Trombomodulin poboljšava kroničnu bubrežnu bolest posredovanu transformirajućim čimbenikom rasta b1 preko G-protein spregnutog receptora 15/Akt signalnog puta
Mar 11, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Atsuro Takeshita1,2,8, Taro Yasuma1,2,8, Kota Nishihama1, Corina N. D'Alessandro-Gabazza2, Masaaki Toda2, Toshiaki Totoki4, Yuko Okano1,2, Akihiro Uchida1, Ryo Inoue6, Liqiang Qin7, Shujie Wang5, Valeria Fridman D'Alessandro2, Tetsu Kobayashi3, Yoshiyuki Takei4, Akira Mizoguchi5, Yutaka Yano1,9 i Esteban C. Gabazza2,9
1 Odjel za dijabetes, metabolizam i endokrinologiju, Medicinski fakultet Sveučilišta Mie, Tsu-city, Mie, Japan; 2 Odjel za imunologiju, Medicinski fakultet Sveučilišta Mie, Tsu-city, Mie, Japan; 3 Odjel za plućnu i intenzivnu medicinu, Medicinski fakultet Sveučilišta Mie, Tsu-city, Mie, Japan; 4 Odjel za gastroenterologiju i hepatologiju, Medicinski fakultet Sveučilišta Mie, Tsu-city, Mie, Japan; 5 Odjel za neuralnu regeneraciju i staničnu komunikaciju, Medicinski fakultet Sveučilišta Mie, Tsu-city, Mie, Japan; 6 Central Institute for Experimental Animals, Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanawaga, Japan; i 7 Odjel za nefrologiju, bolnica Taizhou, Medicinsko sveučilište Wenzhou, Lihai, provincija Zhejiang, Narodna Republika Kina.
Kidney International (2020.) 98, 1179–1192; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.041
Autorsko pravo ª 2020, Međunarodno nefrološko društvo. Izdavač Elsevier Inc. Ovo je članak s otvorenim pristupom pod licencom CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
Korespondencija: Esteban C. Gabazza, Odjel za imunologiju, Medicinski fakultet Sveučilišta Mie, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japan. E-pošta: gabazza@doc.medic.mie-u.ac.jp; ili Yutaka Yano, Dijabetes, metabolizam i endokrinologija, Medicinski fakultet Sveučilišta Mie, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japan. E-pošta: yanoyuta@clin.medic.mie-u.ac.jp 8 AT i TY podjednako su pridonijeli ovom radu. 9 YY i ECG su stariji autori. Primljeno 1. rujna 2019.; revidirano 24. travnja 2020.; prihvaćen 7. svibnja 2020
KLJUČNE RIJEČI: apoptoza; kronična bolest bubrega; G-protein spregnuti receptor; rekombinantni ljudski trombomodulin; transformirajući faktor rasta-b1
Fibroza bubrega česta je posljedica kroničnih bubrežnih bolesti koja neumoljivo napreduje do završnog stadija bubrežne bolesti sa zatajenjem organa koje se može liječiti samo nadomjesnom terapijom. Budući da je transformirajući faktor rasta-b1 glavni igrač u patogenezi bubrežne fifibroze, postavili smo hipotezu da rekombinantni trombomodulin može poboljšati progresivnu fifibrozu i zatajenje bubrega posredovanu transformirajućim faktorom rasta-b1. Kako bismo ispitali našu hipotezu, generirali smo novi transgenični miš s transformirajućim faktorom rasta B1 specifičan za glomerule kako bismo procijenili terapeutski učinak rekombinantnog trombomodulina. Ovaj transgeni miš razvio je progresivnu glomerularnu sklerozu i tubulointersticijalnu fifibrozu sa zatajenjem bubrega. Terapija rekombinantnim trombomodulinom tijekom četiri tjedna značajno je inhibirala fifibrozu bubrega i poboljšala funkciju organa u usporedbi s neliječenim transgenim miševima. Liječenje rekombinantnim trombomodulinom značajno je inhibiralo apoptozu i mezenhimalnu diferencijaciju podocita interakcijom s G-protein spregnutim receptorom 15 za aktivaciju Akt signalnog puta i za regulaciju ekspresije anti-apoptotskih proteina uključujući survivin. Stoga naše istraživanje snažno ukazuje na potencijalnu terapijsku učinkovitost rekombinantnog trombomodulina za liječenjekronična bolest bubregai naknadno otkazivanje organa.
cistanchelimenkaliječiti bolest bubregapoboljšati funkciju bubrega
Prijevodna izjava
Fibroza i disfunkcijabubregatrenutno su veliki zdravstveni problemi u cijelom svijetu. Trenutačno ne postoji antifibrotski lijek odobren za liječenje bubrežne fifibroze. Transformirajući čimbenik rasta-b1 glavni je i uobičajeni pokretač bubrežne fibrogeneze kod kronične bolesti bubrega uzrokovane mnogim poremećajima. Ovdje smo otkrili da rekombinantni trombomodulin, lijek odobren u Japanu za liječenje diseminirane intravaskularne koagulacije, suzbija napredovanje glomerularne skleroze, tubulointersticijske fifibroze i zatajenja bubrega uzrokovanih prekomjernom ekspresijom ljudskog transformirajućeg faktora rasta-b1, što ukazuje na njegovu potencijalnu terapijsku vrijednost za liječenje odkronične bolesti bubrega.
