Disregulacija transpozibilnog elementa RNA u mutantnim KRAS(G12C) 3D sferoidima raka pluća

SAŽETAK

Mutant KRAS regulira prijenosni element (TE) RNA i ekspresiju gena stimuliranog interferonom (ISG), ali ostaje nejasno utječu li različite mutacije u KRAS-u na različite TE RNA u cijelom genomu. Analizirali smo transkriptome 3D sferoida ljudskog raka pluća koji sadrže mutacije KRAS(G12C) kako bismo odredili krajolik TE RNA reguliran mutiranim KRAS(G12C). Otkrili smo da je KRAS(G12C) signalizacija potrebna za ekspresiju LINE- i LTR-izvedenih TE RNA koje se razlikuju od TE RNA za koje je prethodno pokazano da ih reguliraju mutirani KRAS(G12D) ili KRAS(G12V). Štoviše, inhibicija KRAS(G12C) posebno pojačava TE RNA izvedene iz SINE iz najmlađe Alu podfamilije AluY. Naši rezultati otkrivaju da je disregulacija TE RNA u stanicama raka pluća potaknutih KRAS-om ovisna o mutaciji, dok također ističu podskup mladih TE RNA izvedenih iz Alu-a koje se koordinirano aktiviraju s genima urođene imunosti nakon inhibicije KRAS(G12C).

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

UVOD

RNA prijenosnih elemenata (TE) stalno su disregulirane u kontekstu raka 1. U mutiranim KRAS stanicama raka pluća, geni KRAB cinkovog prsta (KZNF) općenito su smanjeni, što dovodi do nenormalne regulacije TE RNA izvedenih iz LINE, SINE i LTR elementi 2,3. Uz TE RNA, duge nekodirajuće RNA (lncRNA) također su koordinirano regulirane s RAS signalnim genima 4, a obrasci njihove ekspresije na sličan su način promijenjeni u mnogim vrstama raka 5-8. Za TE RNA, njihova pojačana regulacija kod raka izaziva stanje virusne mimikrije, što dovodi do intrinzične aktivacije gena urođene imunosti kao što su geni stimulirani interferonom (ISG) 3,9,10. Konkretno, Alu obitelj SINE je dominantan izvor imunogenih TE RNA 11, koje su inducirane epigenetskim promjenama uzrokovanim inhibitorima DNA metiltransferaze (DNMTi) ili inhibicijom KZNF posredovane mutantnim KRAS-om 3,9,10.

Da bismo istražili kako uobičajena mutacija u KRAS utječe na krajolik TE RNA u stanicama raka pluća, karakterizirali smo transkriptome 3D sferoida raka pluća koji sadrže KRAS(G12C) mutacije u prisutnosti ili odsutnosti mutantnog KRAS(G12C) inhibitora 12. Pokazujemo da je signaliziranje KRAS(G12C) potrebno za ekspresiju TE RNA izvedenih iz LINE i LTR, dok inhibicija KRAS(G12C) specifično pojačava TE RNA izvedene iz SINE i podskup gena povezanih s interferonom (IFN). Naša otkrića otkrivaju složeno međudjelovanje između signaliziranja mutiranog KRAS-a i disregulacije TE u stanicama raka pluća, gdje se definirani skup mladih AluY elemenata regulira prema gore na način ovisan o mutaciji.

