Novi učinci kombinirane terapije kroz inhibiciju piroptoze izazvane kaspazom-1/Gasderminom D u lupusnom nefritisu

Za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Heng Cao, Junyu Liang, Jing Liu, Ye He, Yini Ke, Yiduo Sun, Song Jiang i Jin Lin

SAŽETAK

Ciljevi: Kombinirana terapija mikofenolat mofetilom, takrolimusom i steroidima učinkovita je u postizanju potpune remisije kodlupusni nefritis(LN). Kombinirana terapija jedinstveno je smanjila regulaciju kaspaze-1 u usporedbi s monoterapijama, koja može cijepati gasdermin D (GSDMD) i nedavno je identificirana kaopiroptozakrvnik. Stoga smo istražili je li kombinirana terapija omogućila supresiju posredovane kaspazom-1/GSDMD-ompiroptozau LN (lupusni nefritis).

Kliknite za cistanche deserticola ma za nefritis

Metode: Ekspresija i aktivacija GSDMD otkrivena je u uzorcima bubrega čovjeka i miša s LN (lupusni nefritis) korištenjem imunohistokemijskog bojenja i imunoblotinga. Primarni podociti izolirani iz MRLlpr miševa inkubirani su s LPS plus ATP i prethodno tretirani monoterapijom ili kombiniranom terapijom. Inhibicija izazvana kaspazom-1/GSDMDpiroptozakombiniranom terapijom procijenjen je u MRLlpr miševima i ljudskim uzorcima. Bio sam pregledan pomoću kompleta FAM kaspaza-1 i protočne citometrije. Korelacija izmeđupiroptozau perifernoj krvi i analiziran je indeks aktivnosti bolesti sistemskog eritemskog lupusa (SLEDAl).

Rezultati: Uzorci bubrežnog tkiva iz LN (lupusni nefritis) pacijenti i miševi pokazali su znatno povećane razine ekspresije i cijepanja GSDMD. U uzgojenim podocitima, kombinirano liječenje značajno je potisnulo aktivaciju NLRP3 i kaspaze-1 i smanjilo razine GSDMD N-terminala. Kombinirana terapija potisnula je progresiju bolesti inhibicijom posredovanom kaspazom-1/GSDMD-ompiroptozai kod ljudi i kod MRL/LPR miševa. Broj pozitivnih stanica na kaspazu-1/PI u perifernoj krvi bio je u pozitivnoj korelaciji sa SLE-DAl. LN (lupusni nefritis) pacijenti s potpunom remisijom i djelomičnom remisijom imali su značajno smanjen broj kaspaza-1/PI pozitivnih stanica u usporedbi s početnom vrijednošću. Ac-FLTD-CMK, inhibitor izveden iz GSDMD-a, spriječio je razvoj LN (lupusni nefritis).

Zaključak: Kombinirana terapija potisnula je posredovano kaspazom-1/GSDMDpiroptozain vitro i in vivo i smanjena progresija bolesti.

Ključne riječi:lupusni nefritis, piroptoza, kaspaza-1, gasdermin D, terapija

Terapija liječenja zapiroptoza

UVOD

Lupusni nefritis(LN) je upala bubrega koja nastaje kao posljedica autoimune bolesti sistemski eritematozni lupus (SLE).LN (lupusni nefritis) je glavna manifestacija kod pacijenata koji boluju od SLE. Oko 60 posto pacijenata razvije ovo stanje, a približno 20 posto napreduje do završne faze bubrežne bolesti (ESRD) (1). Kombinirana terapija s mikofenolat mofetilom (MMF), inhibitorima kalcineurina (CNI) i steroidima proizvodi komplementarne učinke i također smanjuje toksičnost (2). Ova terapija se preporučuje kao početni tretman za LN (lupusni nefritis) i proizvodi bolju učinkovitost i potpuniju remisiju u usporedbi s intravenskim ciklofosfamidom (IVCY) i steroidima (3-5).

Kako bi se istražili molekularni i stanični mehanizmi kombinirane terapije, korištena je sveobuhvatna transkriptomska analiza u mišjem modelu LN (lupusni nefritis). MRL/LPR miševima davan je sam MMF, takrolimus ili prednizon kao monoterapija ili kombinacije tri lijeka. Profili ekspresije gena u bubrezima miševa s LN (lupusni nefritis)otkrili su potencijalne mehanizme koji bi mogli objasniti aditivne i sinergističke učinke kombinirane terapije u usporedbi s monoterapijama. Jedan od 45 gena s niskom regulacijom koji se jedinstveno moduliraju kombiniranom terapijom je kaspaza-1 (6). Aktiviraju ga inflamasomi, koji su multiproteinski oligomeri koji se sastoje od NLRP3, pro-kaspaze-1 i proteina nalik mrljama (ASC) povezanog s apoptozom, s integriranom domenom afiniteta za kaspazu. Upala NLRP3/ASC/caspase-1 prepoznata je kao ključni čimbenik u patogenezi LN-a (lupusni nefritis). NLRP3 inflammasom pokreće autoupalne poremećaje aktiviranjem kaspaze-1, iniciranjem stvaranja proupalnih citokina npr. IL-1, za koji je poznato da pokreće disfunkciju podocita u LN(7-9).

