glavni cilj ovog rada bio otkriti nove hibridne molekule sa svojstvima i flavonoida i izoksazola kako bi se kontrolirala probava ugljikohidrata. Štoviše, trifluorometilna skupina ključni je entitet u razvoju lijekova, zbog svoje snažne lipofilnosti i metaboličke stabilnosti. Stoga ovaj rad opisuje kondenzaciju prethodno sintetiziranog trifluorometiliranog flavonola s različitim aril nitril oksidima, dajući 13 hibridnih molekula označenih kao trifluorometilirani flavonoidni izoksazoli. Strukture dobivenih spojeva izvedene su iz 1H NMR, 13C NMR i HRMS analize. 15 novosintetiziranih spojeva inhibiralo je aktivnost -amilaze s učinkovitošću u rasponu od 64,5 ± 0,7 posto do 94,7 ± 1,2 posto pri koncentraciji od 50 µM, i s IC50 vrijednostima od 12,6 ± 0,2 µM–27,6 ± 1,1 µM. Najučinkovitiji spojevi u smislu djelotvornosti i potencije bili su 3b, 3h, 3j i 3m. Među novim trifluorometilacijana bazi flavonoidaizoksazola, spoj 3b bio je najučinkovitiji inhibitor aktivnosti -amilaze (PI=94.7 ± 1,2 posto pri 50 µM), s potencijom (IC50=12.6 ± { {13}}.2 µM) slično kao i akarboza pozitivne kontrole (IC50=12.4 ± 0.1 µM). Studija odnosa strukture i aktivnosti temeljena na analizi molekularnog spajanja pokazala je nisku energiju vezanja, ispravan način interakcije u aktivnom džepu ciljnog enzima i sposobnost interakcije s ključnim ostacima glikozidnog cijepanja (GLU{{16 }} i ASP-206), objašnjavajući inhibitorne učinke -amilaze uspostavljene pomoću nekoliko derivata.

Ključne riječi:-inhibicija amilaze; antidijabetik; protiv pretilosti; cikloadicija; flavonoidi; izoksazoli na bazi trifluorometilacije flavonoida; molekularno spajanje; SAR analiza