Kronična bubrežna bolestje veliki javnozdravstveni problem povezan s visokim pobolom i mortalitetom koji pogađa oko 13 posto odrasle populacije u razvijenim zemljama.1 Svjetska zdravstvena organizacija izvijestila je dakronična bolest bubrega(CKD) bio je uzrok 1,5 posto smrtnih slučajeva diljem svijeta u 2012.1 Nadalje, nedavni epidemiološki podaci ukazuju na globalni stabilan porast broja bolesnika s KBB-om.2,3 U većini slučajeva, patološki proces progresivno evoluira, dovodeći u konačnici do kraja stadiju zatajenja bubrega, koji se može liječiti isključivo doživotnom dijalizom ili transplantacijom bubrega.4,5 Dijabetes melitus (DM) i arterijska hipertenzija najčešći su uzroci CKD, a slijede ih ishemija, glomeruloskleroza nepoznate etiologije, urološke opstrukcije i kronične infekcije.6 Bez obzira na poremećaj u podlozi, konačna i uobičajena patološka posljedica CKD je fifibroza bubrega.7 Bubrežna fifibroza je nenormalno cijeljenje i remodeliranje parenhimskih struktura bubrega podvrgnutih dugotrajnoj ili ponavljanoj ozljedi koju karakterizira prisutnost tubulointersticijske fifibroze, glomeruloskleroze i tubularne atrofije.8 Glavni pokretač bubrežne fifibrogeneze je transformacija rasta ili (TGF)-b1.8,9 TGFb1 može potaknuti fifibrozu stimuliranjem izlučivanja proteina izvanstaničnog matriksa i kemotaktičkih čimbenika ili proliferacijskih čimbenika fibroblasta, inhibicijom metaloproteinaza i promicanjem epitelno-mezenhimalne tranzicije.10 Osim liječenja osnovne bolesti , odobreni lijek koji specifično cilja bubrežnu fifibrozu trenutno nije dostupan.6
Trombomodulin (TM) je transmembranski glikoprotein s višestrukim biološkim funkcijama uključujući modulaciju sustava zgrušavanja, imunološki odgovor, upalne reakcije i preživljavanje stanica.11 Molekularna struktura TM sadrži domenu sličnu lektinu, 6 domena sličnih epidermalnom faktoru rasta , domenu bogatu serinom/treoninom, transmembranski dio i citoplazmatski rep.12 Trombin, prokoagulacijski čimbenik koji nastaje tijekom aktivacije koagulacijskog sustava, postaje antikoagulacijski i antifibrinolitički čimbenik nakon vezanja na TM.13 Kompleks TM-trombina povećava stvaranje aktiviranog proteina C (APC), antikoagulansa s protuupalnim i citoprotektivnim djelovanjem, aktivacijom proteina C. Osim toga, sam TM može izravno smanjiti upalni odgovor inhibicijom aktivnosti proteina B skupine visoke pokretljivosti-1 (HMGB1), potiskivanjem imunogenih dendritičnih stanica, eozinofila, mastocita i sustava komplementa.13-18
Postoje objavljeni rezultati koji pokazuju preventivne učinke TM-a kod dijabetičke renopatije i ishemijsko-reperfuzijske ozljede bubrega.19-21 Međutim, niti jedno istraživanje nije procijenilo učinak rekombinantnog TM-a na progresivnu fibrozu bubrega izazvanu TGFb1, uobičajenim pokretačem bubrežne fifibroze u nekoliko bolesti koje uzrokuju CKD. Postavili smo hipotezu da TM može poboljšati fifibrozu bubrega posredovanu TGFb1-i zatajenje bubrega. Kako bismo ispitali ovu hipotezu, procijenili smo terapeutski učinak rekombinantne TM u novorazvijenom glomerulus-specifičnom TGFb1 transgeničnom (TG) mišu koji razvija progresivnofifibroza bubrega i zatajenje bubrega.
cistanche za bubreg
REZULTATI
Povećani cirkulirajući TM fragmenti koreliraju s bubrežnom disfunkcijom
TM, glikoprotein vezan za membranu endotelnih stanica, cijepa se u fragmente, gubeći svoje zaštitne funkcije tijekom ozljede endotela.22 Dijabetička nefropatija povezana je s ozljedom endotela.23,24 Bolesnici s DM s nefropatijom, u usporedbi s bolesnicima bez nefropatije, pokazali su značajno visoke cirkulirajuće razine TM (4,4 naspram 3,3 pg/ml) i aktivnog TGFb1 (0.28 naspram 0.24 ng/ml) (dodatna tablica S1, dopunska slika S1A). TM je u značajnoj korelaciji s kreatininom, aktivnim TGFb1 i topivim podocinom (dodatna slika S1B). Ova opažanja sugeriraju da je gubitak funkcionalnog membranski vezanog TM povezan s povećanim otpuštanjem aktivnog TGFb1 i disfunkcijom bubrega.
