Tolerancija na NADH/NAD plus neravnoteža predviđa starenje i intervencije protiv starenja

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

SAŽETAK

Redox parovi koordiniraju staničnu funkciju, ali posljedice njihove neravnoteže nisu jasne. To je donekle povezano s ograničenjima njihove eksperimentalne kvantifikacije. Ovdje zaobilazimo ove poteškoće predstavljajući pristup koji karakterizira profile tolerancije temeljene na fitnessu na neravnoteže redoks para koristeći silikonski prikaz metabolizma. Usredotočujući se na redoks par NADH/NAD1 u kvascu, pokazujemo da reduktivna neravnoteža stvara metaboličke sindrome usporedive s onima opaženim u stanicama raka.dobrobiti ekstrakta cistancheTolerancija mutanata kvasca na redoks neravnotežu također može objasniti 30 posto varijabilnosti u njihovom eksperimentalno izmjerenom kronološkom životnom vijeku. Štoviše, predviđanjem važnosti nekih metabolita za pomoć u podnošenju neravnoteže, ispravno identificiramo hranjive tvari u podlozi mehanizama patologije, molekula koje štite životni vijek ili oponašatelja ograničenja kalorija. Tolerancija na redoks neravnoteže postaje, na ovaj način, zvuk koji pruža okvir za prepoznavanje svojstava fenotipa starenja, dok je u skladu s biološkim obrazloženjem za procjenu intervencija protiv starenja.

UVOD

Istraživanja o redoks homeostazi znatno su se proširila tijekom posljednja dva desetljeća, neprestano preoblikujući klasične predodžbe o oksidativnom staničnom oštećenju (Halliwell i Gutteridge, 2015.). Među najparadigmatičnijim molekularnim agensima koji leže u osnovi ove homeostaze pojavljuju se omjeri redoks parova, poput onih konjugiranih oblika glutationa, NADPH i NADH. I glutation i NADPH djeluju kao bitni mehanizmi za uklanjanje reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) u mitohondrijima, dok NADPH i NADH spajaju anaboličke i kataboličke putove, respektivno, s redoks stanjem stanice.

Kliknite ovdje da saznate više

Unatoč tome, i dalje se prepoznaju novi mehanizmi koji povezuju parove NADPH/NADP* i NADH/NAD* s redoks homeostazom. Na primjer, ravnoteža NADPH/NADP plus djelomično objašnjava posljedice protein kinaze aktivirane AMP-om za preživljavanje (She et al., 2014). Također, povezuje cirkadijalno mjerenje vremena s redoks stanjima (Rey et al., 2016.). Trenutačno se smatra da je omjer NADH/NAD plus uključen u koordinaciju mitohondrijske i nuklearne funkcije, epigenetsku regulaciju popravka DNK i stanični identitet te ugađanje energetskog metabolizma varijablama okoliša (Canto et al., 2015; Gomes et al. dr. 2013). U nepatološkim stanjima, omjer NADH/NAD* fluktuira s napetosti kisika, s hipoksičnim uvjetima i većom dostupnošću kisika koji se odgovarajuće pojavljuju zajedno s redukcijskim i oksidativnim odstupanjima (Clanton, 2007; Graef i sur., 1999).

Ali rastući interes za omjere redoks parova uglavnom dolazi od njihovih implikacija u patologiji.cistanche Genghis KhanPojava ROS-a u reduktivnom (hipoksičan, sklon NADH) i oksidativnom (hiperoksičan, sklon NAD plus) osjetu povezana je s odstupanjima od optimalnog redoks potencijala koji osigurava najbolju izvedbu mitohondrija (Aon et al., 2010. ; Clanton, 2007). Što se tiče raka, smanjeni NADH/NAD plus može biti temelj smrtnosti glioblastoma (Gujar et al., 2016.) i pospješiti napredovanje raka debelog crijeva (Hong et al., 2019.), ali također može spasiti neke zdrave fenotipove u različitim stupnjevima u stanicama od druge vrste tumora (Garrido i Djouder, 2017.).

Cistanche može spriječiti starenje

NADH je također postao točka interesa u biologiji Toronta. U tom kontekstu, povećanje skupa NAD plus rezultiralo je djelomičnim poništavanjem starenja i drugih povezanih patoloških fenotipova u organizmima (Das i sur., 2018; Mendelsohn i Larrick, 2014; Wei i sur., 2017; Zhu i sur. , 2017), a utvrđeno je da stare i neoplastične stanice predstavljaju neravnotežu omjera NADH/NAD plus (Braidy et al., 2011; Schwartz i Passonneau, 1974; Wiley et al, 2016). Nadalje, novootkrivene uloge NADPH i novi koncept NADH/NADH kao glavnog regulatora redoks homeostaze i starenja u skladu su s teorijom metaboličke stabilnosti starenja (Demetrius, 2004.). Ova teorija predlaže da je uzrok starenja ranjivost stacionarnih razina redoks parova na nasumične okolišne poremećaje na stope enzimske reakcije i daje nekoliko zanimljivih predviđanja koja se odnose na ljude.