Kliknite ovdje da saznate više

1. Uvod

Pretilosti dijabetes melitus predstavljaju velike zdravstvene probleme ljudi diljem svijeta [1,2]. Doista, dijabetes melitus prvenstveno je tipičan po nekontroliranom šećeru u krvi. Međutim, dijabetes melitus tipa 1 nastaje zbog poremećaja u lučenju inzulina (ovisan o inzulinu), dok tip 2 obično potječe od inzulinske rezistencije (promjene strukture receptora na ciljnim stanicama, što dovodi do smanjenja afiniteta hormona i receptora), poremećaja u lučenju inzulina, ili oboje [3,4]. Neizbježno, inhibicija razgradnje polisaharida u monosaharide prikladne za apsorpciju u stanice implementira temeljne strategije za kontrolu dijabetesa i pomaže u upravljanju pretilošću [3]. Enzim -amilaza (EC.3.2.1.1) je probavni enzim koji hidrolizira -1,4-glikozidne veze ugljikohidrata, poput škrobova [5]. Stoga inhibicija -amilaze na ovaj ili onaj način doprinosi kontroli probave ugljikohidrata [6,7]; prema tome, čini djelomični put za regulaciju enzimske aktivnosti -amilaze; stoga je idealna terapija za regulaciju pretilosti i dijabetesa, kao i njihovih povezanih komplikacija [4]. Većina komercijalnih inhibitora amilaze—kao što su akarboza, miglitol, fazeolamin i vogliboza—povezana je s crijevnim nuspojavama, kao što su nadutost, bolovi u trbuhu, proljev, zatajenje jetre, teške kožne alergije i pneumatoza cistoidne crijevne infekcije [6]. ]. Najbolji inhibitori amilaze su takozvani kompetitivni inhibitori, koji nepovratno inhibiraju enzim. Kompetitivni inhibitor veže se na aktivno mjesto ciljnog enzima i na taj način sprječava vezanje supstrata. Stoga se u kompetitivnoj inhibiciji inhibitor natječe sa supstratom za aktivno mjesto. S druge strane, kod ireverzibilne inhibicije, inhibitor se vrlo sporo odvaja od ciljnog enzima, budući da je postao čvrsto vezan za enzim. Obično se ireverzibilni inhibitori kovalentno vežu na aktivno mjesto enzima modificiranjem ostataka ili funkcionalnih skupina potrebnih za enzimsku aktivnost, tako da je enzim nepovratno inhibiran. Za dobru inhibiciju probave ugljikohidrata—koja može pomoći u kontroli pretilosti, pa čak i dijabetesa tipa 2—potrebna nam je neselektivna tvar sposobna inhibirati većinu probavnih enzima šećera, naime slinovnu -amilazu, pankreasnu -amilazu i -glukozidazu [8,9]. Prethodno istraživanje polusintetiziranih flavonoida pokazalo je da derivati ​​flavonoida na bazi izoksazola pokazuju značajne antidijabetičke učinke povećanjem unosa glukoze u HepG2 stanicama otpornim na inzulin [10]. Nadalje, flavonoidi su najveća skupina polifenolnih sekundarnih metabolita, koji se obično nalaze u biljkama. Ovi sekundarni metaboliti odgovorni su za atraktivne boje plodova, lišća i plodova [11]. Strukturno, flavonoidi imaju C15 ugljikov kostur koji se sastoji od dva aromatska prstena (A) i (B), koji su međusobno povezani C3 lancem tvoreći heterocikl (C) [12]. Za ovu vrstu polifenolnih spojeva prijavljena su mnoga biološka svojstva, kao što su inhibicija -amilaze [7,13–15], antidijabetička [16,17], antikancerogena [18,19] iantioksidansučinci [20], i druge biološke aktivnosti [21-25]. Međutim, ovaj bogati biološki profil motivirao je nekoliko kemijskih istraživačkih timova da sintetiziraju flavonoide s posebnim dijelovima i supstituentima za ciljanje određenih bioloških aktivnosti [26-30]. S druge strane, izoksazol je peteročlani heterocikl od velike važnosti u medicinskoj kemiji. Nadalje, izoksazoli koji se pojavljuju u prirodi — kao što su ibotenska kiselina (halucinogeni, neurotoksin) i muscimol (halucinogeni, antagonist GABAA receptora) [31–34] — privukli su sve veću pozornost kemičara i farmakologa zahvaljujući svojim moćnim biološkim i farmakološkim svojstvima. Nadalje, otkriveno je da derivati ​​izoksazola posjeduju širok spektar bioloških svojstava, kao što su antidijabetičko, analgetsko, protuupalno, anti-HIV i antikancerogeno djelovanje [10,35-40]. Izoksazolni prsten naširoko se koristi kao ključni gradivni element za lijekove kao što su zonisamid (antikonvulziv) [41], valdekoksib, parekoksib (COX-2 inhibitori) [42] i leflunomid (antireumatik) [43]. Posljednjih desetljeća, trifluorometilna skupina bila je u sve većoj potražnji za razvoj bioaktivnih spojeva, zbog svog snažnog karaktera privlačenja elektrona, svoje metaboličke stabilnosti i svoje lipofilne prirode, što se smatra važnim fizikalno-kemijskim svojstvima bioaktivnih molekula [44]. Utvrđeno je da je ovaj fluorirani dio neophodan u mnogim važnim lijekovima, uključujući flufenazin (antipsihotik, lijek protiv raka) [45], leflunomid (antireumatik) [43], celekoksib (COX-2 selektivni inhibitor) [46], fluoksetin (antidepresiv) [47] i fluazinam (fungicid) [48]. U jednom pregledu literature spominje se da trifluorometilacija 5-amino-nikotinske kiseline pokazuje obećavajuću aktivnost -amilaze [49]. Osim toga, klorirane hibridne molekule pirazol-tiazola pokazale su se kao dobri inhibitori enzima -amilaze [50], što također ukazuje na važnost atoma klora u inhibicijskim strukturama -amilaze. Gornji literaturni podaci koji izvještavaju o važnim fizikalno-kemijskim svojstvima trifluorometilne skupine—i njezinom doprinosu, uz flavonoide i izoksazole, inhibiciji -amilaze i ispoljavanju antidijabetičkih aktivnosti—potaknuli su nas da pripremimo novu seriju hibridnih molekula, gdje je trifluorometilacijski flavonoid povezani sa nizom aril izoksazola preko metilenskog povezivača, i za procjenu njihove inhibicijske moći enzima -amilaze. Odnos struktura-aktivnost (SAR) proučavan je i potvrđen analizom molekularnog spajanja.