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

REZULTATI

Inhibicija KRAS(G12C) mijenja kodirajući i nekodirajući transkriptom

Da bismo odredili kako onkogena KRAS(G12C) signalizacija regulira kodirajući i nekodirajući transkriptom, izveli smo RNA sekvenciranje (RNA-seq) na 3D mutantnim KRAS(G12C) sferoidima raka pluća. Za RNA-seq koristili smo protokol pune duljine s 5' jedinstvenim molekularnim identifikatorima (UMI) kako bismo omogućili precizno brojanje RNA dok smo umanjili pristranosti PCR amplifikacije 13 (Slika 1A). Usporedili smo transkriptome sferoida raka pluća H358 liječenih KRAS(G12C) inhibitorom ARS-1620 (ARS) sa kontrolnim sferoidima (tretiranim DMSO) (Slika S1A) i vidjeli da je liječenje ARS-om značajno smanjilo razine fosforiliranog ERK (p-ERK) (Slika S1B), što ukazuje da je liječenje ARS-om inhibiralo nizvodno signaliziranje KRAS(G12C). Potiskivanje signalizacije KRAS(G12C) liječenjem ARS-om također je dokazano smanjenjem veličine sferoida i održivosti stanica (slika S1C i S1D).

Na razini RNA, procijenili smo relativnu zastupljenost različitih biotipova i superfamilija TE u 3D sferoidima raka pluća tretiranim s ARS-om ili DMSO-om, koji su otkrili dinamičke promjene u sastavu TE RNA nakon inhibicije KRAS(G12C) (Slika 1B). Dok smo otkrili samo 32% gena za kodiranje proteina s oznakom GENCODE i 15% gena lncRNA, 92-96% TE superfamilija (92% LTR, 95% SINE, 96% LINE) bile su zastupljene u našim UMI oznakama RNA-seq podaci koji otkrivaju široku disregulaciju TE RNA u transkriptomu koji pokreće KRAS(G12C). Do četvrtine svih otkrivenih molekula RNA u sferoidima raka pluća liječenih ARS-om izvedene su iz TE, što ukazuje da TE RNA predstavljaju znatan dio transkripcijskog izlaza mutantnih KRAS(G12C) stanica raka pluća.

koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav

Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda za jačanje imuniteta

【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Zatim smo odredili značajno različito izražene gene između 3D sferoida raka pluća tretiranih ARS-om i DMSO-om kako bismo identificirali biološke procese koji su regulirani onkogenim KRAS(G12C) signaliziranjem. Sferoidi raka pluća s intaktnom KRAS(G12C) signalizacijom značajno su obogaćeni za gene uključene u G2M kontrolnu točku, E2F ciljeve, MYC ciljeve i mitotičko vreteno (Slika 1C). Međutim, nakon inhibicije KRAS(G12C), sferoidi raka pluća iskazali su značajno više razine gena uključenih u oksidacijsku fosforilaciju, komplement i IFN alfa i gama odgovore (Slika 1C), pružajući daljnje potporne dokaze za uključenost KRAS signalizacije u regulaciju gena povezanih s IFN-om 2,3.

Inhibicija KRAS(G12C) koordinirano inducira ISG i mlade AluY elemente

Kako bismo dodatno razjasnili intrinzičnu regulaciju ISG-a nakon inhibicije KRAS(G12C), identificirali smo koji su geni i TE-ovi značajno različito izraženi u svakom skupu gena, odnosno superfamiliji TE. Među genima odgovora na IFN alfa i IFN gama, najsnažnije inducirani gen na inhibiciju KRAS(G12C) u sferoidima raka pluća bio je RTP4 (Slika 2A), receptorski prijenosni protein koji negativno regulira signaliziranje TBK1 14. Dodatno, MHC kompleks klase I gen beta-2-mikroglobulina (B2M), koji se opetovano inaktivira kod raka pluća 15, također je značajno pojačan u oba skupa gena povezanih s IFN-om u sferoidima raka pluća liječenih ARS-om (Slika 2A).