S obzirom na sve te implikacije, mnoga su istraživanja ispitivala fenomenologiju omjera redoks parova bilo pasivnim izvješćivanjem o njihovim razinama ili aktivnim mijenjanjem istih. Međutim, eksperimentalne manipulacije su izazovne. Najtradicionalniji optužuju duboka eksperimentalna upozorenja (Sun i sur., 2012.), a noviji još uvijek propuštaju određene biološke okolnosti jer su ograničeni na intervale temperature i pH (Hung i sur., 2011.; Zhao i sur., 2015.). Štoviše, eksperimentalno je skupo pratiti široku lepezu fenotipova nakon promjene skupova koenzima dodatkom metabolita (Hou et al., 2010.) i mutacijama ili prekomjernom ekspresijom enzima koji troše NAD(H) (Bait sur., 2011.; Felipe i sur., 1998). Stoga postoji potreba za alternativnim strategijama za rješavanje kontrole redoks homeostaze kroz manipulaciju redoks parova, kao i naše razumijevanje bioloških posljedica te kontrole.

In silico modeli postaju praktična istraživačka strategija kad god su eksperimentalni pristupi ograničeni, s prednošću omogućavanja potpunog mehaničkog prikaza promatranih pojava. Metabolički modeli na razini genoma, koji se mogu proučavati analizom ravnoteže toka (FBA) (Orth et al, 2010.) postali su standard u sistemskoj biologiji za proučavanje posljedica metaboličkih poremećaja na staničnu funkciju (metode S1). Među ostalim doprinosima, pomogli su u otkrivanju novih antibiotika i kemoterapeutika, dizajnu bakterijskih sojeva optimiziranih za industrijsku proizvodnju tvari od interesa i boljem razumijevanju ljudskih metaboličkih bolesti (Burgard et al., 2003; Pagliarini et al. 2016; Raman i sur., 2009). Korištenje FBA ima dodatnu prednost pružanja uvida u metaboličke fenomene bez utjecaja nemetaboličkih zbunjujućih čimbenika (genetski, epigenetski, mehanički itd.). Stoga su metabolički modeli na razini genoma posebno prikladni za ispitivanje metaboličkih posljedica odstupanja od redoks homeostaze.

Ovdje koristimo FBA za ispitivanje ravnoteže redoks parova na rekonstrukciji na razini genoma jednostaničnog eukariota Saccharomyces cerevisiae, pri čemu karakteriziramo metaboličke posljedice i posljedice povezane s dugovječnošću kontrolirane perturbacije dostupnog NADH/NAD plus fluksa kroz različite genetske pozadine. Točnije, naši rezultati otkrivaju da tolerancija na ovu neravnotežu dovodi do specifičnog metaboličkog preusmjeravanja koje podsjeća na patologiju i također objašnjava više od četvrtine intra-specifične varijabilnosti u postmitotičkom životnom vijeku. Osim toga, ovaj nam okvir pomaže da ocrtamo računalni protokol (koji također primjenjujemo na životinjske i ljudske metaboličke modele) za identificiranje metabolita i enzima s potencijalom kao terapeutske mete u kontekstu patologija povezanih sa starenjem.

REZULTATI

Profil tolerancije temeljen na fitnessu karakterizira poremećaje redoks parova

Da bismo predstavili neravnotežu između konjugiranih oblika redoks para, ugradili smo umjetnu reverzibilnu reakciju - "reakciju neravnoteže" - u rekonstrukciju odgovarajuće metaboličke mreže na razini genoma (STAR ​​metode). Reakcija oksidira ili reducira par uzimajući u obzir specifične stanične odjeljke (npr. citosol, mitohondrije itd.), a njezina se aktivnost može fiksirati na bilo koju željenu vrijednost brzine. Za bilo koju od ovih vrijednosti može se izračunati stopa rasta ("prilagođenost"). koja djeluje kao zamjena za toleranciju stanice kvasca na to određeno stanje. Konačno, profil tolerancije definiran je izračunavanjem stope rasta za raspon vrijednosti neravnoteže (Slika 1A; imajte na umu da su redukcijski/oksidacijski uvjeti predstavljeni plavom/crvenom bojom u cijelom rukopisu).