Aktivna kaspaza-1 cijepa gasdermin D(GSDMD) unutar veze njegovih N- i C-terminalnih domena. Zatim, N-terminalna domena olakšava stvaranje pora u staničnoj membrani, stimulira stanicupiroptozai proizvodnju citokina IL-1 i IL-18 (10). Nove studije pokazale su da je GSDMD-posredovanpiroptozasudjeluje u napredovanju bolesti uključujući autoimuni encefalomijelitis (11), multiplu sklerozu (12), alkoholni hepatitis (13) i upalnu bolest crijeva (14). Osim toga, genetska ili farmakološka inhibicija kaspaze-1/GSDMD ima dokazano je da štiti bubrege od ozljeda u mišjim modelima dijabetičke bolesti bubrega (15, 16), kao i nakon akutne ozljede bubrega (17-19). Međutim,piroptozau LN (lupusni nefritis)je do danas još uvijek slabo definiran(20). Pretpostavili smo da kombinirana terapija daje korisne učinke na LN (lupusni nefritis)) inhibiranjempiroptozaizazvan kaspazom-1/GSDMD.

U ovoj studiji ispitivana je aktivacija kaspaze-1 i GSDMD-a u bubrežnom tkivu, kao i učinci kombinirane terapije na ovisne o kaspazi-1/GSDMD-upiroptozainhibicija u MRL/LPR miševa i bolesnika s LN (lupusni nefritis). Potencijalne korelacijepiroptozas indeksom aktivnosti SLE bolesti (SLEDAI) i također su procijenjeni odgovori na liječenje.

Liječenje zapiroptoza

MATERIJALI I METODE

Studijska populacija

Kohorta studije sastojala se od pacijenata kojima je biopsijom dijagnosticiran LN (lupusnefritis) Manje od ili jednako 6 mjeseci prije upisa. Dobni raspon pacijenata bio je 18-65 godina i svi su zadovoljili kriterije klasifikacije Američkog koledža za reumatologiju za SLE (2l, 22) i Međunarodnog društva za nefrologiju/Društva za bubrežnu patologiju (2003.). Pacijenti su odabrani s Medicinskog fakulteta Sveučilišta Zhejiang i Medicinskog fakulteta Sveučilišta Nanjing koji su imali proteinuriju (veću ili jednaku 1,5 g/dan) i koncentracije kreatinina u serumu manje ili jednake 265,2 umol/L. Kriteriji isključenja uključivali su: pacijent je prethodno bio liječen visokim dozama metilprednizolona; biološki lijekovi (usmjereni na specifične patogene molekule) ili kombinirana terapija; tekuća plazmafereza ili liječenje intravenskim globulinom unutar 12 tjedana od probira; abnormalne funkcije jetre; trenutne aktivne infekcije; i maligni tumor unutar 4 tjedna od početka ispitivanja. LN (lupusnefritis) pacijenti su primali pulsnu terapiju metilprednizolonom tijekom 3 dana u dozi od 0.5 g/d. Nakon što je dovršena pulsna terapija metilprednizolonom, kombinirana skupina s prednizonom (0.6 mg/kg/dan), MMF-om (0.5 g, dvije doze/dan) i takrolimusom (2 mg, dvije doze/d) davane su ukupno 4 tjedna. Zatim su doze prednizona, koje su još uvijek bile kombinirane s MMF-om (0.5 g, dvije doze/dan) i takrolimusom (2 mg, dvije doze/dan), smanjene za 5 mg/dan svaka 2 tjedna do postignuta je doza održavanja od 10 mg/dan (4). Potpuna remisija (CR) je uzeta kao 24-h koncentracija proteina u urinu manja od ili jednaka 0,4 g, odsutnost aktivnih sedimenata u urinu, koncentracija albumina u serumu veća ili jednaka 35 g/L i normalan kreatinin (23). Djelomična remisija (PR) uzeta je kao smanjenje veće od ili jednako 50 posto koncentracije proteina u urinu 24-h na manje od ili jednako 3,5 g, koncentracija albumina u serumu veća ili jednaka 30 g/ L, i normalno ili manje od ili jednako 25 posto povećanja koncentracije kreatinina u serumu u odnosu na početnu vrijednost. Naš Institucionalni odbor za reviziju odobrio je studiju (br. IIT20200410A) i svi su pacijenti dali pismeni pristanak prije uključivanja.