Cistanche za jačanje imuniteta

2. Rezultati i rasprava

2.1. Kemija Priprava trifluorometiliranog flavonola (1) — prethodno sintetiziranog u našem laboratoriju i koji pokazuje zanimljiv citotoksični potencijal — objavljena je prema postupku koji su usvojili Znati et al. (2019) [30]. 5-Kloro-2-hidroksi acetofenon je kondenziran s 4-(trifluorometil)benzaldehidom pod refluksom metanola i u prisutnosti natrijevog hidroksida tijekom 3 sata da se dobije 5-kloro{{10 }}(trifluorometil)-2-hidroksi kalkon; zatim je piranski prsten (C) cikliziran i C-3 ugljik je oksidiran dodatkom (H2O2, NaOH) 2 h na sobnoj temperaturi (Shema 1). Molekula 1 je dobivena s dobrim iskorištenjem (79 posto), nakon taloženja u ledenoj vodi. Shema 1. Sintetski put trifluorometilacije flavonola (1). Struktura flavonola (1) potvrđena je spektroskopskom analizom i usporedbom s literaturnim podacima [30]. 1,3-dipolarna cikloadicija je kemijska reakcija između 1,3-dipola i dipolarofila u obliku peteročlanog prstena. Stoga se 1,3-dipolarna cikloadicija smatra najvažnijim načinom sinteze širokog spektra izoksazola. Nadalje, regiospecifična sinteza izoksazola katalizirana Cu(I) pod mikrovalnim zračenjem temelji se na [3 plus 2] cikloadiciji između terminalnih alkina (dipolarofila) i aril nitril oksida (dipola), osiguravajući isključivo 3,5-disupstituirane regioizomeri [39,51]. Naš pristup ciljanju trifluorometilacije flavonoidnih izoksazola (3a–m), prvo započet pripremom dipolarofila (2) propargilacijom hidroksilne skupine na položaju C-3 flavonola (1) u bezvodnom DMF-u za 2 h na sobnoj temperaturi, u prisutnosti K2CO3, kao što je ilustrirano u shemi 2. Dipolarofil (2) je pripravljen s odličnim prinosom (94 posto). Shema 2. Sintetski put dipolarofila (2).

Struktura spoja 2 utvrđena je prema njegovim spektralnim podacima. Zaista, uz signale koji odgovaraju protonima i ugljicima uvedenim flavonolom (1), novi signali propargilnog dijela detektirani su u 1H i 13C NMR spektrima. Štoviše, 1H NMR spektar dipolarofila (2), snimljen u CDCl3 na 300 MHz, pokazao je dublet na δH 5,06 (2H, d, J=2,4 Hz) koji odgovara metilenskom protonu H{{13 }}" i triplet na δH 2,36 (1H, t, J=2.4 Hz) koji se može pripisati protonu etinilne skupine (H-3"). 13C NMR spektar potvrdio je uvođenje propargilne skupine opažanjem novih signala na δC 78,4, 76,9 i 59,6, koji se mogu pripisati C-2", C-3", i C{{29} }", odnosno. Hidroksimil kloridi a–m glavni su prekursori za in situ generacije aril nitril oksida—reagensa koji sudjeluju u reakciji 1,3-dipolarne cikloadicije za sintezu izoksazola. Prekursori (a –m) sintetizirani su iz odgovarajućih aldehida u skladu s općom procedurom koju su opisali Himo i dr. (2005) [51]. Željeni hidroksilni kloridi (a–m) dobiveni su s dobrim prinosima, u rasponu od 80 do 98 posto (tablica 1). Dakle, odgovarajući aril nitrilni oksidi nastali su in situ dehidrohalogenacijom odgovarajućih hidroksil klorida korištenjem trietilamina kao baze. Tablica 1. Strukture i prinosi hidroksil klorida (a–m) i trifluorometilacija izoksazola na bazi flavonoida (3a –m).