S obzirom na izravnu ulogu onkogenog KRAS signaliziranja u TE RNA regulaciji 3, istražili smo koje podfamilije TE RNA ovise o mutiranom KRAS(G12C). U sferoidima raka pluća s intaktnom KRAS(G12C) signalizacijom, otkrili smo da su LINE podfamilije L1M6B i L1PA12 bile visoko izražene i ovisne o KRAS(G12C), što je dokazano njihovom nižom regulacijom u sferoidima raka pluća liječenih ARS-om (Slika 2B). Štoviše, dok je samo jedna DNK podfamilija MER44D ovisila o KRAS(G12C) signalizaciji, više od desetak LTR podfamilija regulirano je mutiranim KRAS(G12C), uključujući MLT1A0-int, LTR51, MER50B i LTR1B0 (Slika 2B). Nasuprot tome, sve podfamilije SINE bile su značajno pojačane nakon inhibicije KRAS(G12C) i koordinirano inducirane sa specifičnim ISG genima (Slika 2A) u sferoidima raka pluća. Sve ove SINE TE RNA izvedene su iz potporodice AluY (Slika 2B), što ukazuje da inhibicija KRAS(G12C) disregulira specifičnu podskupu mladih AluY elemenata.

Inhibicija KRAS(G12C) smanjuje duge nekodirajuće RNA

Kako bismo dodatno razjasnili učinke inhibicije KRAS(G12C) na transkriptom, ispitali smo sve značajno različito izražene lncRNA u sferoidima raka pluća tretiranih s ARS ili DMSO kontrolom. Otkrili smo da je ekspresija velikog broja lncRNA ovisna o KRAS(G12C) signalizaciji, jer su mnoge od tih lncRNA bile značajno smanjene nakon inhibicije KRAS(G12C) (Slika 3A). Tri od ovih smanjeno reguliranih lncRNA, AC114546.3, NCMAP-DT i AC073575.2, nemaju poznate funkcije, ali se preklapaju u antisense orijentaciji s kodirajućim genima ZNF770, RCAN3 i ERP29, redom. Kao klasu nekodirajuće RNA, primijetili smo široko smanjenje lncRNA nakon liječenja ARS-om u sferoidima raka pluća (Slika 3B), što ukazuje da mnoge lncRNA ovise o KRAS(G12C) signalizaciji za njihovu ekspresiju.

koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav

RASPRAVA

Ovdje pokazujemo da je onkogena KRAS(G12C) signalizacija potrebna za ekspresiju specifičnih superfamilija TE, naime LINE i LTR elemenata, kao i podskupa lncRNA, dodatno pokazujući kako RAS signalizacija regulira nekodirajući transkriptom 2-4. Također smo upotrijebili 3D sferoidni model raka pluća za naše eksperimente s KRAS(G12C) inhibitorom budući da se pokazalo da 3D modeli vjernije rekapituliraju in vivo odgovor na lijek u usporedbi s 2D modelima kulture 16. Nadalje, naša primjena pune metode koja se temelji na UMI-ju Tehnika RNA-seq duljine 13 omogućila nam je točnije snimanje sastava i dinamike TE RNA u našim sferoidima raka pluća uklanjanjem PCR duplikata u našim RNA-seq podacima.

Naši su nalazi u skladu s prethodnim studijama inhibicije KRAS(G12C), gdje su geni odgovora na IFN alfa i gama bili pojačano regulirani u stanicama raka pluća H358 tretiranih ARS-om 17. Na temelju poznatih imunogenih svojstava RNA izvedenih iz Alu-a 11, naši rezultati sugeriraju da specifična pojačana regulacija mladih AluY elemenata nakon inhibicije KRAS(G12C) je barem djelomično odgovorna za snažnu pojačanu regulaciju ISG-ova u sferoidima raka pluća liječenih ARS-om. Značajno obogaćivanje gena povezanih s IFN-om kao odgovor na liječenje inhibitorom KRAS(G12C) ne uključuje daljnju regulaciju RNA senzorskih ISG-ova kao što su MDA-5, RIG-I ili PKR, koji u početku postaju regulirani na gore u stanice pluća kao odgovor na onkogenu signalizaciju KRAS 2,3.