Modeli životinja

Ženke MRL/emoji-FasPr(MRL/LPR) miševa isporučio je SLAC Laboratory Animal Co.Ltd (Šangaj, Kina), svi miševi su nasumično podijeljeni uz pomoć generatora slučajnih brojeva, 5 miševa u svakoj skupini i svakom kavezu . Liječeni su u dobi od 8 tjedana oralno, kombinacijom 0.5 mg/kg takrolimusa (MCE HY-13756), 50 mg/kg MMF-a (MCE HY-B0199) i 1 mg/kg kg prednizona (MCE HY-B0214) ili nosača dnevno tijekom ukupno 8 tjedana kako je prethodno opisano (6). Ac-FLTD-CMK je sintetiziran pomoću MCE i 10 mg/kg je ubrizgavano ip dnevno. Svi tretmani bili su slijepi za sudionike odgovorne za sljedeću detekciju. Omjer albumin-kreatinin u urinu (UACR) određen je pomoću Albuwell M i Creatinine Companion (Excell, Phil, US). Uzorci bubrega fiksirani su u 4-postotnom paraformaldehidu prije histološkog i imunohistokemijskog bojenja, a kora bubrega izvađena je za imunobloting analizu. Korištenje miševa odobrio je naš Institucionalni odbor za skrb i korištenje životinja (br.2019-883).

Izolacija mišjih glomerula i kultura podocita

Glomeruli su pročišćeni iz bubrega 12-tjedno starih ženki C57 i MRL/LPR miševa kao što je prethodno opisano (24). Anestezirani miševi perfundirani su s prethodno zagrijanim magnetskim kuglicama na 37 stupnjeva C. Bubrezi su uklonjeni i usitnjeni na ledu u 1 mm³. Zatim su bubrežna tkiva digestirana na 37 stupnjeva s 1 mg/ml kolagenaze i 100 U/ml DNaze I tijekom 30 minuta, zatim dva puta filtrirana s 100- μm Falconovim cjedilima（431752, BD). Nakon nekoliko ispiranja s otopinom HBSS od 4 stupnja (H1025, Solarbio) i laganog centrifugiranja na 200 g tijekom 5 minuta, kuglice koje sadrže glomerule sakupljene su pomoću magnetskog postolja (HY-K0200, MCE) i isprane s otopinom HBSS tri puta. Izolirani glomeruli uzgajani su na kultiviranim posudama obloženim kolagenom tipa I (C3867, Sigma-Aldrich) u 5 posto CO, na 37 stupnjeva prema metodi koju je opisao Jeffrey (25). Podociti prolaza 2 korišteni su u in vitro eksperimentu.PiroptozaIndukcija, citotoksičnost i otkrivanje lučenja IL-1

Podociti iz MRL/LPR miševa tretirani su s 1 mg/ml LPS-a (tell-pb5lps, In InvivoGen) otopljenog u Opti-MEM tijekom 4 sata, a zatim je uslijedila stimulacija s 5 mM ATP (tlrlatpl, In Vivo gen). Podociti iz C57 miševa su odsječeni kao normalna kontrola. Monoterapije takrolimus（10 µM）, MMF（luM） i prednizon （10 µM） ili kombinirana terapija prethodno su inkubirane sa stanicama 1 h prije početka LPS-a. Citotoksičnost nakon stimulacije određena je korištenjem kompleta za detekciju citotoksičnosti (11644793001, Roche) prema uputama proizvođača. Supernatant nakon stimulacije je sakupljen i izmjeren pomoću IL-1 mišjeg ELISA kompleta (BMS6002, Invitrogen) prema uputama proizvođača.

Antitijela i reagensi

Razine kaspaze-1(sc-398715, Santa Cruz Biotech), GSDMDC1 (sc-81868, Santa Cruz Biotech) procijenjene su prema uputama proizvođača.Piroptozau perifernoj krvi mjeren je pomoću FAM FLICAMCaspase-1 Kita (Bio-Rad, SAD) protočnom citometrijom.

Statistička analiza

Statističke analize provedene su pomoću programa GraphPad Prism (verzija 8.0), a podaci su dani kao srednje vrijednosti ± SD. Dvije grupne usporedbe provedene su korištenjem Studentovog t-testa i korelacijske analize korištenjem Pearsonove korelacije. Dvokraki str<0.05 was="" considered="" statistically="">

Liječenje zapiroptoza ulupusni nefritis (LN)

REZULTATI

GSDMD-posredovanoPiroptozaAktivira se u bubrezima zahvaćenim LN (lupusnefritis)