TG miš s glomerulus-specifičnom ekspresijom ljudskog TGFb1 gena pune duljine
Razvili smo TG miša koji prekomjerno izražava ljudski gen TGFb1 pune duljine u podocitima. Miš je stvoren stavljanjem ljudskog TGFb1 pod kontrolu promotora podocina na konstruktu bakterijskog umjetnog kromosoma (BAC) (dodatna slika S2; dopunska slika S3). Dobili smo 5 miševa začetnika koji su eksprimirali 3 kopije i 3 miša osnivača koji su eksprimirali 1 kopiju ljudskog TGFb1 transgena. Ekspresija transgena bila je specifična za bubrege, a potomci osnivača bili su sposobni za život (dodatna slika S3). Miševi su imali pune trudnoće i leglo je bilo normalne veličine. Miševi su rođeni u očekivanom Mendelovom omjeru.
Da bismo okarakterizirali TG miševe, izmjerili smo nekolikobubrežni parametrisvaka 4 tjedna u razdoblju od 16 tjedana (dodatna slika S4). Koncentracije TGFb1 u plazmi i urinu bile su značajno povećane u TGFb1- TG miševa u usporedbi s miševima divljeg tipa (WT) od prvih tjedana nakon rođenja, a zatim su ostale stabilne na visokoj razini (Slika 1a). TGFb1-TG miševi pokazali su značajno povećanje sadržaja hidroksiprolina u bubrežnom tkivu u 20. tjednu (190.5 naspram 96.0 mg/bubregu ), mezangijalnoj ekspanziji od 4. tjedna (1,9 naspram 1,1 rezultata) i u taloženju kolagena od 12. tjedna (0,9 posto naspram 0,1 posto) nakon rođenja u usporedbi s njihovim WT kolegama (Slika 1a–f ). Konvencionalna optička mikroskopija pokazala je proširenje bazalne membrane Bowmanove kapsule, zadebljanje bazalne membrane glomerula, povećano taloženje kolagena u mezangijskom i intersticijskom prostoru te tubularnu atrofiju (Slika 1bd). Transmisijska elektronska mikroskopija pokazala je glomerulosklerozu uključujući mikroviloznu transformaciju i brisanje podocita na stopalu, smanjenu fenestraciju endotela glomerularnih kapilara, zadebljanje bazalne membrane glomerula i povećano taloženje mezangijalnog matriksa (Slika 2a–i). Koncentracije ranih markera nefropatije u urinu, proteina koji veže masnu kiselinu (185,1 naspram 87,0 pg/ml) iozljeda bubregamolekule 1 (441,9 u odnosu na 256,9 pg/ml) značajno su povećani u TGFb1-TG miševa od 4. odnosno 8. tjedna starosti, u usporedbi s njihovim WT miševima iste dobi (dodatna slika S5). Ukupna proteinurija i ukupni omjer proteina i kreatinina u urinu bili su značajno povećani u 4., 8., 12., 16. i 20. tjednu kod TGFb1-TG miševa u usporedbi s njihovim WT parnjacima (Slika 3a) . Razina ureje u krvi bila je značajno povišena od 4. tjedna (5,1 naspram 4,1 mg/dl), a koncentracija kreatinina od 8. tjedna (1,1 naspram 0,4 mg/dl) u TGFb1-TG miševa u usporedbi s njihovim WT pandanima (Slika 3b).