Profili tolerancije tipično pokazuju maksimalni rast oko nulte točke neravnoteže, s otprilike bilo kojim odstupanjem (tj. vrijednošću reakcije koja nije nula) što dovodi do smanjene prikladnosti. Ovo naglašava činjenicu da, kako bi metabolizam funkcionirao, aktivnost reakcija koje podešavaju omjer redoks para u jednom smislu mora biti proporcionalna aktivnosti onih koje ga podešavaju u drugom smislu. Točnije, citosolna neravnoteža NADH/NADt u S.cistanche produženje životacerevisiae koje rastu na glukozi i u aerobnim uvjetima daju profil s maksimalnim rastom značajno pomaknutim prema oksidativnoj strani na točki profila neravnoteže gdje se ~50 mmol/DW/sat NADH pretvara u NADH (Slika 1B). Kada smo umjesto toga razmatrali neravnotežu u mitohondrijima, uočili smo maksimum u točki nulte neravnoteže (Slika 1C), uzorak koji smo na sličan način uočili u drugim profilima (Slika S1). Općenito, reduktivni uvjeti postaju

Slika 1. Profil tolerancije karakterizira odgovor na redoks neravnoteže

(Na vrhu. U model metaboličke rekonstrukcije organizma (u ovom slučaju kvasca) uveli smo umjetnu reakciju za međupretvorbu dva konjugirana oblika redoks koenzima (ovdje para NADH/NADH). Pod svakim od niza uvjeta neravnoteže, tj. vrijednosti brzine umjetne reakcije, primjenjujemo analizu ravnoteže toka za izračunavanje stope rasta. Dno. Predviđene vrijednosti rasta ucrtane su u odnosu na vrijednosti stope neravnoteže koja ocrtava profil tolerancije; zamjena za toleranciju metabolizma kada je suočen s odabranim poremećajem.cistanche nz(B) Profil tolerancije kod kvasca povezan s neravnotežama u citosolu.

(C) Profil tolerancije u kvasca povezan s neravnotežama smještenim u mitohondrijima. Plavo/crveno sjenčanje predstavlja režime smanjene i oksidirane neravnoteže, a sive točke označavaju vrijednosti koje odgovaraju neravnoteži ili ekstremnoj reduktivnoj/oksidativnoj neravnoteži koja ne uzrokuje rast. štetni i smrtonosni brže od oksidativnih režima. U dva slučaja (konjugirani parovi citosolnog NADH ili mitohondrijskog tioredoksina), blaga umjetna oksidacija para poboljšava rast (Slika S1).

Poremećaji NADH/NAD* uzrokuju metaboličke sindrome koji podsjećaju na patologiju

Energetski metabolizam kvasca bez neravnoteže odgovara karakterističnom aerobnom metabolizmu u prisutnosti glukoze (proučavani uvjeti rasta) u kojem je glikoliza povezana s ciklusom trikarboksilne kiseline (TCA) i oksidativnom fosforilacijom. Put pentozo-fosfata oksidira glukozu i osigurava ribozu-5P za sintezu nukleotida i reduktivnu snagu koju stvara NADPH za anabolizam, dok se anaplerotični putevi napuštaju TCA ciklusa, slični onima metabolizma glutamina, umjereno se koriste za primarno napajanje pirimidina i sinteza aminokiselina. FBA nam omogućuje kvantificiranje promjena u tim putovima i kako oni eventualno detaljno prikazuju metaboličke značajke koje su u osnovi bilo kojeg režima neravnoteže.

Konkretno, slika 2A pokazuje kako je reduktivna neravnoteža citosolnog NADH/NADH dovela do povećanja glikolitičkog protoka, smanjenja aktivnosti TCA ciklusa i lanca prijenosa elektrona te porasta metabolizma glutamina. Ovaj pseudohipoksični metabolički potpis - u prisutnosti kisika - nalikuje anaerobnom metabolizmu, gdje je glikoliza povezana s alkoholnom ili mliječnom fermentacijom na štetu mitohondrijskih putova; kisikov dio pentozofosfatnog puta se zatvara i metabolizam glutamina, aktivniji, može se preusmjeriti na proizvodnju piruvata povrh doprinosa anabolizmu. Značajno je da ovaj fenotip obuhvaća neke značajke paradoksalnog metabolizma prinosa uočenog u različitim tipovima kancerogenih stanica (Warburgov učinak) (Potter et al., 2016.).

Slika 2. Tokovi glavnih putova upravljanja energijom na kojima se temelji profil tolerancije u kvasaca (A) Neravnoteža citosolnog NADH/NAD (gore) i vrijednosti toka pet reprezentativnih putova (dolje); i/glikoliza (Glycolysis, jezgra), ii/Krebsov ciklus (TCA, ružičasta), ili/pentoza fosfat (Penphos, zelena), iv/oksidativna fosforilacija (Oxphos, siva) i metabolizam glutamina (Glutamin, ljubičasta). Predstavljeni vektori toka su rezultat usrednjavanja toka svih reakcija pojedinog puta.

(B) Isto kao (A) s obzirom na neravnotežu mitohondrija. Imajte na umu da prisutnost negativnih tokova u glikolizi (ploča A, dno) predstavlja povećanu glukoneogenezu. Pogledajte glavni tekst za detalje.