1,3-dipolarna cikloadicijska reakcija primijenjena je u regiospecifičnom pristupu korištenjem terminalnog alkina (2) i različitih hidroksilnih klorida (a–m) različito supstituiranih (shema 3). Dobiveni rezultati navedeni su u tablici 1. Shema 3. Sintetski put trifluorometilacije flavonoidnih izoksazola 3a–m. Sve reakcije su provedene pod mikrovalnim zračenjem (250 W) u DMF-u u prisutnosti trietilamina i bakrovog jodida (CuI) tijekom 5 minuta. Produkti su izolirani iz reakcijske smjese jednostavnim pročišćavanjem na koloni silikagela. Novopripremljeni 3,{{10}}disupstituirani izoksazoli (3a–m) dobiveni su u prinosima u rasponu od 73 do 96 posto (Tablica 1). Strukture sintetiziranih izoksazola na bazi trifluorometilacije flavonoida (3a–m) (tablica 1) određene su pomoću 1H, 13C NMR i DEPT 135. 1H NMR spektri ovih spojeva pokazali su singlet koji rezonira na δH 6,3{{68 }}–6,60 koji se može pripisati metinskom protonu H-4" izoksazolnog prstena, drugi singlet na δH 5,35–5,45 koji se može pripisati metilenskom protonu H-6", i drugi signali u aromatska protonska zona koja se odnosi na protone uvedene arilnom skupinom. Štoviše, ove su strukture potvrđene njihovim 13C NMR i DEPT 135 spektrom, pokazujući sve očekivane signale ugljika—posebno one aromatske uvedene korištenim hidroksil kloridima, kao i ugljik iz metina C-4" iz izoksazolski prsten koji rezonira na δC 1{{9{{1{{105}}0}}}}2,5–103.0, i onaj čiji je signal invertiran u spektru DEPT 135, rezonirajući na δC 63,5–63,9, što se može pripisati metilenu C-6". 2.2. Vrednovanje inhibicije -amilaze Za kontrolu aktivnosti enzima, inhibicija je jedno od najuspješnijih terapijskih sredstava. Stoga, inhibicija enzima -amilaze predstavlja djelomični put za upravljanje dijabetesom i kontrolu težine, ometanjem probave ugljikohidrata. Do danas su lijekovi poput akarboze činili dio arsenala lijekova koji se koriste za liječenje DM i pretilosti. Međutim, akarboza se ne koristi kao monoterapija zbog svoje učinkovitosti i nuspojava; umjesto toga, akarboza se koristi kao dodatna terapija i vrlo često se koristi u kombinaciji s drugim hipoglikemijskim lijekovima. Uz to, ovaj lijek se obično koristi kao standardni spoj u proučavanju inhibicije -amilaze. U ovoj studiji, 15 sintetiziranih spojeva (1, 2 i 3a–m) procijenjeno je na njihovu inhibitornu aktivnost -amilaze. Rezultati su izraženi u parametrima potencije (IC50 ± SEM µM) i učinkovitosti (PI pri 50 µM), a dati su u tablici 2. Prema rezultatima, sintetizirane molekule (1, 2, i 3a–m) posjeduju značajnu aktivnost anti- -amilaze (p Manje od ili jednako 0.05), s učinkovitošću u rasponu od 64,5 ± {{177} }.7 do 94,7 ± 1,2 posto pri koncentraciji od 50 µM, a potencije vrijednosti IC5{{2{{{207}}2}} variraju od 12,6 ± {{219} }.2 do 27,6 ± 1,1 µM. Među novopripremljenim izoksazolima na bazi flavonoida za trifluorometilaciju, 3b (R1=F, R2=H) pokazao se najsnažnijim (IC50=12.6 ± 0,2 µM) i najučinkovitiji (PI=94.7 ± 1,2 posto pri 50 µM) spoj za inhibiciju aktivnosti enzima -amilaze. Utvrđeno je da su te značajne vrijednosti usporedive s onima za akarbozu (PI=97.8 ± 0.5 posto pri 50 µM; IC50=12.4 ± 0.1 µM), koja se koristi kao standardna tvar. Isto tako, spojevi 3h, 3j i 3m mogu se smatrati bioaktivnima u smislu učinkovitosti i potencije (PI= 93.1 ± 0,9 posto –93,5 ± 1,1 posto pri 50 µM; IC50=13).3 ± 0,2 µM–13,8 ± 0,1 µM) u usporedbi s njihovim analogom 3b i akarbozom. Za ostale spojeve (1, 2, 3a, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 3i, 3k i 3l) također je utvrđeno da mogu inhibirati enzim -amilazu, ali su i dalje manje učinkoviti (PI{{ 140}}.5 ± 0,7 posto –87,1 ± 0,7 posto pri 50 µM; IC50=14.4 ± 0,2 µM do 27,6 ± 1,1 µM) u odnosu na gore navedene analoge. Aktivnost anti- -amilaze koju postižu sintetizirani spojevi u skladu je s prethodnim izvješćima, među kojima su Nie et al. (2020.) [10] izvijestili su da bi izoksazoli na bazi flavonoida mogli pokazati vrijedne skele za otkrivanje lijekova protiv dijabetesa. Uspoređujući strukture i aktivnosti sintetiziranih molekula, spojevi 3bd, halogenirani u para položaju fenilne skupine vezane na izoksazolni prsten, pokazali su značajnu učinkovitost (PI= 85.4 ± 0,9 posto –94,7 ± 1,2 posto na 50 µM) i jačinom (IC50=12.6 ± 0,2 µM–14,6 ± 0,3 µM) u inhibiciji enzima -amilaze. Ovo otkriće dobro se slaže s literaturom, pokazujući da je prisutnost atoma halogena (F, Cl ili Br) u strukturi bila neophodna za snažnu inhibiciju -amilaze [49,50]. Nadalje, istraživanje odnosa strukture i aktivnosti omogućilo nam je da zaključimo da više induktivnih atraktorskih (−I) i mezomernih donorskih učinaka (plus M) povećava učinkovitost i snagu inhibicije -amilaze (aktivnost fluoriranog derivata 3b (R{{186} } F, R2=H; PI=94.7 ± 1,2 posto pri 50 µM; IC50=12.6 ± 0,2 µM) viši je od onog za klorirani derivat 3c (R{ {198}} Cl, R2=H; PI=87.1 ± 0,7 posto pri 50 µM; IC50=14.4 ± 0,2 µM), nakon čega slijedi bromirani derivat 3d (R 1=Br, R2=H; PI=85.4 ± 0,9 posto pri 50 µM; IC50=14.6 ± 0,3 µM)), u skladu s prethodnim studijama [ 4,49]. Očito je da se inhibicija -amilaze povećava s učincima induktivnog atraktora (−I) i mezomernog donora (plus M) atoma halogena.