Istražiti je li GSDMD pridonio patogenezi LN (lupusnefritis), prvo smo testirali razinu ekspresije proteina GSDMD-a u uzorcima bubrega uzetih iz LN (lupusnefritis) pacijenata. Imunohistokemijska analiza otkrila je izrazito povećane razine ekspresije GSDMD-a u uzorcima biopsije bubrega uzetih iz LN (lupusnefritis) bolesnika s tipom IV, V, I plus V i IV plus V, te u usporedbi sa zdravim subjektima. GSDMD je bio univerzalno izražen u glomerularnim podocitima, tubularnim stanicama i infiltriranim intersticijskim stanicama u LN (lupusnefritis) pacijenata. Područje s pozitivnim (crvene strelice) i negativnim bojanjem (crne strelice) je povećano (Slika 1A). Zatim je procijenjen postotak GSDMD-pozitivnog područja u bubregu (Slika 1B). Slični rezultati pronađeni su u bubrezima MRL/LPR miševa i kontrola divljeg tipa. Imunobloting analiza potvrdila je znatno povećanu ekspresiju i cijepanje GSDMD-a u uzorcima bubrega MRL/LPR miševa (Slika 1C). GSDMD u glomerularnim podocitima, tubularnim stanicama i infiltriranim intersticijskim stanicama bio je povišen u MRL/LPR miševa u usporedbi s kontrolnim miševima (Slika 1D). Ovi podaci upućuju na to da je GSDMD posredovan aktiviran u bubrežnom tkivu zahvaćenom LN (lupusnefritis).

SLIKA 1|GSDMD je jako povišen i cijepa se u bubrezima pacijenata i miševa zahvaćenih LN-om (lupus nefritis).

(A) Imunokemijsko bojenje GSDMD-a u bubrežnim uzorcima uzetim od zdravih ispitanika i LN (lupusnefritis) pacijenata, pozitivne (crvene strelice) i negativne boje (crne strelice) bile su povećane.

(B) Kvantifikacija GSDMD pozitivnih područja prikazana je u tipu III plus V, IV, IV plus V, V LN (lupusnefritis) pacijenata i zdravih osoba.

(C) Imunoblot analiza pune duljine, odcijepljene N-terminalne domene i C-terminalne domene GSDMD u bubrežnom korteksu iz tri para kontrolnih i MRL/LPR miševa.

(D) Imunokemijsko bojenje GSDMD-a u uzorcima bubrega uzetih od kontrolnih i MRL/LPR miševa.

*p < {{0}}.05,="" **p="">< 0,01.="" ln="">lupusnefritis), lupusnefritis; FL, pune dužine; NT, N-terminalna domena; CT, C-terminalna domena.

Kombinirano liječenje suzbija GSDMD posredovanoPiroptozaAktivacija u primarnim podocitima in vitro

Istražiti inhibitorne učinke kombinirane terapije napiroptoza, primijenili smo metodu stimulacije LPS plus ATP za induciranjepiroptozau podocitima MRL/LPR miševa, uzimajući podocite divljeg tipa C57 miševa kao normalnu kontrolu. Podociti iz MRLlpr miševa tretirani su 4 sata s LPS-om, a zatim 4 sata tretirani s ATP-om, često korištenim stimulansom za GSDMD-posredovanpiroptozaaktivacija(26). U usporedbi s normalnom kontrolom, podociti su nakon toga pokazali piroptotičke morfološke značajke poput bubrenja stanica i mjehurića. Prethodno liječenje kombiniranom terapijom značajno je poboljšalo piroptotične morfološke značajke i citotoksičnost (Slika 2A). LPS plus ATP inducirana citotoksičnost podocita. Usporedno, kombinirana terapija značajno je smanjila citotoksičnost i izlučivanje IL-1 u supernatantu izazvano LPS plus ATP stimulacijom (Slike 2B, C). Za daljnju provjeru aktivacije posredovane GSDMD-ompiroptoza, analizirali smo kanonske upale i GSDMD aktivaciju pomoću imunoblotinga. U skladu s piroptotičkim morfološkim promjenama i citotoksičnošću, LPS plus ATP značajno su aktivirali NLRP3, kaspazu-1 i cijepali GSDMD u podocitima (Slika 2D). Kombinirano liječenje značajno je potisnulo aktivaciju NLRP3 i kaspaze-1 i smanjilo razinu GSDMD N-terminala. Značajno je da su monoterapije s takrolimusom, MMF-om ili prednizonom potisnule LPS plus ATP stimuliranu staničnu citotoksičnost i L-1 sekreciju, ali je kombinirana terapija pokazala značajniji inhibitorni učinak na kaspazu-1 i GSDMD. Ovi rezultati pružili su dokaze koji podupiru stajalište da kombinirano liječenje poboljšava GSDMD posredovanopiroptozapotiskivanjem aktivacije NLRP3 i kaspaze-1.

SLIKA 2|Kombinirano liječenje poboljšava piroptozu u podocitima in vitro.