Nasuprot tome, energetski metabolizam koji je u osnovi oksidativne tolerancije (s obzirom na citosol, slika 2A) pokazao je više sličnu aerobnoj konfiguraciji, ali sa osobitostima, kao što je posebno aktivan metabolizam poliamina; i ekstremna svojstva, uključujući povećanu glukoneogenezu, oksidativnu fosforilaciju i aktivnost TCA ciklusa, kao i vrlo visok (do 12-struko više od normalne razine) tok kroz put pentoza fosfata. Potonji ipak može biti artefakt razlika u pseudoreakciji biomase, pod vrlo visokom (prethodnih 55 mmol/gDW/h) oksidativnom neravnotežom (Vidi metode S1).

Kada se reakcija neravnoteže nalazi u mitohondrijima, redukcija NADH ponovno je proizvela određeno pseudohipoksično ponašanje, s jednom razlikom (Slika 2B). Povećao se protok kroz glikolizu i metabolizam glutamina, uz popratni gubitak dijelova TCA ciklusa i pentozofosfatnog puta. Međutim, za razliku od citosolnog slučaja, oksidativna fosforilacija se značajno povećala. S druge strane, oksidativna strana mitohondrijskog profila bila je idiosinkratičnija: glikolitička aktivnost je porasla paralelno s onom TCA ciklusa, ali oksidativna fosforilacija je većim dijelom radila na nižim razinama od normalne, a metabolizam glutamina bio je od male važnosti,

Metabolički sindromi rezultat su kompromisa između redoks ravnoteže, proizvodnje biomase i ATP/NADH kompromisa

Identificirali smo nekoliko ključnih elemenata koji su oblikovali prethodne sindrome.veličina penisa cistancheOksidativna perturbacija suočena je s pojačanim aerobnim odgovorom kao kompromisom između održavanja rasta i ublažavanja poremećaja neravnoteže. To je uključivalo preusmjeravanje toka kroz najveći mogući broj reakcija koje su smanjile NAD plus uz očuvanje globalne distribucije toka koja je bila sposobna generirati sastojke biomase. Ova dva mehanistička elementa (puferiranje poremećaja i maksimiziranje biomase) najrelevantniji su zahtjevi optimizacijskog problema i dovoljni za opisivanje oksidativnog režima profila tolerancije.

Slika 3. Konkurirajući mehanizmi uzrokuju pseudohipoksično ponašanje kvasca

(A) Ravnoteža između proizvodnje NADH, ATP i prekursora biomase daje prednost reakcijskim modulima koji proizvode što više ATP-a i što je moguće manje NADH kako bi se kompenzirale posljedice reduktivnih režima, npr. upotreba glikolize u odnosu na TCA. Imajte na umu da ljubičaste strelice predstavljaju proizvodnju ATP-a, žute strelice predstavljaju proizvodnju NAD(H), a bijeli kružići označavaju stvaranje prekursora biomase, (B) NADH-sklona perturbacija NADH/NADt (x-os) preklapa se s umjetnim ADP-om reakcija fosforilacije (y-os) koja snažno unosi reduktivnu snagu u obliku ATP-a u neuravnoteženi metabolizam. Gradijent zelene boje predstavlja omjer između glikolitičkog protoka i protoka Krebsovog ciklusa normaliziran njegovom normalnom vrijednošću (do 100- puta). Može se shvatiti da ADP fosforilacija smanjuje pseudohipoksični fenotip i odgađa mirovanje.

Reduktivna strana zahtijevala je, međutim, jedan dodatni uvid. Kako se sve više i više NADH izdvaja u NADH, reakcije koje koriste NADt i koje su izravno ili neizravno potrebne za proizvodnju sastojaka biomase postaju sve više ograničene, tako da se energetski metabolizam mora preusmjeriti kako bi se omogućila povećana pretvorba NADH u NAD' i ograničio smanjenje NAD' u NADH. To je još uvijek nedovoljno za suočavanje s poremećajem, budući da je većina redukcijske moći u obliku NADH u biti beskorisna za mnoge metaboličke ciljeve, reakcije i rast: energija pohranjena u NADH mora se preraspodijeliti u ADP. Dakle, metabolizam mora dati prioritet reakcijskim modulima koji proizvode što više ATP-a i što je moguće manje NADH; mora se oslanjati na shuntove i putove koji imaju visok prinos ATP/NADH, npr. glikoliza i oksidativna fosforilacija.

To, između ostalog, rezultira smanjenim TCA ciklusom i povećanim glikolitičkim protokom (Slika 3A). Kako bismo dodatno istražili utjecaj ovog ATP/NADH kompromisa, preklapali smo reduktivnu NADH/NAD perturbaciju s umjetnom reakcijom koja omogućuje fosforilaciju ADP-a . Simulacije su pokazale da povišeni omjer protoka glikolize i TCA ciklusa koji karakterizira reduktivni metabolizam ovisi o prinosu ATP/NADH

Slika 4. Rezultat tolerancije kao prediktor kronološkog životnog vijeka kvasca

(A) Profili tolerancije dobiveni za mutante kvasca; plavi/crveni sektori krivulje predstavljaju redukcijski/oksidacijski režim neravnoteže NADH/NADH.