rhTM inhibira glomerulosklerozu i tubulointersticijsku fifibrozu
U usporedbi s TGFb{{0}}TG miševima liječenim fiziološkom otopinom (SAL) i WT miševima liječenim rekombinantnim humanim (RH) TM ili SAL-om, TGFb1-TG miševi liječeni ritmom pokazali su značajno smanjen mezangijski ekspanzija/staničnost (1,3 u odnosu na 3{{30}} rezultat) i značajno nisko odlaganje tubulointersticijalnog kolagena i glomeruloskleroza (121,3 posto u odnosu na 139,7 posto) (Slika 4a–e). U skladu s ovim opažanjima, sadržaj hidroksiprolina (11,7 naspram 19,9 mg/g), koncentracije kolagena I u tkivu bubrega (101,3 naspram 196,7 ng/mg proteina) i periostina (21,7 naspram 40,8 ng/g mg proteina), a relativna ekspresija mRNA kolagena I bila je značajno smanjena u bubrežnim tkivima TGFb1-TG miševa tretiranih rhTM u usporedbi s bubrežnim tkivima kontrolnih miševa (Slika 4f, Dodatne tablice S2 i S3). Transmisijska elektronska mikroskopija pokazala je značajno smanjenje brisanja podocita i zadebljanja glomerularne bazalne membrane u miševa liječenih rhTM u usporedbi s miševima liječenim samo SAL-om (dodatna slika S6AB i B). Osim toga, koncentracije profibrotskih citokina, proteina kemoatraktanta monocita-1 (45,0 u odnosu na 76,1 pg/mg proteina), interleukina-13 (612,1 u odnosu na 1002,0 pg/mg proteina) i aktivnog TGFb1 u tkivu bubrega (131,0 naspram 151,5 pg/mg proteina) bili su značajno smanjeni u TGFb1-TG miševa tretiranih s rhTM u usporedbi s kontrolnim miševima (dodatna slika S7). Koncentracija HMGB1 u bubrežnom tkivu također je bila značajno smanjena u bubrežnom tkivu TGFb1-TG miševa tretiranih s rhTM u usporedbi sbubrežna tkivaiz kontrolnih miševa (dodatna slika S7). Koncentracija trombinskog antitrombinskog kompleksa u plazmi bila je značajno povećana u skupini koja je primala TGFb1-TG/SAL u usporedbi sa skupinom koja je primala WT/SAL, ali nije pronađena razlika između skupina koje su primale TGFb1-TG/rhTM i WT/rhTM (Dodatna slika S8A). Kao što se očekivalo, postojala je visoka koncentracija TM u plazmi TGFb1-TG i WT miševa tretiranih s rhTM. Koncentracija kompleksa APC/antitripsin u plazmi bila je značajno smanjena u skupini koja je primala TGFb1-TG/SAL u usporedbi sa skupinama koje su primale WT/SAL i TGFb1-TG/rhTM (280,5 naspram 384,6 pg/ml) , i nije bilo značajne razlike u razini inhibitora aktivatora plazminogena-1 (dodatna slika S8A). Razine C5a u plazmi, urinu itkivo bubrega(630.1 naspram 1075.0 pg/mg proteina) i podocin topljivi u plazmi bili su značajno smanjeni u TGFb1-TG miševa tretiranih rhTM u usporedbi s TGFb1-TG miševima tretiranim SAL-om (Dodatna slika S8B). Razina podocina u urinu bila je viša u skupini s TGFb1-TG/SAL nego u skupinama s WT/SAL i TGFb1-TG/rhTM (dodatna slika S9A–C).
Slika 1|Ljudski transformirajući faktor rasta b1 (TGFb1) transgeni (TG) miš razvija progresivnu fifibrozu bubrega. (a) Koncentracije TGFb1 proteina u plazmi i urinu mjerene su enzimskim imunološkim testom, a sadržaj hidroksiprolina u tkivu kolorimetrijskim testom. (b–d) Sekcije bubrežnog tkiva obojene su (b) periodnom kiselinom–Schiff (stupci ¼ 20 mm) i (c,d) Massonovim trikromom (stupci ¼ 10{{ 40}} mm), a zatim (e,f) kvantificirano korištenjem sustava bodovanja ili WinROOF softvera za snimanje (Mitani Corporation, Tokio, Japan). Broj miševa za procjenu bubrežnog tkiva: za miševe divljeg tipa (WT), n=4 u 4, 12 i 20 tjednu; za TG miševe, n=7 u dobi od 4 tjedna, n=8 u dobi od 16 tjedana i n=9 u dobi od 20 tjedana. Broj miševa za procjenu plazme i urina: za WT miševe, n=12 nakon 4 tjedna, n=8 nakon 8 tjedana, n=7 nakon 12 tjedana i n=4 nakon 16 i 20 tjedana; za TG miševe, n=24 u 4. tjednu, n=17 u 8. i 12. tjednu, i n=9 u 16. i 20. tjednu. Podaci su izraženi kao srednji interkvartilni raspon. Statistička analiza Mann-Whitney U testom. *P <0,05, **p=""><0,01, ****p=""><0,0001. ns,="" nije="" značajno.="" kako="" biste="" optimizirali="" gledanje="" ove="" slike,="" pogledajte="" internetsku="" verziju="" ovog="" članka="" na="">
Slika 2|Transmisijski elektronski mikroskopski nalazi u modelu bubrežne fifibroze izazvane transformirajućim faktorom rasta b1. Fiksacija, rukovanje i uklanjanje bubrega iz miševa izvedeno je kako je opisano u Metodama. (a,b) Mikrovilozna transformacija i (a,b,d,e,g) brisanje nožnog procesa (bijele strelice) podocita, (c–e) smanjena fenestracija endotela glomerularnih kapilara (žute strelice), (f) zadebljanje prisutna je glomerularna bazalna membrana (zvjezdice) i (h,i) povećano taloženje mezangijalnog matriksa (bijele strelice). CL, kapilarni lumen. Kako biste optimizirali gledanje ove slike, pogledajte internetsku verziju ovog članka na www.kidney-international.org.