2.3. Molecular Docking StudiesEnzim -amilaza (EC 3.2.1.1)—glikozil hidrolaza—hidrolizira -1,4-glikozidne veze u škrobovima, kao što je amiloza. Kristalna struktura enzima -amilaze (PDB: 7TAA) sastoji se od lanca A s duljinom niza od 478 aminokiselina [52]. -Amilaza je jedan od najvažnijih ključnih enzima odgovornih za probavu ugljikohidrata [5]; stoga blokiranje enzima -amilaze nudi strategiju za kontrolu dijabetesa i pomaže u upravljanju pretilošću [6,7]. Provedena je opsežna analiza molekularnog spajanja kako bi se istražio način vezivanja, odredile vjerojatne interakcije sintetiziranih molekula (1, 2 i 3a–m) unutar hidrofobnog veznog džepa ABC (modificiranog akarboza heksasaharida) kristalne strukture proteina Aspergillus oryzae - enzima amilaze (PDB: 7TAA) [52] pomoću softvera AutoDock Vina i racionalizirati uočeno in vitro inhibicijsko djelovanje novosintetiziranih spojeva na amilazu. Sve sintetizirane molekule (1, 2 i 3a–m) — i akarboza, korištena kao standardna tvar — proučavane su in silico. Energije vezanja i detalji interakcije (broj interakcija, broj aminokiselina u interakciji, aminokiselina u interakciji i vodikove veze) liganada s ciljnim enzimom prikazani su u tablici 2. Iz rezultata in silico dockinga (tablica 2), uočeno je da su spojevi 1 i 2 pokazali dobru energiju vezanja (-7,7 odnosno -7,8 kcal/mol) unutar veznog mjesta enzima -amilaze (PDB: 7TAA). Te su vrijednosti usporedive s onima standardne tvari (akarboza, -7,9 kcal/mol), što im omogućuje da se povoljno uklapaju u aktivno mjesto ciljnog enzima. Zanimljivo je da su novosintetizirani trifluorometilacijski izoksazoli na bazi flavonoida (3a–m) dali očekivane rezultate; bili su ispravno u pozi za spajanje i pokazivali su veličanstvene energije vezanja u rasponu od -9,6 do -8,2 kcal/mol (Tablica 2). To bi omogućilo svima njima da se bolje uklope u aktivno mjesto enzima -amilaze, bolje od akarboze. Način vezanja triju najaktivnijih spojeva (3b, 3h i 3j) s ciljnim enzimom raspravlja se u nastavku. Spoj 3b—najjači i najučinkovitiji inhibitor enzima -amilaze u testiranoj seriji trifluorometiliranih izoksazola na bazi flavonoida—pokazuje izvrsnu energiju vezanja od -9,6 kcal/mol. Nadalje, način vezanja 3b sugerira da je on uključen u 16 nekovalentnih interakcija s 10 aminokiselina (tablica 2). Općenito, 3-(3-(4-fluorofenil)izoksazol-5-il)metoksil dio tvori dvije halogene (fluor) veze s ASP-206, a Pi –Pi veza u obliku slova T s TYR-82, Pi–kationska veza s HIS-80, Molecules 2021, 26, 5214 8 od 18 dvije konvencionalne vodikove veze s ARG{{71 }}, te Pi–anion i ugljik-vodik veza s ASP-340 ostatkom. Nadalje, trifluorometilna skupina vezana za C-40 kostura flavonoida uključena je u uobičajeno vezanje vodika s GLY-167 i dvije alkilne veze s LEU-166 i LEU-173 amino kiseline. S druge strane, flavonoidni kostur stupa u interakciju putem Pi–anionske veze s ASP-340, konvencionalne vodikove veze s GLN-35, te Pi–alkilne i dvije Pi–Pi naslagane veze s TYR{ {80}} (Slika 1).