(B) Povezanost između normaliziranog rezultata tolerancije (proporcionalno širini vrijednosti neravnoteže u oksidativnim i redukcijskim režimima, STAR metode) i kronološkog životnog vijeka. Korelacija objašnjava ~30 posto ukupne varijance (R'= 0. 29, p-vrijednost=3.2x 10-4, N= 41).

(C) Kao alternativni način promatranja ove povezanosti, dobili smo histogram vrijednosti regresijskog nagiba dobivenih iz deset tisuća nasumično generiranih povezanosti između rezultata tolerancije i životnog vijeka. Iz ovog uzorka nalazimo samo 3 slučaja u kojima je povezanost između rezultata tolerancije i podataka o životnom vijeku jača od one koja je pronađena (označena crvenom okomitom crtom).

(Slika 3B). Snažno fosforiliranje ADP-a smanjuje ovaj pseudohipoksični potpis čak i u slučaju vrlo jakih stopa neravnoteže sklone NADH-u.

Tolerancija objašnjava eksperimentalne kronološke razlike u životnom vijeku između različitih mutanata kvasca

Pitali smo do koje mjere bi profil tolerancije mogao djelovati kao prediktor životnog vijeka, s obzirom da se o redoks parovima raspravljalo kao o potencijalnim determinantama životnog vijeka. Jedan od načina da se ovo prouči je izračunati profil profila u različitim mutantima (Slika 4A) i zatim kvantificirati kako on odgovara točnim mjerama životnog vijeka, normaliziranim kronološkim životnim vijekovima (CLS), dostupnim iz eksperimentalno izmjerenih krivulja preživljavanja mutanata (Garay et al., 2014). CLS se izračunavaju iz ovih krivulja preživljavanja mutanata kao povećanje preživljenja u stacionarnoj fazi u odnosu na divlji tip.

U FBA, mutacije u specifičnim genima simuliraju se ograničavanjem protoka reakcija povezanih s njima Booleovim pravilima koja povezuju svaku kemijsku reakciju s ORF-ovima koji prevode za enzim reakcije (STAR ​​metode). Za svakog od ovih mutanata izračunali smo profil tolerancije mutanta (Slika 4A) i upotrijebili zbroj apsolutnih vrijednosti neravnoteže pri kojima je stopa rasta prepolovljena (i u redukcijskom i u oksidativnom režimu) kao skalarni rezultat tolerancije (STAR metode).

Naš skup mutanata bio je ipak ograničen nekim ograničenjima (STAR ​​metode). Značajno, nismo bili u stanju razlikovati razlike u toleranciji ispod 10 ppm vrijednosti divljeg tipa bez postizanja previsokih vremena izračuna, a mnogi su mutanti pokazali i zanemarive razlike u životnom vijeku i zanemarive razlike u toleranciji. Dodatno, općenito se smatra da FBA nije u stanju karakterizirati delecije povećanja funkcije i, sasvim predvidljivo, nijedna tolerancija na mutante nije premašila onu kod divljeg tipa.

Izvan ovih ograničenja, profili tolerancije in silico mogli su objasniti -30 posto eksperimentalno izmjerene varijabilnosti životnog vijeka (Slika 4B, R2= 0.29, N=41,p vrijednost{{5 }}.2x 10-) s velikim značajem:10,000 randomizacija parova podataka dovela je do samo 3 instance s većim nagibom regresije (Slika 4C).

Konvencionalne hranjive tvari omogućuju toleranciju na neravnotežu NADH/NADH

Na kraju, istražili smo jesu li specifični prehrambeni metaboliti bili osobito odlučujući u odgovoru na redoks neravnotežu. U tu svrhu koristili smo dodatnu značajku FBA modela, a to je mogućnost pristupa korištenju pojedinog metabolita (definiranog kao stopa potrošnje u steady-state, STAR metode). Ispitali smo način na koji se ta stopa mijenjala s povećanjem vrijednosti reduktivnog i oksidativnog NADH/NAD plus neravnoteže.

Upotreba je bila prilično linearna na obje strane profila i za većinu metabolita. Stoga smo ovaj promjenjivi obrazac prilagodili linearnom modelu i smatrali (apsolutni) nagib skalarnim predstavnikom relevantnosti odgovarajućeg metabolita za toleriranje redoks neravnoteže (Slika 5A). Među hranjivim tvarima iAZ900 s najboljim odzivom primijetili smo prehrambene metabolite za koje je poznato da igraju ključnu ulogu u regulaciji životnog vijeka kvasca, poput acetata (Burtner et al., 2009.), kao i mnoge koji eksperimentalno povećavaju životni vijek kvasca, crva, ili čak ljudske stanice (Madeo et al., 2018; Mishur et al., 2016) uključujući malat, hidroksibutirat, spermidin ili oksaloacetat (Slike 5B-5D, Tablica S1).