rhTM poboljšava funkciju bubrega
Razine proteina koji veže L-masnu kiselinu (197.0 u odnosu na 313,4 pg/ml),ozljeda bubrega molekula1 (299,9 naspram 596,2 pg/ml), dušik ureje u krvi (12,9 naspram 34,8 mg/dl), kreatinin (0.5 naspram 1,4 mg/dl) i omjer albumin-kreatinin bili su značajno smanjeni u TGFb1-TG miševi s bubrežnom fifibrozom liječeni rhTM u usporedbi s njihovim neliječenim TG miševima (Slika 5). Ukupni protein u mokraći i omjer ukupnog proteina kreatinina također su bili smanjeni kod TGFb1-TG miševa tretiranih rhTM u usporedbi s njihovim netretiranim miševima (Slika 5).
rhTM smanjuje apoptozu glomerularnih stanica
Terminalno deoksinukleotidil transferazom posredovano dUTP nick end-labeling bojenje pokazalo je značajno smanjen broj apoptotskih stanica u glomerulima TGFb1-TG miševa tretiranih s rhTM u usporedbi s glomerulima TGFb1- TG miševa tretiranih SAL-om (Dopunski Slika S10A i B). Cijepanje kaspaze-3 također je značajno smanjeno u tkivima bubrega TGFb1-TG miševa tretiranih rhTM u usporedbi s tkivima bubrega TGFb1-TG miševa tretiranih SAL-om (dodatna slika S10C). Thetkiva bubregaiz TGFb1-TG miševa liječenih s rhTM, u usporedbi s onima iz TGFb1-TG liječenih sa SAL-om, pokazalo je značajno povećanje razine mRNA B-staničnog limfoma 2 (Bcl-2), B -stanični limfom-ekstra veliki (Bcl-XL), bakulovirusni inhibitor apoptoze koji sadrži ponavljanje 5 (BIRC5, također poznat kao survivin), i BIRC6 (Apollon) s povećanim omjerom Bcl-2–Bax (dopunska slika S11 ).
Slika 3|Ljudski transformirajući faktor rasta b1 (TGFb1) transgeni (TG) miš ima bubrežnu disfunkciju. (a) Ukupni protein i (b) urea dušik u krvi (BUN) mjereni su kolorimetrijskim metodama, a kreatinin enzimskom metodom. Broj miševa za procjenu plazme i urina: za miševe divljeg tipa (WT), n=12 nakon 4 tjedna, n=7 nakon 8 i 12 tjedana i n=4 nakon 16 i 2{ {21}} tjedana; za TG miševe, n =24 u 4. tjednu, n=17 u 8. i 12. tjednu i n=9 u 16. i 20 tjedna. Podaci su izraženi kao medijan ± interkvartilni raspon. Statistička analiza Mann-Whitney U testom. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ****="" p=""><>
rhTM inhibira apoptozu podocita
Prethodno tretiranje podocita s rhTM značajno je smanjilo apoptozu podocita uzgojenih u prisutnosti TGFb1 prema broju stanica u subG1 fazi (3,2 posto naspram 5,2 posto), terminalne deoksinukleotidil transferaze posredovane dUTP nick end-labeling–pozitivne stanice ( 1.0 naspram 5,4 stanica/Fifield) i stupanj cijepanja kaspazom-3 (omjeri 0.9 naspram 1.1) (Slika 6a–e). Probir antiapoptotskih čimbenika u uzgojenim podocitima pokazao je da rhTM značajno povećava ekspresiju mRNA antiapoptotskog faktora Bcl-2 u usporedbi s ekspresijom u netretiranim stanicama (dodatna slika S12). Ekspresija mRNA antiapoptotskog faktora BIRC5 također se povećala u stanicama tretiranim rhTM u usporedbi s ekspresijom u netretiranim stanicama (dodatna slika S12). Ekspresija mRNA proapoptotskog faktora Bax značajno je smanjena rhTM tretmanom u usporedbi s odsustvom tretmana (dodatna slika S12). Tretman s rhTM također je značajno inhibirao ekspresiju aneksina V i dUTP nick krajnjeg označavanja posredovanog terminalnom deoksinukleotidil transferazom u podocitima kultiviranim u prisutnosti vodikovog peroksida (dodatna slika S13A–E) i pod uvjetima visoke glukoze (dodatna slika S14A–E ) dodatno potvrđujući antiapoptotičko svojstvo rhTM na podocite. Istraživanje puta antiapoptotičke protein kinaze B (Akt)25 pokazalo je da rhTM pojačava fosforilaciju Akt u ljudskim primarnim podocitima uzgojenim u prisutnosti vodikovog peroksida ili TGFb1 (dodatna slika S15A i B). Zatim smo izolirali podocite iz svake skupine miševa i procijenili Akt fosforilaciju Western blotom. Došlo je do značajno pojačane fosforilacije Akt u podocitima izoliranim iz skupine TGFb{{30}}TG/rhTM u usporedbi s podocitima iz netretirane skupine (omjeri 1,1 naspram 0,7) (dodatna slika S16A i B).