(A) Značajke piroptoze pokazale su se u uzgojenim primarnim podocitima nakon inkubacije s LPS plus ATP i prethodno tretirane kombiniranim tretmanom. Strelice su pokazale stanice koje pokazuju značajke slične piroptozi.

(B) Supernatanti iz izazvanih stanica analizirani su na staničnu smrt, mjereno lučenjem LDH.

(C) Supernatanti iz izazvanih stanica analizirani su na otpuštanje IL-1b.

(D) Imunobloting analiza ekspresije NLRP3, kaspaze-1, GSDMD-NT i ASC nakon takrolimusa, MMF-a, prednizona ili kombiniranog liječenja nakon aktivacije inflamasoma NLRP3.

*p < {{0}}.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0,001;="" ****p="">< 0,0001.="" ldh,="" laktat="">

DSMO, dimetil sulfoksid, FK506, takrolimus; MMF, mikofenolat mofetil; PNS, prednizon; COM, kombinirana terapija; ASC, protein sličan mrljama povezan s apoptozom.

Kombinirani tretman potisnut kaspazom-1/GSDMD-omPiroptozakod MRL/LPR miševa

MRL/LPR miševi stari osam tjedana dobili su kombinaciju MMF-a, takrolimusa i prednizona ili kontrolu nosača. U skladu s prethodnom studijom (6), nakon liječenja od 8 tjedana, nije pronađena razlika u smrtnosti ili tjelesnoj težini između skupina koje su primale vehikulum i skupine za kombinirano liječenje. Za razliku od skupine nosača, kombinirana terapija bila je vrlo učinkovita u sprječavanju proteinurije, glomeruloskleroze i infiltracije bubrežnih intersticijskih imunoloških stanica (dodatna slika 1).

Zatim smo ispitali razine ekspresije kaspaze-1 i GSDMD-a u kontrolnim skupinama na kombiniranoj terapiji i vozilima. Imunohistokemijska analiza otkrila je da je ekspresija glomerularne i bubrežne intersticijske kaspaze-1 i GSDMD bila značajno smanjena u skupini na kombiniranoj terapiji (Slika 3A). Analiza imunoblotinga također je pronašla smanjenu ekspresiju i cijepanje kaspaze-1 i GSDMD u korteksu bubrega skupine koja je primala kombinaciju (Slika 3B). Štoviše, dvostruko pozitivne stanice kaspaza-1/propidij jodid (PI) izbrojane su pomoću protočne citometrije ipiroptozaFAM Caspase-1kit. Rezultati su otkrili izrazito smanjenje broja kaspaza-1*/PI' perifernih krvnih stanica u MRL/LPR miševa koji su primili kombinirani tretman u usporedbi s MRL/LPR miševima tretiranim nosačem. (Slike 3C,D). Uz to, kombinirano liječenje također je značajno smanjilo koncentraciju Ii u serumu (Slika 3E). Stoga smo zaključili da je kombinirano liječenje potisnulo induciranu kaspazom-1/GSDMDpiroptozau bubrezima i krvnim stanicama LN (lupusnefritis) miševi.

SLIKA 3|Kombinirano liječenje oslabilo je piroptozu posredovanu kaspazom-1/GSDMD u MRL/LPR miševa.

(A) Imunokemijsko bojenje GSDMD-a i kaspaze-1 u uzorcima bubrega MRL/LPR miševa. U usporedbi s kontrolom nosača, ekspresija kaspaze-1 i GSDMD bila je izrazito inhibirana u skupini koja je primala kombinaciju.

(B) Imunoblot analiza GSDMD pune duljine i rascijepljenog GSDMD-a i kaspaze-1 u uzorcima kore bubrega MRL/LPR miševa; usporedba rezultata iz skupina s nosačem i kombiniranim tretmanom.

(C) FACS dvostruko pozitivnih stanica na kaspazu-1/PI u perifernoj krvi MRL/LPR miševa koji su primili ili nisu primili kombinirani tretman.

(D) Kvantifikacija kaspaza-1/PI dvostruko pozitivnih stanica u perifernoj krvi MRL/LPR miševa kojima je davana ili nije davana kombinirana terapija.

(E) Kvantifikacija serumskih koncentracija IL{{0}}b u MRL/LPR miševa koji su primili ili nisu primili kombinirani tretman. ####P < 0,0001.="" facs,="" sortiranje="" stanica="" aktivirano="" fluorescencijom;="" ct,="" kombinirana="">

Kombinirana terapija potiskuje kaspazu-1/GSDMD-induciranuPiroptozau LN (lupusnefritis) Pacijenti