Određene hranjive tvari bile su relevantnije za toleranciju na smanjenje NAD, druge na oksidaciju NADH, a nekoliko na oba ova režima. Najvažniji prehrambeni metaboliti za reduktivnu toleranciju bili su redom acetat, beta-hidroksibutirat (BHB), glutamat i glutamin (Slika 5B), dok su najvažniji za toleriranje oksidacije NADH bili acetat, NADP plus, putrescin i spermidin (Slika 5D). Među onima koji su sudjelovali prema toleranciji na obje strane profila, najrelevantniji je bio redoslijed acetat, glutamat, oksaloacetat i oksoglutarat (Slika 5C).

Razmotrili smo metaboličke modele u drugim organizmima kako bismo dodatno potvrdili koje su hranjive tvari determinante u odgovoru na neravnoteže (metode S1, pogledajte i sliku S2 za promjenu tokova glavnih putova). Svi ovi glavni suradnici promijenili su se, iako ne u velikoj mjeri, s alfa-keto kiselinama, redoks parovima, određenim vitaminima i određenim aminokiselinama koje su značajno potrebne za kontrolu poremećaja NADH/NADt u C.elegansu i ljudskoj rekonstrukciji. Najčešća reakcija na redoks neravnotežu u tim organizmima odnosi se na metabolite koji posreduju u pH homeostazi, kao što su acetat, bikarbonat, bifosfat, natrij, voda i drugi slični. Slično tome, važnost glutamata, glutamina, aspartata, treonina, serina i glicina razlikuje ih od ostalih aminokiselina i većine metabolita. Oksidirane kiseline srednje veličine poput oksoglutarata, malata i oksaloacetata također dosljedno igraju ulogu u toleranciji, kao i biotin i neki folati (pogledajte tablicu S1 za potpuni popis).

RASPRAVA

Ovdje predlažemo alternativni pristup razumijevanju širokih bioloških posljedica promjena u redoks parovima. Ovaj se pristup temelji na in silico metaboličkim modelima i uvodi pojam tolerantnog profila kao mjere koja kvantificira staničnu otpornost na te promjene.

Slika 5. Homeostatske hranjive tvari u kvascu

(A) Primjer profila upotrebe hranjive tvari s odgovarajućim reduktivnim (plavo) i oksidativnim (crveno) linearnim regresijama koje karakteriziraju nagibi m, odnosno m. (u apsolutnim vrijednostima). Uključili smo profil citosolne tolerancije u pozadinu kao referencu.

(B) Nagibi linearne regresije (m,) 4 glavna homeostatska hranjiva u reduktivnom smislu NADH/NAD plus poremećaja.

(C) Nagibi linearne regresije prva4 hranjiva koja su homeostatska u oba smisla poremećaja; Plava: nagib reduktivne linearne regresije; Crveno: Nagib oksidativne linearne regresije.

(D) Nagibi linearne regresije (m.) 4 glavna homeostatska hranjiva u oksidativnom smislu NADH/NAD plus poremećaj.

Metaboličke prilagodbe u podlozi profila otkrivaju prisutnost pseudohipoksičnog fenotipa povezanog s reduktivnim režimima NADH. Ovaj fenotip podsjeća na neke naizgled paradoksalne metabolizme niskog prinosa energije opažene kod karcinoma (Warburgov efekt), a također je prepoznat u stanicama kvasca (Crabtreejev efekt) i bakterijama (prelivni metabolizam) (Basan et al., 2015; Mori et al., 2016; Potter i sur., 2016). Posljednjih godina istaknuta je mogućnost da bi ovo ponašanje moglo biti uzrokovano ograničenjima raspodjele resursa koja proizlaze iz relativno visokog rasta ili stopa unosa glukoze (Basan et al, 2015; Mori et al, 2016). Međutim, pseudohipoksični fenotip koji promatramo je neovisan o brzini rasta i unosu glukoze, i zapravo se pojavljuje zajedno s niskim stopama rasta (STAR ​​metode). Pokazali smo da njegov uzrok leži u temeljnom ATP/NADH kompromisu, obrazloženju koje podupire nedavna eksperimentalna studija (Maldo-nado i Lemasters, 2014.).

Nadalje, naša analiza toka sugerira da na održavanje ATP-a može negativno utjecati reduktivni NADH/NAD plus neravnoteža. Smatra se da je povećani NADH korelacija sa smanjenom dostupnošću ATP-a, budući da oštećenje oksidativne fosforilacije može rezultirati i povećanjem NADH/NAD plus i smanjenjem ATP/ADP-a. Pokazujemo da vanjsko generirane neravnoteže NADH mogu biti uzrok smanjene raspoloživosti energije putem ortogonalnih metaboličkih mehanizama, čak i dok oksidativna fosforilacija djeluje na normalnim razinama. Ovo je vrlo značajno u kontekstu istraživanja starenja, budući da su smanjena dostupnost energije i omjeri ATP/ADP očuvani znak staničnog starenja i patologija povezanih sa starenjem (Moreira i sur., 2003.; Pall, 1990.; Yaniv i sur., 2013. ) i može potaknuti nakupljanje toksičnog otpada i gubitak proteostaze (još jedan znak starenja) smanjenjem izmjene proteina i stoga produljenjem poluživota proteina (Anisimova et al., 2018).