Prethodno smo pokazali da je samo signaliziranje mutiranog KRAS-a dovoljno za induciranje regulacije TE RNA u stanicama ljudskih pluća koje su transformirane in vitro 2,3, a naši ovdje opisani rezultati proširuju ova opažanja na stanice raka pluća s različitom aktivirajućom mutacijom KRAS-a. KRAS(G12D) ili KRAS(G12V) mutacije induciraju značajnu regulaciju potporodice LTR12C u transformiranim stanicama pluća 3, ali nismo vidjeli značajno obogaćivanje TE RNA izvedenih iz LTR12C u našim KRAS(G12C) sferoidima raka pluća. Umjesto toga, vidjeli smo pojačanu regulaciju LTR51, LTR1B0, LTR14B i LTR28B, što sugerira da različite mutacije povećanja funkcije u KRAS reguliraju različite aspekte TE RNA transkriptoma.

Naš rad pruža sveobuhvatnu procjenu načina na koji nekodirajući/TE RNA transkriptom dinamički reagira na inhibiciju KRAS(G12C). Buduće studije mogle bi pružiti nove uvide u potencijalne uloge nekodirajućih/TE RNA u mehanizmima otpornosti na KRAS(G12C) inhibitore. Nadalje, TE RNA koje se izlučuju iz stanica raka nakon inhibicije KRAS-a mogu poslužiti kao izvanstanični RNA biomarkeri 2,3,5,18,19 odgovora i/ili otpornosti na terapije inhibitorima KRAS-a 20.

MATERIJALI I METODE

Stanične linije

H358 stanične linije raka pluća koje sadrže KRAS(G12C) mutaciju uzgajane su u mediju RPMI 1640 (Invitrogen) dopunjenom s 10% fetalnog goveđeg seruma (Sigma) na 37 stupnjeva, 5% CO2 u vlažnom inkubatoru. Sve stanične linije bile su negativne na mikoplazmu. Stanične linije su kupljene od American Type Culture Collection (ATCC).

Testovi viabilnosti stanica

Za testove održivosti sferoida, 10,000 stanica/jažici je nasađeno u ploče sa 96-okruglim dnom niske adhezije i inkubirano na 37 stupnjeva, 5% CO2 tijekom 24 sata. Zatim su stanicama dodani serijski razrijeđeni ARS- 1620 ili DMSO, a ploče su inkubirane u standardnim uvjetima kulture 72 sata, sa svježim ARS i DMSO medijima koji su se svakodnevno mijenjali. Viabilnost stanica mjerena je korištenjem kompleta Cell Titer-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega) u skladu s protokolom proizvođača. Signal luminiscencije uzoraka tretiranih s ARS-om normaliziran je na DMSO kontrolu. Luminescencija je mjerena na SpectraMax iD3 molekularnom uređaju.

RNA izolacija

Ukupna masovna RNA izolirana je iz približno 100 H358 sferoida (po stanju) pomoću kompleta Quick-RNA Mini-Prep (Zymogen) prema protokolu proizvođača. RNA je kvantificirana pomoću NanoDrop-8000 spektrofotometra.

Priprema RNA-seq knjižnice

Prilagođeni Smart-seq3 protokol 13 korišten je za generiranje RNA-seq biblioteka iz ukupne RNA za brojanje i procjenu RNA molekula pune duljine. Ukratko, 10ng ukupne RNA je obrnuto transkribirano upotrebom barkodirane oligoDT početnice (125 nM), nakon čega je uslijedila promjena predloška s barkodiranom predloškom preklopnog oligo (125 nM). Ove oligo sekvence poslužile su kao početnice za PCR amplifikaciju. Nextera HT kit (Illumina) korišten je za pretvaranje biblioteka cDNA u biblioteke za sekvenciranje uz dodatak UMI-specifičnog primera za pojačavanje krajeva cDNA koji sadrže molekularne bar kodove kao što je opisano u protokolu Smart-seq3. Kvaliteta cDNA i biblioteke procijenjena je korištenjem Agilent bioanalizatora DNA čipa visoke osjetljivosti i kvantificirana korištenjem visokoosjetljivog DNA testa na Qubit 3.0.