Između siječnja 2020. i lipnja 2020. 47 pacijenata s LN (lupusnefritis) bili su uključeni i 43 su završila 24-tjedna kombinirane terapije. Osnovna bolest i demografija uključene skupine navedeni su u Dodatnoj tablici 1. Kvantifikacija kaspaze-1/propidijevog jodida (PI dvostruko pozitivnih stanica provedena je u bolesnika s LN-om (lupusnefritis) tipa III, IV, V, III plus V, IV plus V i kod zdravih kontrola korištenjem apiroptozaFAM Caspase-1 komplet i protočna citometrija. U usporedbi sa zdravim kontrolama, broj dvostruko pozitivnih stanica na kaspazu-1/PI u perifernoj krvi bio je povećan (slike 4A, B). Također smo ispitali dvostruko pozitivne stanice na kaspazu-1/PI nakon 24-tjedana terapije i na početku. Nakon 24-tjedana indukcijske terapije, incidencija CR i PR bila je 39,5 posto (17/43), odnosno 32,6 posto (14/43). Broj dvostruko pozitivnih stanica kaspaze-1/PI u perifernoj krvi pacijenata s CR i PR bio je značajno smanjen u usporedbi s osnovnom vrijednošću (Slika 4C). Također smo identificirali korelaciju između induciranih kaspazom-1piroptozai SLEDA; podaci su jasno pokazali da je pozitivan omjer kaspaza-1/PI u perifernoj krvi u pozitivnoj korelaciji sa SLEDAI (Slika 4D). Ac-FLTD-CMK, inhibitor izveden iz GSDMD-a, spriječio je razvoj LN (lupusnefritis).

SLIKA 4|Kombinirana terapija oslabila je piroptozu-1-posredovanu kaspazom u bolesnika s LN-om (lupus nefritis).

(A) FACS kaspaza-1/PI dvostruko pozitivnih stanica u perifernoj krvi LN (lupusnefritis) bolesnika liječenih kombiniranom terapijom ili bez nje.

(B) Kvantifikacija kaspaza-1/PI dvostruko pozitivnih stanica u perifernoj krvi tipa III, IV, V, III plus V i IV plus V LN (lupusnefritis) pacijenata i zdravih osoba.

(C) Kvantifikacija kaspaza-1/PI dvostruko pozitivnih stanica u perifernoj krvi LN (lupusnefritis) pacijenti na početku, CR, PR i bez remisije nakon kombinirane terapije.

(D) Analiza korelacije omjera kaspaza-1/PI dvostruko pozitivnih stanica sa SLE-DAI.

**p < 0.01.="" facs,="" sortiranje="" stanica="" aktivirano="" fluorescencijom;="" ln="">lupusnefritis), lupusnefritis; CR, potpuna remisija; PR, djelomična remisija; SLE-DAI, indeks aktivnosti bolesti sistemskog lupusa eritematozusa.

Nedavna studija otkrila je da su GSDMDhmiševi razvili povećano odlaganje C3 i IgG u bubrezima, težu bubrežnu ozljedu i povećanu smrtnost u modelu SLE-a izazvanom imikvimodom.17 Kako bismo dodatno razjasnili ulogu GSDMD-a u LN (lupusnefritis), MRL/LPR miševi tretirani su s Ac-FLTD-CMK21 počevši od 8- tjedana starosti, s nosačem kao kontrolom. Nakon 8-tjedana liječenja, nije pronađena razlika u smrtnosti ili tjelesnoj težini između nosača i skupine tretirane Ac-FLTD-CMK. U usporedbi s kontrolnim miševima s nosačem, MRL/LPR miševi tretirani s Ac-FLTD-CMK imali su niži omjer albumina i kreatinina u mokraći (Slika 5A), nižu koncentraciju kreatinina u serumu (Slika 5B), smanjenu glomerulosklerozu (Slika 5C) i CD3 , CD4 i CD68 pozitivna infiltracija stanica (Slika 5D). Imunohistokemijski rezultati pokazali su smanjenu ekspresiju GSDMD-a (Slika 5D) i potisnuto izlučivanje IL-1 u serumu utvrđeno ELISA-om (Slika 5E). Zajedno, podaci sugeriraju da Ac-FLTD-CMK inhibirapiroptozau bubrezima zahvaćenim LN (lupusnefritis).

SLIKA 5|Ac-FLTD-CMK, inhibitor izveden iz GSDMD-a, spriječio je razvoj LN-a (lupus nefritis).

(A) Omjer albumina i kreatinina u urinu izračunat je u MRL/LPR miševa kojima je davan ili nije davan inhibitor GSDMD.

(B) Serumski kreatinin u MRL/LPR miševa kojima je dat ili nije dat inhibitor GSDMD.

(C) Reprezentativne slike uzoraka bubrega obojenih periodnom kiselinom – Schiff (PAS) i kvantificirani postotak glomeruloskleroze.

(D) Imunokemijsko bojenje CD3, CD4, F4/80 i GSDMD. (E) Kvantifikacija serumskih koncentracija IL-1b u MRL/LPR miševa kojima je davan ili nije davan inhibitor GSDMD.

Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM. #p < {{0}}.05,="" ##p=""><>

RASPRAVA

Kombinirana terapija je strategija koja obećava zbog veće stope CR i ukupnog odgovora, kraćeg vremena do remisije i manje nuspojava. Do sada nisu bili poznati temeljni molekularni mehanizmi kombinirane terapije. Nedavno su Fu i suradnici (6) liječili MRL/LPR miševe monoterapijama ili kombiniranom terapijom i proveli sveobuhvatnu analizu transkriptoma na cijelim bubrezima. Zanimljivo je da su otkrili da kombinirana terapija, ali ne i monoterapije, specifično i jedinstveno potiskuju ekspresiju kaspaze-1.

NLRP3/ASC/caspase-1 inflamasom sada je prepoznat kao ključni čimbenik u patogenezi LN (lupusnefritis). NLRP3 upale u podocitima aktiviraju se u miševa sklonih lupusu i također u pacijenata s LN (lupusnefritis). Kada su upale NLRP3 potisnute inhibitorom kaspaze-1, utvrđeno je da su se proteinurija, histološke lezije bubrega i brisanje procesa stopala podocita ublažili u miševa sklonih lupusu (8). Huang i sur. (27) izvijestili su da je NLRP3 eksprimiran u tubularnim stanicama LN (lupusnefritis) klasa IV i da je aktivacija NLRP3 bila u pozitivnoj korelaciji s rezultatom indeksa aktivnosti za pacijente s LN. Dokazano je da kaspaza-1 igra vitalnu ulogu u lupusu i vaskularnoj disfunkciji, te je stoga potencijalna meta za nove terapijske intervencije(28). Eksperimentalni lijekovi u nastajanju kao što su RIP3 (29), antagonisti receptora P2X7 (30), inhibitori GSK-3 (31) i agonist Nrf2 (32) inhibirali su razvoj LN (lupusnefritis) u MRL/LPR miševa modulacijom aktivnosti upale NLRP3/ASC/kaspaza-1, što naglašava važnost i kritičnost upale NLRP3/ASC/kaspaza-1 u LN. Povišene serumske koncentracije IL-18 u korelaciji su s težinom bolesti i stupnjem oštećenja/zahvaćenosti bubrega u pacijenata sa SLE (33). Koliko znamo, čini se da bi obitelj gasdermin mogla biti ključna za razvojpiroptoza, ali nije bilo dovoljno dokaza o prisutnosti GSDMD/GSDME u pacijenata sa SLE.

Sve u svemu, ispitali smo aktivaciju i ekspresiju GSDMD u uzorcima biopsije bubrega uzetih iz LN (lupusnefritis) pacijenata i MRL/LPR miševa. GSDMD je snažno induciran i cijepan u glomerularnim podocitima i tubularnim stanicama te infiltriranim intersticijskim stanicama. Zatim je MRL/LPR miševima dana kombinacija MMF-a, takrolimusa i prednizona ili nosača. U usporedbi s kontrolnom skupinom nosača, aktivacija kaspaze-1 i GSDMD-a bila je smanjena u skupini koja je primala kombinirani tretman. Stupanjpiroptozau perifernoj krvi također je bio mnogo niži u LN (lupusnefritis) bolesnika nakon primjene kombinirane terapije. Štoviše,piroptozau perifernoj krvi bila je u pozitivnoj korelaciji sa SLEDAI, što je sugeriralo dapiroptozau perifernoj krvi može djelovati kao značajan marker za SLE aktivnost. Stoga smo pretpostavili da bi kombinirana terapija mogla dati korisne učinke na LN (lupusnefritis) inhibiranjempiroptozaizazvan kaspazom-1/GSDMD. Prethodne studije kristalne strukture kaspaze-1 u kompleksu s Ac-FLTD-CMK otkrile su mnoge interakcije enzima i inhibitora koje su spriječile prepoznavanje GSDMD-a od strane kaspaze-1. Međutim, otkrili smo da Ac-FLTD-CMK, koji djeluje kao inhibitor izveden iz GSDMD-a, inhibirapiroptozau LN (lupusnefritis), što bi moglo biti izazvano drugačijim mehanizmom.

Nedavno, u TLR{0}}induciranom mišjem modelu SLE(34), GSDMD-/-miševi razvili su veći stupanj oštećenja bubrega i povećanu smrtnost, što je u početku sugeriralo da bi brisanje GSDMD-a imalo zaštitni učinak i bilo povezano s sistemska upala i proizvodnja autoantitijela s povezanom povećanom smrtnošću. Miševi s nedostatkom GSDMD-a razvijaju izraženije taloženje glomerularnog imunološkog kompleksa u uzorcima bubrega i veću proteinuriju u usporedbi s miševima divljeg tipa. Pojačano izlučivanje izvanstaničnog HMGB1 također je pronađeno u GSDMD-/limfocitima što ukazuje na nekrozu/piroptozadogodila kada je GSDMD bio odsutan.