Sljedeći nam je cilj utvrditi valjanost našeg okvira kao prediktora životnog vijeka i prehrambenih metabolita koji puferiraju redoks neravnoteže. Tolerancija predviđa životni vijek stanice, uz određena ograničenja zbog dostupnog skupa podataka. Uzimajući u obzir ta ograničenja (Garay et al., 2014.), nalazimo da su dobivene korelacije još uvijek dovoljan dokaz odnosa između varijanci tolerancije i CLS-a.

Suprotno našim očekivanjima, najjasnija lekcija izvučena iz naše analize prehrambenih metabolita jest da se glavna tvar koja pokreće odgovor na neravnotežu ne oslanja posebno na NADt mrežu spašavanja. Doista, vrhunske "homeostatske hranjive tvari" su međuproizvodi TCA ciklusa i drugih dijelova središnjeg metabolizma čije je djelovanje daleko snažnije od djelovanja NAD prekursora. Osim toga, relevantnost reakcija koje smanjuju ili oksidiraju NAD(H) dok djeluju kao mostovi između redoks para i glavnih metaboličkih putova daleko je superiornija od one enzima koji ograničavaju spašavanje NADt (kao što je nikotinamid mononukleotid adeniltransferaza).

Na primjer, rezultat oksaloacetata i oksoglutarata u modelu kvasca među prva četiri najučinkovitija metabolita na kojima se temelji tolerancija u redukcijskim i oksidativnim uvjetima, dosljedna značajka koja potvrđuje prethodne eksperimentalne rezultate (Chin i sur., 2014.; Williams i sur., 2009.) . Drugi značajni metaboliti uključuju hidroksibutirat za koji se dosljedno pokazalo da produljuje životni vijek, regulira NAD i posreduje u odgovoru na gladovanje (Edwards i sur., 2014.; Newman i Verdin, 2014.) i spermidin, koji pripada obitelji poliamina i za kojeg je poznato da igraju ulogu u procesima povezanima sa starenjem, autofagiji i zaštiti DNK (Eisenberg i sur., 2009; Minois i sur. 2011: Pietrocola i sur. 2015).

Koristili smo C.elegans i ljudske modele kako bismo ojačali prethodnu procjenu, otkrivajući širu sliku koja je usredotočena na pH homeostazu, redoks parove i TCA ciklus. To sugerira da su načini na koje pH (Burtner i sur., 2009.) i neravnoteža NADH (Ayer i sur., 2014.) određuju starenje stanica duboko isprepleteni. Osim pH, najprodorniji i najvažniji hranjivi sastojci za regulaciju NADH/NAD plus neravnoteže su alfa-keto kiseline oksaloacetat i oksoglutarat, njihovi aminirani oblici i drugi metaboliti povezani s mitohondrijima poput malata, piruvata i fumarata, tj. glavno središte kontrola redoks ravnoteže je TCA ciklus.

Do danas, mehanizmi kroz koje aminokiseline i intermedijeri TCA ciklusa utječu na produljenje života kvasca i C. elegans ostaju nejasni. Metaboliti poput malata, oksaloacetata, fumarata, valina, serina ili treonina doista mogu produljiti životni vijek organizama, ali procesi koji dovode do tih učinaka su složeni i raspravljaju se (Edwards et al., 2013, 2015). Naši rezultati pokazuju da zajedničko objašnjenje za sve ove fenomene pro-dugovječnosti leži u učinku hranjivih tvari na sposobnost stanica da toleriraju poremećaje u omjeru NADH/NAD plus.

Moglo bi se, međutim, tvrditi da se neki od razmatranih metabolita čine očiglednima jer su ipak uključeni u reakcije koje međusobno pretvaraju NADH i NAD plus. Pitanje je zašto se onda drugi metaboliti koji također izgledaju a priori samorazumljivi ne pojavljuju u našim rezultatima. Odgovor leži u mehanizmima koji osiguravaju realna predviđanja u FBA. Da bi hranjiva tvar bila "homeostatska" u odnosu na redoks neravnotežu, ona ne samo da mora povećati proizvodnju NADH ili NADt, već mora stajati u središnjem putu ili modulu s visokim prinosom ATP/NADH i/ili kapacitetom da osigura sastojke biomase.