Zapadnjački blot

Otprilike 100 H358 sferoida (po stanju) izolirano je nakon tretmana ARS-om ili DMSO-om. Sferoidi su zatim inkubirani na ledu u RIPA puferu dopunjenom inhibitorom proteaze 15 minuta. Lizati su zatim centrifugirani na 10,000 RCF 10 minuta. Supernatant je zatim prebačen u novu epruvetu za naknadnu pripremu uzorka SDS-PAGE u Laemmli puferu, kuhan 5 minuta na 95 C za konačnu koncentraciju od 1 mg/ml. SDS PAGE je izveden da se odvoji protein prema veličini nakon čega je uslijedio prijenos na PVDF membranu. Membrane su inkubirane s primarnim p-ERK (CST) i HSP90 (CST) antitijelima preko noći na 4°C. Sekundarna antitijela (Abcam) su zatim inkubirana na 3 puta TBST ispranim membranama u puferu za blokiranje za kasnije snimanje.

koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav

UMI deduplikacija

Uparena krajnja ilumina očitavanja su dotjerana pomoću adaptera pomoću FastP 21 sa zadanim postavkama. UMI-jevi su ekstrahirani iz readname-a i premješteni u readname pomoću umi_tools_extract iz paketa UMI-tools 22 s uzorkom crtičnog koda postavljenim na "NNNNNNNN". Očitavanja koja su uklonjena s UMI-ja usklađena su s HG38 pomoću alata za poravnanje STAR sa skupom komentara GENCODE v38. Usklađena čitanja deduplicirana su pomoću "UMI-tools dedup" sa zadanim postavkama.

RNA-seq analiza

Sve fastq datoteke obrezane su pomoću Trimmomatica 2 (0.38) 23, a rezultirajuće obrezane datoteke procijenjene su pomoću FastQC 24 i zatim obrađene sljedećim analitičkim cjevovodom: Salmon (1.3.0): pseudoporavnanje RNK -seq čitanja koja se izvode sa Salmonom 25 pomoću sljedećih argumenata: {{1{{20}}}}validateMappings –gcBias --seqBias --recoverOrphans --rangeFactorizationBins 4 pomoću indeks stvoren iz GENCODE verzije 35 transkriptoma fasta datoteke upotrebom sekvenci mamaca za omogućavanje selektivnog poravnanja. Dodatni, TE-svjesni indeks stvoren je na sličan način, ali dopunjen sekvencama generiranim iz UCSC Repeat Masker zapisa. DESeq2 (1.32.0): Salmon izlaz je uvezen u DESeq objekt pomoću tximporta 26 i izvedena je diferencijalna analiza izraza sa standardnim argumentima 27. Svi rezultati su filtrirani da imaju padj < 0,05. Tamo gdje su korišteni podaci o brojanju, normalizirani su u uzorcima pomoću DESeq-a.

Analiza obogaćivanja skupa gena

Diferencijalno izraženi geni rangirani su prema smanjenim vrijednostima log2FoldChange koje je generirao DESeq2. Skupovi gena dobiveni su pomoću R paketa msigdbr (7.4.1) i filtrirani da sadrže samo skupove gena sa statusom 'Hallmark'. R paket fgsea (1.18.0) korišten je za generiranje procjena obogaćivanja skupa gena koje su filtrirane u rezultate s prilagođenim pvrijednostima < 0.05.

REFERENCE

1. Burns, KH (2017). Prenosni elementi kod raka. Nat Rev Cancer 17, 415-424. 10.1038/nrc.2017.35.

2. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L., Kim, E., Malik, S., Fernandes, J., et al. (2020). Epigenomsko reprogramiranje ponavljajućih nekodirajućih RNA i gena stimuliranih IFN-om mutiranim KRAS-om. bioRxiv, 2020.2011.2004.367771. 10.1101/2020.11.04.367771.

3. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Hrabeta-Robinson, E., Behera, A., Peddu, V., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L ., et al. (2022). Mutant KRAS regulira prenosivi element RNA i urođeni imunitet preko KRAB gena cinkovog prsta. Izvješća o stanicama 40. 10.1016/j.celrep.2022.111104.

4. Kim, DH, Marinov, GK, Pepke, S., Singer, ZS, He, P., Williams, B., Schroth, GP, Elowitz, MB, i Wold, BJ (2015.). Analiza transkriptoma jedne stanice otkriva dinamičke promjene u ekspresiji lncRNA tijekom reprogramiranja. Matična stanica 16, 88-101. 10.1016/j.stem.2014.11.005.

5. Reggiardo, RE, Maroli, SV, i Kim, DH (2022). LncRNA biomarkeri upale i raka. Adv Exp Med Biol 1363, 121-145. 10.1007/978-3-030-92034-0_7.

6. Schmitt, AM, i Chang, HY (2016). Duge nekodirajuće RNA u putevima raka. Stanica raka 29, 452-463. 10.1016/j.ccell.2016.03.010.

7. Rinn, JL, i Chang, HY (2020). Duge nekodirajuće RNA: molekularni modaliteti organskih funkcija. Annu Rev Biochem 89, 283-308. 10.1146/annurev-biochem- 062917-012708.

8. Slack, FJ, i Chinnaiyan, AM (2019). Uloga nekodirajućih RNA u onkologiji. Ćelija 179, 1033-1055. 10.1016/j.cell.2019.10.017.

9. Chiappinelli, Katherine B., Strissel, Pamela L., Desrichard, A., Li, H., Henke, C., Akman, B., Hein, A., Rote, Neal S., Cope, Leslie M. , Snyder, A., et al. (2015). Inhibicija metilacije DNA uzrokuje interferonski odgovor kod raka preko dsRNA uključujući endogene retroviruse. Ćelija 162, 974-986. 10.1016/j.cell.2015.07.011.

10. Roulois, D., Loo Yau, H., Singhania, R., Wang, Y., Danesh, A., Shen, Shu Y., Han, H., Liang, G., Jones, Peter A., Pugh, Trevor J., et al. (2015). Agensi za demetilaciju DNA ciljaju na stanice kolorektalnog raka inducirajući mimikriju virusa pomoću endogenih transkripata. Ćelija 162, 961-973. 10.1016/j.cell.2015.07.056.

11. Mehdipour, P., Marhon, SA, Ettayebi, I., Chakravarthy, A., Hosseini, A., Wang, Y., de Castro, FA, Loo Yau, H., Ishak, C., Abelson, S. ., et al. (2020). Epigenetska terapija potiče transkripciju invertiranih SINE i ovisnost o ADAR1. Priroda 588, 169-173. 10,1038/s41586-020-2844-1.

12. Ostrem, JM, Peters, U., Sos, ML, Wells, JA, i Shokat, KM (2013.). Inhibitori K-Ras(G12C) alosterički kontroliraju GTP afinitet i efektorske interakcije. Nature 503, 548- 551. 10.1038/nature12796.

13. Hagemann-Jensen, M., Ziegenhain, C., Chen, P., Ramskold, D., Hendriks, GJ, Larsson, AJM, Faridani, OR, i Sandberg, R. (2020.). Brojanje jednostanične RNA pri rezoluciji alela i izoforme pomoću Smart-seq3. Nat Biotechnol 38, 708-714. 10,1038/s41587-020- 0497-0.

14. He, X., Ashbrook, AW, Du, Y., Wu, J., Hoffmann, HH, Zhang, C., Xia, L., Peng, YC, Tumas, KC, Singh, BK, et al. (2020). RTP4 inhibira IFN-I odgovor i pojačava eksperimentalnu cerebralnu malariju i neuropatologiju. Proc Natl Acad Sci USA 117, 19465- 19474. 10.1073/pnas.2006492117.