GPR15 posredovanje
Prethodne studije su izvijestile da TM aktivira unutarstanične puteve interakcijom s receptorom faktora rasta fibroblasta 1 (FGFR1) iG-protein spregnuti receptor15 (GPR15).26,27 Podociti izražavaju FGFR128, ali nije jasno izražavaju li GPR15. Ovdje smo izolirali podocite iz svake skupine miševa i pokazali da podociti također izražavaju GPR15 (dodatna slika S17A–E). Otkrili smo da podociti iz zdrave kontrole i pacijenta s glomerulosklerozom također izražavaju GPR15 (dodatna slika S18). Kako bismo razjasnili posreduje li FGFR1 ili GPR15 inhibitornoj aktivnosti rhTM na apoptozu podocita, procijenili smo antiapoptotsku aktivnost rhTM u podocitima tretiranim s TGFb1-u prisutnosti inhibitora FGFR1 ili nakon transfekcije stanica s malom interferirajućom RNA (siRNA) protiv FGFR1 ili GPR15. Prethodni tretman podocita inhibitorom FGFR1 (dodatna slika S19A i B) ili FGFR1 siRNA (13,2 posto naspram 7,9 posto) (slika 7a i b) nije uspio ukinuti inhibitornu aktivnost rhTM na apoptozu podocita. Međutim, transfekcija stanica s GPR15 siRNA u potpunosti je ukinula inhibitornu aktivnost rhTM (14,6 posto u odnosu na 13,8 posto) naapoptoza podocita(Slika 7a–c).
Slika 4|Rekombinantni ljudski trombomodulin (rhTM) inhibira glomerulosklerozu i tubulointersticijsku fifibrozu. Sekcije bubrežnog tkiva obojene su (a,b) periodičnom kiselinom–Schiff i (c,d) Massonovim trikromom i (e) zatim kvantificirane pomoću sustava bodovanja ili WinROOF softvera za snimanje. (e) Srednja vrijednost skupine divljeg tipa (WT)/fiziološke otopine (SAL) uzeta je kao 100 posto. Statistička analiza Mann-Whitney U testom. (f) Sadržaj hidroksiprolina u tkivu mjeren je kolorimetrijskom metodom, koncentracija kolagena I-a1 (Col1a1) i periostina enzimskim imunološkim testom, a ekspresija mRNA lančanom reakcijom reverzne transkriptaze-polimeraze. Statistička analiza Kruskal Wallis analizom varijance i korigiranim Dunnovim testom. n=8 u svakoj grupi. Šipke {{10}} (a,c) 50 mm i (d) 20 mm. Podaci su izraženi kao medijan ± interkvartilni raspon. *P <0,05, **p=""><0,01, ***p=""><0,001, ****p=""><0,0001. tg,="" transgeni;="" tgfb1,="" transformirajući="" faktor="" rasta="" b1.="" kako="" biste="" optimizirali="" gledanje="" ove="" slike,="" pogledajte="" internetsku="" verziju="" ovog="" članka="" na="">
rhTM inhibira EMT podocita
Bilo je značajno povećano područje s pozitivnim bojanjem za podocin i a-aktin glatkih mišića (a-SMA) (1,4 posto naspram 11,2 posto) kod TGFb1-TG/SAL miševa u usporedbi s TGFb1-TG / rhTM miševi (Slika 8a i b). Zatim smo uzgojili in vitro primarne ljudske podocite, prethodno tretirane s rhTM prije dodavanja TGFb1 proteina u medij kulture. Morfologija slična fibroblastima i pojačana ekspresija a-SMA bili su potisnuti u podocitima tretiranim s rhTM u usporedbi s netretiranim stanicama (dodatna slika S20A). Osim toga, rhTM je inhibirao ekspresiju mRNA fibronektina i vimentina, iako je pojačao ekspresiju mRNA E-kadherina u podocitima u usporedbi s ekspresijom u netretiranim stanicama (dodatna slika S20B). Članovi obitelji SMAD 2 (Smad2) i Smad3 igraju ključnu ulogu u TGFb1-posredovanoj epitelno-mezenhimskoj tranziciji (EMT).29 Tretman s rhTM značajno je potisnuo aktivaciju Smad2 i Smad3 u TGFb1-TG miševa u usporedbi s netretiranim TG miševima (Slika 8c) i ljudskim podocitima uzgojenim u prisutnosti TGFb1 (Dopunska slika S20C).29 TG miševi tretirani rhTM (TGFb1-TG/rhTM) također pokazuju manju ekspresiju a-SMA (3,7 posto naspram 17,2 posto) u tubularnim epitelnim stanicama u usporedbi s njihovim netretiranim ekvivalentima (dodatna slika S21A i B).