Konačno, vrijedna su pažnje još dva uvida iz naših rezultata. S jedne strane, sugeriraju da su kao odgovor na redoks neravnoteže metaboličke mreže spremne sve više proizvoditi i/ili konzumirati neke metabolite koje signalne mreže tumače kao onemogućavajuće potrebu za autofagijom, antioksidativnim i hormetičkim odgovorima, kao i mnoge koji suvišni ili je utvrđeno da suplementacija produljuje životni vijek i/ili na drugi način oponaša učinke ograničenja kalorija (CR), na način koji ovisi o signalnim putovima koji su uključeni u produljenje životnog vijeka posredovano CR-om. Ovo pojačava prethodne dokaze koji povezuju ravnotežu CR i NADH/NADH kao dio istog procesa produljenja životnog vijeka i promicanja zdravlja (Lin et al., 2004.).

S druge strane, naše istraživanje pokazuje da kao odgovor na promijenjene omjere metabolizam također sve više koristi određene tvari koje mogu kemijski oštetiti stanicu, poput acetata, putrescina ili acetaldehida; kao i neki koji mogu potaknuti nastanak tumora putem metaboličkih prespajanja, poput glutamina, sukcinata i fumarata (Sciacovell et al., 2016.). To bi onda moglo djelomično objasniti patologije povezane s redoks neravnotežom i makroskopskim procesima u koje je uključena, kao što su degenerativne i onkološke bolesti: ako se redoks neravnoteža mora ublažiti toksičnim tvarima, onda su te tvari vjerojatno mehanizmi patologija koje ko -javljaju se kod redoks neravnoteže.

Shvaćamo da se naš pristup redoks neravnoteži može shvatiti kao neobična varijacija proučavanja robusnosti metaboličke mreže i da može optuživati ​​određena upozorenja koja ostavljaju puno prostora za poboljšanje. Što se tiče robusnosti, studije koje koriste FBA tradicionalno su je definirale kao promjenu objektivnog rješenja (obično rast) kao odgovor na različita smanjenja u brzinama reakcije, npr. (Edwards i Palsson, 2000.), a ne na određenu perturbaciju (redoks neravnoteža ) u metabolitima kao i mi. S obzirom na ograničenja naše analize, ona se mogu povezati s intrinzičnim ograničenjima samog FBA, poput odsutnosti regulatornih gena. U konačnici, pouzdanost naših rezultata ovisi o prediktivnoj snazi ​​metaboličkih rekonstrukcija: trenutni modeli kvasca su prediktivni i napredni, ali nisu savršeni (Heavner i Price, 2015), a ipak su daleko bolji čak i od većine dostupne točne višestanične rekonstrukcije. Unatoč svim tim zabrinutostima, postoji mnogo dokaza koji jamče sve veću vjernost metaboličkih modela prirodnom ponašanju.

Trenutačno prevladavajuća istraživanja ignoriraju potencijalne negativne posljedice neselektivnog smanjenja omjera NADH/NADH. To je djelomično zbog obećavajućih koristi koje proizlaze iz blagih smanjenja postignutih eksperimentalno, što uključuje smanjenje neoplastičnih fenotipova, životnog vijeka i produženje zdravstvenog vijeka. Međutim, pojavljuju se dokazi koji preporučuju izniman oprez u pogledu ovih pozitivnih rezultata (Gujarat sur., 2016.; Hong i sur., 2019.), kao i čvrst, eksperimentalno podržan teorijski okvir koji predviđa negativne posljedice smanjenja omjera NADH/NADH preko prag (Aon et al., 2010). Naši profili tolerancije neravnoteže NADH/NADt odgovaraju ovoj novoj slici, budući da blaga oksidativna odstupanja mogu biti korisna, ali veća su jednako štetna kao i suprotni ekstremi.

Točnije, naši profili tolerancije sugeriraju da osim što uzrokuju kemijske ili fiziološke probleme, i niski i visoki omjeri NADH/NADH također moraju biti suočeni s čisto metaboličkim nedostacima, uključujući smanjenu dostupnost energije i/ili biosintetski učinak. Nadalje, kao što smo istaknuli, ograničena eksperimentalna opažanja koja su dostupna o nekim pitanjima kojima se bavimo podsjećaju na rezultate koje ovdje izvješćujemo.

Ograničenja studije

Ovdje prikazani rezultati bi se poboljšali kada bi se korišteni modeli dodatno poboljšali. Naš rad također pati od intrinzičnih ograničenja FBA kao tehnike. Na primjer, nedostupne su dinamičke informacije, s obzirom na to da su trenutačno dostupne verzije analize dinamičkog toka previše smanjenog opsega. Slično, nedostatak implicitnih energetskih ograničenja u ravnoteži fluksa umanjuje njegovu predvidljivost za visoke stope rasta. Ova slabost je motivirala dodavanje tehnika kao što je CAFBA, kao što smo razmatrali u rukopisu. Na kraju, bilo bi zanimljivo pristupiti regulatornim informacijama, koje se mogu jednostavno kontrolirati i uključiti ili isključiti. Trenutačno ne postoje standardizirani pristupi provedbi regulacije gena u FBA. Primjena rezultata reakcijske aktivnosti na granice ograničenja obećava u tom pogledu.

Ovaj je članak izvađen iz iScience 24, 102697, 23. srpnja 2021.