15. Pereira, C., Gimenez-Xavier, P., Pros, E., Pajares, MJ, Moro, M., Gomez, A., Navarro, A., Condom, E., Moran, S., Gomez- Lopez, G. i sur. (2017). Genomsko profiliranje ksenografta izvedenih od pacijenata za rak pluća identificira B2M inaktivaciju koja oštećuje imunoprepoznavanje. Clin Cancer Res 23, 3203-3213. 10.1158/1078-0432.CCR-16-1946.

16. Sen, C., Freund, D. i Gomperts, BN (2022). Trodimenzionalni modeli pluća: prošlost, sadašnjost i budućnost: mini prikaz. Biochem Soc Trans 50, 1045-1056. 10.1042/BST20190569. 17. Mugarza, E., van Maldegem, F., Boumelha, J., Moore, C., Rana, S., Llorian Sopena, M., East, P., Ambler, R., Anastasiou, P., Romero -Clavijo, P. i sur. (2022). Terapeutska inhibicija KRAS(G12C) pokreće učinkovitu antitumorsku imunost posredovanu interferonom kod imunogenih karcinoma pluća. Sci Adv 8, eabm8780. 10.1126/sciadv.abm8780.

18. Khojah, R., Reggiardo, RE, Ozen, M., Maroli, SV, Carrillo, D., Demirci, U., i Kim, DH (2022.). Izvanstanični RNA potpisi mutantnih KRAS(G12C) stanica adenokarcinoma pluća. bioRxiv, 2022.2002.2023.481574. 10.1101/2022.02.23.481574.

19. Wang, J., Ma, P., Kim, DH, Liu, BF, i Demirci, U. (2021.). Prema mikrofluidnoj izolaciji i detekciji egzosoma za terapiju tumora. Nano danas 37. 10.1016/j.nantod.2020.101066.

20. Moore, AR, Rosenberg, SC, McCormick, F., i Malek, S. (2021). RAS-ciljane terapije. Nat Rev Drug Discov. 10,1038/s41573-021-00220-6.

21. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., i Gu, J. (2018.). fastp: ultrabrzi sve-u-jednom FASTQ predprocesor. Bioinformatika 34, i884-i890. 10.1093/bioinformatika/bty560.

22. Smith, T., Heger, A. i Sudbery, I. (2017.). UMI-alati: modeliranje pogrešaka sekvenciranja u jedinstvenim molekularnim identifikatorima za poboljšanje točnosti kvantifikacije. Genom Res 27, 491- 499. 10.1101/gr.209601.116.

23. Bolger, AM, Lohse, M. i Usadel, B. (2014.). Trimmomatic: fleksibilni trimer za Illumina sekvencijske podatke. Bioinformatika 30, 2114-2120. 10.1093/bioinformatika/btu170.

24. Brown, J., Pirrung, M. i McCue, LA (2017.). Nadzorna ploča FQC-a: integrira rezultate FastQC-a u interaktivni i proširivi FASTQ alat za kontrolu kvalitete koji se temelji na webu. Bioinformatika. 10.1093/bioinformatika/btx373.

25. Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA, i Kingsford, C. (2017.). Salmon pruža brzu kvantifikaciju ekspresije transkripta koja je svjesna pristranosti. Nat metode 14, 417-419. 10.1038/nmeth.4197.

26. Soneson, C., Love, MI, i Robinson, MD (2015.). Diferencijalne analize za RNA-seq: procjene na razini transkripta poboljšavaju zaključke na razini gena. F1000Res 4, 1521. 10.12688/f1000istraživanje.7563.2.

27. Love, MI, Huber, W. i Anders, S. (2014.). Moderirana procjena promjene nabora i disperzije za RNA-seq podatke s DESeq2. Genom Biol 15, 550. 10.1186/s13059-014- 0550-8.