Slika 5|Rekombinantni ljudski trombomodulin (rhTM) ublažava oštećenje bubrega i bubrežnu disfunkciju. Kreatinin je mjeren enzimskom metodom; ukupni protein kolorimetrijskom metodom; i dušik uree u krvi (BUN) i albumin, molekula 1 ozljede bubrega (KIM-1), protein koji veže L-masnu kiselinu (L-FABP) i ukupni transformirajući čimbenik rasta b1 (TGFb1) enzimskim imunološkim testom. n=8 u svakoj grupi. Podaci su izraženi kao medijan±interkvartilni raspon. Statistička analiza Kruskal-Wallis analizom varijance i nekorigiranim Dunnovim testom. * P < {{10}}.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001,="" ****="" p="">< 0,0001,="" #p="0.06." ns,="" nije="" značajno;="" sal,="" fiziološka="" otopina;="" tg,="" transgeni;="" wt,="" divlji="">
GPR15 posreduje u inhibitornoj aktivnosti rhTM na EMT
Transfekcija podocita s FGFR1 siRNA nije mogla ukinuti inhibitornu aktivnost rhTM na relativne ekspresije mRNA kolagena I-a1 i a-SMA u podocitima tretiranim s TGFb1- (dodatna slika S22). Međutim, transfekcija stanica s GPR15 siRNA značajno je ukinula inhibitornu aktivnost rhTM na relativne ekspresije mRNA i kolagena I-a1 i a-SMA u podocitima tretiranim s TGFb1- (dodatna slika S22).
RASPRAVA
TGFb1 i ozljeda glomerularnih stanica
Uobičajena posljedica poremećaja koji uzrokuju CKD je bubrežna fifibroza.8,30,31 TGFb1 je čest pokretač fibrogeneze u bubrezima povezan s CKD uzrokovanim bolestima uključujući DM, arterijsku hipertenziju i autoimune poremećaje.10 Stanice iz glomerula i tubulointersticijskih prostora može lučiti latentne oblike TGFb1 koji, kada se prekomjerno aktiviraju tijekom ozljede tkiva, mogu dovesti do bubrežnih ožiljaka.32 Budući da TGFb1 može stimulirati vlastitu sekreciju, fibrozni proces općenito postaje začarani krug.8 Rani događaj u patogenom procesu TGFb 1- posredovanofibroza bubregaje ozljeda podocita i glomerularnih endotelnih stanica.33-35 Razina topljive TM u plazmi je marker endotelne ozljede. U skladu s ulogom TGFb1 u oštećenju bubrežnih stanica, ovdje smo pronašli značajnu korelaciju aktivnog TGFb1 s topivim TM, topivim podocinom i kreatininom u plazmi pacijenata sa DM. Preslušavanje između glomerularnih endotelnih stanica i podocita tijekom aozljeda bubregadovodi do lokalne ekspresije proteaza koje uzrokuju degradaciju glomerularne bazalne membrane.34-36 Ovo može objasniti otkrivanje topljivog podocina i njegovu značajnu korelaciju s topljivim TM u naših pacijenata s DM.
Slika 6|Rekombinantni ljudski trombomodulin (rhTM) potiskuje apoptozu podocita induciranu transformirajućim faktorom rasta b1 (TGFb1). (a) rhTM je dodan u medij kulture podocita 1 sat prije induciranja apoptoze s 10 ng/ml TGFb1 tijekom 48 sati. (b) Postotak stanica u subG1 fazi detektiran je drugom citometrijom. (a,b) n=3 u svakoj grupi. (c,d) Broj stanica s fragmentacijom DNA mjeren je analizom dUTP nick end-labeling (TUNEL) posredovanom terminalnom deoksinukleotidil transferazom (n=3 u fiziološkoj otopini [SAL]/SAL i rhTM/SAL skupinama; n=6 u skupinama SAL/TGFb1 i rhTM/TGFb1), i (e) stupanj cijepanja kaspaze-3 mjeren je Western blotom (n=4 u svakoj skupini). Šipke=100 mm. Podaci su izraženi kao medijan ± interkvartilni raspon. Statistička analiza Mann-Whitney U testom. *P < 0,05.="" dapi,="" 40="" ,6-diamidino-2-fenilindol;="" hpf,="" polje="" velike="" snage;="" ns,="" nije="" značajno.="" histogrami="" se="" prikazuju="" kao="" postotak="" max="" (postotak="" maksimalne="" vrijednosti),="" skalirajući="" svaku="" krivulju="" na="" način="100" posto.="" kako="" biste="" optimizirali="" gledanje="" ove="" slike,="" pogledajte="" internetsku="" verziju="" ovog="" članka="" na="">
Fifibroza bubrega povezana s prekomjernom ekspresijom ljudskog TGFb1 specifična za podocite
Lijek koji se može suprotstaviti učinku TGFb1 bio bi idealan za blokiranje fifibroze bubrega. Ovdje smo generirali TG miša koji prekomjerno izražava ljudski gen TGFb1 u glomerulu koji razvija spontanu i progresivnu glomerularnu sklerozu i tubulointersticijalnu fifibrozu sa zatajenjem bubrega već 4 tjedna nakon rođenja. Model pokazuje uznapredovalu glomerulopatiju s ozljedom podocita i glomerularnih endotelnih stanica; zadebljanje bazalne membrane glomerula i širenje mezangija s intersticijskim ožiljcima; povećani markeri ozljede bubrežnog tkiva i bubrežne disfunkcije; i povećan TGFb1 u plazmi,bubrežnog tkiva, i urin. Povećanje urinarnog izlučivanja proteina, TGFb1 i aktivacija sustava komplementa može objasniti istovremeni razvoj intersticijskog ožiljka u našem sadašnjem modelu.37-40 Daljnji eksperimenti otkrili su povećan broj apoptotičkih stanica i aktivaciju Smad proteina u tkivu bubrega iz neliječenog TGFb{ {3}}TG miševi u usporedbi s WT miševima. Sve u svemu, ovi nalazi ukazuju na ovog novog TGFb1-TG miša kao prikladnog modela za otkrivanje lijeka ufibroza bubrega.