Slika 1. Spoj 3b se uklapa u hidrofobni vezni džep ABC u PDB: 7TAA.

Nadalje, spoj 3h pokazao je zanimljivu energiju vezanja od -9,3 kcal/mol. Njegov način vezanja pokazuje da je uključen u 15 nekovalentnih interakcija s 10 ostataka (Tablica 2). U skladu s tim, molekularni uvid iz analize spajanja sugerira da 3-(3-(4- metoksifenil)izoksazol-5-il)metoksilna jedinica tvori dvije ugljik-vodikove veze s GLU{{12 }}, Pi–Pi T-oblika s TYR-82, dvije konvencionalne vodikove veze s ARG-344, ugljik-vodik veza s HIS-80 i Pi–anionska veza s ASP-340 ostatkom. Štoviše, trifluorometilna skupina uključena je u konvencionalnu vodikovu vezu s GLY-167 i dvije alkilne interakcije s LEU-166 i LEU-173 aminokiselinama. Osim toga, flavonoidni kostur uključen je u konvencionalnu vodikovu vezu s GLN-35, Pi–anionsku vezu s ASP-340, dvije Pi–Pi naslagane veze i Pi–alkilnu vezu s TYR{ {24}} (Slika 2)

S druge strane, spoj 3j pokazao je značajnu energiju vezanja od -9,2 kcal/mol. Njegov način vezanja pokazuje da je uključen u 16 nekovalentnih interakcija s 13 aminokiselina (Tablica 2). Stoga, dubinska analiza molekularnog spajanja sugerira da 3-(3-(4-butoksi-3-klorofenil)izoksazol-5-il)metoksilni dio tvori dva konvencionalna vodikove veze s ARG-344, tri Pi–alkilne veze s TYR-82, HIS-210 i HIS-296, alkilna interakcija s LEU-232, a ugljik-vodik veza s GLU-230 ostatkom, Pi–anionska veza s ASP-340 i Pi–kationska veza s HIS-80. Osim toga, trifluorometilna skupina povezana s aromatskim prstenom B flavonoidnog kostura uključena je u konvencionalnu vodikovu vezu s GLY-167 i dvije alkilne interakcije s LEU-166 i LEU-173 ostacima. Štoviše, flavonoidni kostur uključen je u konvencionalnu vodikovu vezu s GLN-35 i Pi–alkil i dvije Pi–Pi naslagane veze s aminokiselinom TYR-75 (Slika 3). U enzimu amilaze Aspergillus oryzae (PDB: 7TAA), nukleofilni i katalitički kiselinsko/bazni ostaci, koji su odgovorni za cijepanje glikozidnih veza, su ASP-206 i GLU-230 aminokiseline , odnosno [5]. Stoga su interakcije između proteina i liganda, prvenstveno preko GLU-230 i ASP-206 ostataka, najbolji način za blokiranje cijepanja glikozidnih veza. Zapravo, niska energija vezanja, ispravan položaj vezivanja, sposobnost interakcije s ključnim ostacima glikozidnog cijepanja (GLU-230 i ASP-206) i veliki broj interakcija u aktivnom džepu ciljni enzim (tablica 2) može objasniti snažnu inhibitornu učinkovitost -amilaze utvrđenu kod većine spojeva.