ZAHVALA

Zahvaljujemo članovima Kim Laba na korisnim raspravama. Ovaj rad potpomognut je sredstvima Baskin School of Engineering (pri DHK). DC je dobio potporu preddoktorske stipendije Programa za istraživanje bolesti povezanih s duhanom (T30DT0997), RER je dobio potporu F99/K00 NIDDK KUH nagrade za prijelaz preddoktorskog u postdoktorskog suradnika Nacionalnog instituta za zdravlje (1F99DK{ {7}}), a VP je dobio potporu preddoktorske stipendije Programa za istraživanje bolesti povezanih s duhanom (T32DT4904).

AUTORSKI PRILOZI

DHK je konceptualizirao istraživanje, DC i DHK su dizajnirali istraživanje, DC, JL i GM izveli su eksperimente, RER i VP su analizirali podatke, a DC i DHK napisali su rad uz doprinos autora.

FIGURE

Slika 1. Inhibicija KRAS(G12C) mijenja kodirajući i nekodirajući transkriptom A. Eksperimentalna shema. B. Distribucija brojanja dodijeljenih GENCODE kodiranju, lncRNA i TE/repeat superfamilijama u bibliotekama sferoidnih RNA-seq karcinoma pluća tretiranih ARS-om (ars) ili DMSO-om (DMSO), gdje svaki stupac predstavlja biološki replikat. C. Značajni rezultati analize obogaćenja skupa gena opaženi u sferoidima raka pluća tretiranih DMSO-om (desno, pozitivan NES) ili ARS-om (lijevo, negativan NES) korištenjem različito eksprimiranih gena rangiranih prema normaliziranom rezultatu obogaćivanja (NES).

Slika 2. Inhibicija KRAS(G12C) koordinirano inducira ISG i mlade AluY elemente

A. Dijagrami vulkana koji prikazuju značajnu razliku u ekspresiji opaženoj u ključnim setovima gena između sferoida raka pluća tretiranih DMSO-om (desno, pozitivna promjena nabora) ili ARS-om (lijevo, negativna promjena nabora). B. Dijagrami vulkana koji prikazuju značajnu razliku u ekspresiji opaženoj u TE superfamilijama između sferoida raka pluća tretiranih DMSO (desno, pozitivna promjena nabora) ili ARS-om (lijevo, negativna promjena nabora).

Slika 3. Inhibicija KRAS(G12C) smanjuje duge nekodirajuće RNA

A. Vulkanski dijagram značajne diferencijalne ekspresije GENCODE proteina koji kodira RNA i lncRNA između sferoida raka pluća tretiranih DMSO (desno, pozitivna promjena nabora) ili ARS-om (lijevo, negativna promjena nabora). B. Okvirni dijagram značajne diferencijalne ekspresije GENCODE proteina koji kodira RNA i lncRNA između sferoida raka pluća tretiranih DMSO (gore, pozitivna promjena nabora) ili ARS-om (dolje, negativna promjena nabora) (Wilcoxon).

DOPUNSKA FIGURA

Slika S1.

A. H358 3D sferoidi raka pluća liječeni ARS-om ili DMSO-om. B. Western blot za p-ERK i HSP90 korištenjem H358 3D sferoida raka pluća tretiranih s ARS ili DMSO. C. Mjerenja promjera (u mikrometrima) (lijevi grafikon) i održivost stanica (Cell Titer-Glo® luminescentna vitalnost stanica u relativnim jedinicama fluorescencije) (desni grafikon) H358 3D sferoida raka pluća tretiranih s ARS-om ili DMSO-om nakon 3 ili 5 dana liječenja (500 nM ARS-1620 ili DMSO). D. Mjerenja promjera (u mikrometrima) H358 3D sferoida raka pluća tretiranih različitim koncentracijama ARS-1620 (nM) tijekom 7 dana.