Caspase-1 okidačipiroptozacijepanjem GSDMD. Nasuprot tome, u stanicama s nedostatkom GSDMD-a ili s niskim GSDMD-om, kaspaza-1 pokreće apoptozu, a zatim sekundarnu nekrozu ovisnu o GSDME-u ipiroptoza. Kada GSDMD aktivnost izostane nakon terapije, GSDME bi možda također mogao prebaciti kaspazom-3-posredovanu apoptozu napiroptoza(35,36). Osim toga, aktivacija kaspaze-8 bila je znatno pojačana u makrofagima koji su bili deficijentni GSDMD-om. Značajna aktivacija kaspaze-8 također je pronađena u LN-u s nedostatkom GSDMD-a izazvanom TLR7- (lupusnefritis) miševi(34). Prema tome, u nedostatku GSDMD-a, vjerojatno je da kaspaza-1 surađuje s kaspazom-8 kako bi izazvala apoptozu posredovanu kaspazom-3-GSDME da se prebaci napiroptozau LN (lupusnefritis), hipoteza koja zahtijeva daljnje eksperimentalno istraživanje.

Postoji nekoliko ograničenja u trenutnoj studiji. Prvo, na temelju trenutnih podataka, potvrdili smo da kombinirana terapija može suzbitipiroptoza, ali drugi tretmani poput dvojne terapije steroidima i MMF-om, steroidima i takrolimusom ili anti-CD20 protutijelima također mogu imati usporedive učinke. Drugo, točan molekularni mehanizam učinka inhibicije kombinirane terapije na kaspazu-1 nije dobro istražen. Posljednje, ali ne i najmanje važno, promatramo odnos dvostruko pozitivnih stanica na kaspazu-1/PI u perifernoj krvi sa SLE-DAI i promjenu prije i nakon liječenja kombiniranom terapijom u retrospektivnoj LN (lupusnefritis) skupina pacijenata. Kliničku prediktivnu vrijednost kaspaza-1/PI dvostruko pozitivnih stanica za aktivnost bolesti i odgovor na liječenje potrebno je dodatno istražiti u većoj prospektivnoj kohorti.

Sve u svemu, utvrdili smo da je kombinirana terapija dala svoje korisne učinke potiskivanjem kaspaze-1/GSDMD-apiroptozau LN (lupusnefritis), koji je pružio novi uvid u uključene stanične mehanizme. Doista, kombinirana terapija je specifično i jedinstveno potisnula ekspresiju kaspaze-1. Farmakološka ili genetska inhibicija NLRP3 i kaspaze-1 poboljšala je bubrežnu funkciju i potisnula autoimunost u LN (lupusnefritis). Patofiziološka uloga kaspaze-1 u LN (lupusnefritis) je vrijedan daljnjeg proučavanja, a terapije usmjerene na GSDMD u bolesnika s LN (lupusnefritis) potrebno je vrlo pažljivo procijeniti.

Metoda liječenja zapiroptoza

REFERENCE

1. Saxena R, Mahajan T, Mohan C.LupusNefritis: Current Update.Arthritis Res The (2011)13:240.doi: 10.1186/ar3378

2. An Y, Zhang H, Liu Z. Individualizirajuća terapija uLupusNefritis. Kidney Int Rep (2019)4:1366-72.doi: 10.1016/j.ekir.2019.08.005

3. Bao H, Liu ZH, Xie HL, Hu WX, Zhang HT, LiLS. Uspješno liječenje Klase V plus IVLupusNefritisUz multitargetnu terapiju. J Am Soc Nephrol (2008)19:2001-10.doi: 10.1681/ASN.2007121272

4. Liu Z, Zhang H, Liu Z, Xing C, Fu P, Ni Z, et al. Multitarget Therapy for Induction Treatment ofLupusNefritis: A Randomized Trial, Ann Intern Med (2015)162:18-26. DOI: 10.7326/M14-1030

5. Zhang H, Liu Z, Zhou M, Liu Z, Chen J, Xing C, et al. Multitarget Therapy for Maintenance Treatment ofLupusNefritis. J Am Soc Nephrol (2017) 28:3671-8.doi:10.1681/ASN.2017030263

6. Fu J, Wang Z, Lee K, Wei C, Liu Z, Zhang M, et al. Transkriptomska analiza otkriva nove sinergističke mehanizme u kombiniranoj terapiji zaLupusNefritis. Kidney Int(2018)93:416-29.doi: 10.1016/j.kint.2017.08.031

7. Ummarino D.LupusNefritis: NLRP3 inflammasome izaziva disfunkciju podocita. Nat Rev Rheumatol (2017) 13: 451. doi: 10.1038/Orpheum. 2017.9