Slika 3. Spoj 3j se uklapa u hidrofobni vezni džep ABC u PDB: 7TAA

3. Materijali i metode

3.1. Općenito eksperimentalnoPostupci Sva korištena otapala su svježe destilirana prije upotrebe. Sve kemijske reakcije praćene su pomoću komercijalnih TLC ploča (silikagel 60, F254, SDS). Za određivanje tališta korišten je aparat Büchi 510. Svi 1H NMR (300 MHz), DEPT 135 i 13C NMR (75 MHz) spektri snimljeni su u deuteriranom kloroformu i dimetil sulfoksidu-d6 s Bruker AC-300 spektrometrom. Svi kemijski pomaci (δ) prijavljeni su u dijelovima na milijun (ppm), konstante sprezanja (J) dane su u Hertzima (Hz), a rezonancija rezidualnog nedeuteriranog otapala korištena je kao interna referenca. DCI-HRMS spektri su izvedeni u Waters GCT 1er u modu pozitivnih iona. ESI-HRMS spektri snimljeni su s ESI-TOF (Waters LCT, Markham, Ontario, Kanada) u modu pozitivnih iona korištenjem reflektron moda.

4. Zaključci

15 novosintetiziranih izoksazola na bazi trifluorometilacije flavonoida (3a–m) procijenjeno je in vitro na njihovu inhibitornu aktivnost -amilaze, te su zabilježeni značajni rezultati. Cikloadukti 3b, 3h, 3j i 3m pokazali su usporedivu učinkovitost i moć s onima akarboze koja se koristi kao standardna tvar za inhibiciju enzima -amilaze. Osim toga, analiza odnosa strukture i aktivnosti pokazala je da su halogenirani i alkoksilirani derivati ​​najaktivniji spojevi. Prema analizi silicodockinga, izoksazoli na bazi trifluorometilacije flavonoida pokazali su nisku energiju vezanja, velik broj interakcija i ispravan položaj vezanja u aktivnom džepu ciljnog enzima. Većina ih je djelovala u interakciji s nukleofilom i katalitičkim kiselinskim/baznim ostacima (GLU-230 i ASP-206), što može objasniti njihovu učinkovitost i snagu u inhibiciji enzimske aktivnosti -amilaze. Obećavajuće aktivnosti koje pokazuju sintetizirani hibridni spojevi potiču njihovo uključivanje kao kandidata za otkriće novih antidijabetičkih sredstava i sredstava protiv pretilosti. Međutim, vrlo detaljne studije i sigurnosni čimbenici moraju uzeti u obzir rizike povezane s novošću djelatne tvari, toksičnošću, stabilnošću i topljivošću u vodenom mediju te farmakodinamičkim karakteristikama, uključujući pouzdanost s kojom se mogu pratiti nuspojave. kod ljudi prije nego što se razviju potencijalno ozbiljni/nepovratni učinci. Dopunski materijali: Sljedeće je dostupno na internetu, NMR spektri sintetiziranih spojeva (1, 2 i 3a–m), Tablica S1: Krivulje koncentracija-odgovor korištene za izračunavanje vrijednosti IC50. Doprinosi autora: Konceptualizacija FKA i IS; metodika, HBJ; softver, IS iH.NA; validacija, FKA i AC; formalna analiza, UM; istraga, FKA i IS; resursi, BYA; čuvanje podataka, FKA i IS; pisanje—priprema izvornog nacrta, FKA i IS; pisanje—recenzija i redakcija, HBJ; vizualizacija, FKA i BYA; nadzor, HBJ; administracija projekta, FKA i HBJ; prikupljanje sredstava, FKA Svi su autori pročitali i složili se s objavljenom verzijom rukopisa. Financiranje: Ovo istraživanje nije dobilo vanjsko financiranje. Izjava Institucionalnog odbora za reviziju: Nije primjenjivo. Izjava o informiranom pristanku: Nije primjenjivo. Izjava o dostupnosti podataka: Nije primjenjivo. Zahvale: Autori izražavaju svoju zahvalnost Dekanu znanstvenog istraživanja Imama Mohammada Ibn Sauda Islamic Sveučilištu za financiranje ovog rada putem Istraživačke grupe. RG-21-09-69. Sukobi interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa. Dostupnost uzoraka: Uzorci spojeva nisu dostupni od autora.

Reference
1. Boutayeb, A.; Boutayeb, S. Teret nezaraznih bolesti u zemljama u razvoju. Int. J. Equity Health 2005, 4, 1–8. [CrossRef]
2. Wagner, KH; Brath, H. Globalni pogled na razvoj nezaraznih bolesti. Pret. Med. 2012, 54, S38-S41. [CrossRef]
3. Tseng, CH Potencijalni biološki mehanizmi dijabetes melitusa izazvanog arsenom. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2004., 197, 67–83. [CrossRef]
4. Sala, D.; Zorzano, A. Diferencijalna kontrola mišićne mase kod dijabetes melitusa tipa 1 i tipa 2. Ćelija. Mol. Life Sci. 2015, 72, 3803–3817. [CrossRef]
5. Brzozowski, AM; Davies, GJ Struktura aspergillus oryzae -amilaze u kompleksu s inhibitorom akarbozom pri razlučivosti 2.0 Å. Biokemija 1997, 36, 10837-10845. [CrossRef]
6. Jayaraj, S.; Suresh, S.; Kadeppagari, RK inhibitori amilaze i njihova biomedicinska primjena. Starch-Stärke 2013, 65, 535–542. [CrossRef]
7. Khan, S.; Nazir, M.; Raiz, N.; Saleem, M.; Zengin, G.; Fazal, G.; Saleem, H.; Mukhtar, M.; Tousif, MI; Tareen, RB; et al. Fitokemijsko profiliranje, in vitro biološka svojstva i in silico studije na zalihama Caragana ambigua (Fabaceae): sveobuhvatan pristup. Ind. Usjevi Proizv. 2019, 131, 117–124. [CrossRef]
8. Berg, JM; Tymoczko, JL; Stryer, L. Enzime mogu inhibirati specifične molekule. U biokemiji, 5. izdanje; WH Freeman: New York, NY, SAD, 2002.
9. Kam, A.; Li, KM; Razmovski-Naumovski, V.; Nammi, S.; Shi, J.; Chan, K.; Li, GQ. Komparativna studija o inhibitornim učincima različitih dijelova i kemijskih sastojaka nara na -amilazu i -glukozidazu. Fitoter. Res. 2013, 27, 1614–1620. [CrossRef]
10. Nie, JP; Qu, ZN; Chen, Y.; Chen, JH; Jiang, Y.; Jin, MN; Yu, Y.; Niu, WY; Duan, stožer; Qin, N. Otkriće i antidijabetički učinci novih flavonoidnih derivata na bazi izoksazola. Fitoterapia 2020, 142, 104499. [CrossRef]
12. Malešev, D.; Kunti´c, V. Ispitivanje kelata metal-flavonoid i određivanje flavonoida putem reakcija kompleksiranja metal-flavonoid. J. Srbin. Chem. Soc. 2007., 72, 921–939. [CrossRef]
12. Pinheiro, PF; Goncalon, CJ Strukturna analiza flavonoida i srodnih spojeva—Pregled spektroskopskih primjena. U fitokemikalijama—Globalna perspektiva njihove uloge u prehrani i zdravlju; InTech: London, UK, 2012.
13. Lo Piparo, E.; Scheib, H.; Frei, N.; Williamson, G.; Grigorov, M.; Chou, CJFlavonoidi zakontroliranje probave škroba: Strukturni zahtjevi za inhibiciju humane -amilaze. J. Med. Chem. 2008, 51, 3555–3561. [CrossRef]
14. Xiao, J.; Ni, X.; Kai, G.; Chen, X. Pregled odnosa strukture i aktivnosti prehraneinhibicija polifenola-amilaza. krit. Rev. Food Sci. Nutr. 2013, 53, 497–506. [CrossRef] [PubMed]
15. Hua, F.; Zhou, P.; Wu, HY; Chu, GX; Xie, ZW; Bao, GH Inhibicija -glukozidaze i -amilaze flavonoidnim glikozidima iz Lu'an GuaPian čaja: Molekularno spajanje i mehanizam interakcije. Funkcija hrane. 2018, 9, 4173–4183. [CrossRef] [PubMed]
16. Vinayagam, R.; Xu, B. Antidijabetička svojstva dijetalnih flavonoida: pregled staničnog mehanizma. Nutr. Metab. 2015, 12, 1–20. [CrossRef] [PubMed] 17. Ghorbani, A. Mehanizmi antidijabetičkih učinaka flavonoida rutina. Biomed. Pharmacother. 2017, 96, 305–312. [CrossRef] [PubMed]