Slika 7|G-protein spregnuti receptor (GPR15) posreduje u inhibiciji apoptoze rekombinantnog humanog trombomodulina (rhTM) u podocitima. Ljudske primarne stanice podocita transficirane su fibroblastnim receptorom faktora rasta 1 (FGFR1) malom interferirajućom RNA (siRNA), GPR15 siRNA ili kodiranom siRNA tijekom 48 sati, a zatim je rhTM dodan staničnoj kulturi 1 sat prije tretiranja transformirajućim faktorom rasta b1 (TGFbl). Apoptotičke stanice su (a) procijenjene citometrijom i (b) zatim kvantificirane. (c) Stanični lizati su pripremljeni za Western blotting. n{{10}} u svakoj grupi. Podaci su izraženi kao medijan ± interkvartilni raspon. Statistička analiza Mann-Whitney U testom. *P < 0,05,="" #p="0.1." sal,="" fiziološka="">
Slika 8|Inhibicija prijelaza epitel-mezenhim rekombinantnim humanim trombomodulinom (rhTM). (a) Podocin i a-aktin glatkih mišića (a-SMA) obojeni su kako je opisano u Metodama. (b) Područje pozitivno za a-SMA bojenje kvantificirano je softverom za obradu slike WinROOF. n=3 u skupinama divljeg tipa (WT)/fiziološke otopine (SAL) i WT/rhTM i n=5 utransformirajući faktor rasta-b1–transgeni(TGFb{{0}}TG)/SAL i TGFb1-TG/rhTM skupine. (c) Ukupni (t) i fosforilirani (p) proteini člana obitelji SMAD (Smad) procijenjeni su Western blotom. n=8 u svakoj grupi. Podaci su izraženi kao medijan ± interkvartilni raspon. Statistička analiza Kruskal-Wallis analizom varijance i korigiranim Dunnovim testom. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" #p="0.08." kako="" biste="" optimizirali="" gledanje="" ove="" slike,="" pogledajte="" internetsku="" verziju="" ovog="" članka="" na="">
rhTM ublažava fifibrozu bubrega
Pokazali smo da rhTM ublažava plućnu fifibrozu razvijenu kod miševa koji imaju prekomjernu ekspresiju ljudskog TGFb1 u plućima potiskivanjem apoptoze alveolarnih epitelnih stanica.41 Klinička ispitivanja također su pokazala ublažavanje idiopatske plućne fifibroze nakon liječenja rhTM.42,43 Ova prethodna opažanja sugeriraju potencijal rhTM za terapiju fifibroze organa. Pretpostavili smo da bi rhTM bio učinkovit kod fifibroze bubrega povezane s TGFb1-. Kako bismo testirali ovu hipotezu, liječili smo TGFb1-TG miševe specifične za bubrege s rhTM.44 Primjena rhTM tijekom 4 tjedna značajno je ublažila ozljede, disfunkciju i fifibrozu bubrega. Miševi tretirani s rhTM pokazali su niske razine ukupnih proteina, albumina, TGFb1, C5a u mokraći i smanjene bubrežne razine profibrotičkih citokina, C5a i HMGB1.45 Terapija s rhTM također je inhibirala i apoptozu i EMT podocita. Međutim, rhTM nije imao nikakav učinak na trombin antitrombinski kompleks, marker aktivacije koagulacije, iako je povećao stvaranje APC, antikoagulantnog faktora s protuupalnim i antiapoptotskim djelovanjem.23 Vrijedno je napomenuti da trombin, prokoagulacijski enzim, može paradoksalno potiču antikoagulaciju u protrombotičkim stanjima niskog stupnja stvaranjem TM/trombinskog kompleksa, koji povećava stvaranje antikoagulansa APC. Međutim, trombin djeluje uglavnom kao prokoagulant u prekomjernim protrombotičkim stanjima (npr. sepsa).46 Ovaj dvostruki i paradoksalni učinak trombina može objasniti očitu neučinkovitost rhTM u inhibiciji aktivacije koagulacije u našem modelu, koji je u protrombotičkom stanju niskog stupnja . Sve u svemu, ova opažanja sugeriraju da rhTM amelio ubrzava progresivnu fifibrozu i disfunkcijububregaproduljenjem preživljavanja ili sprječavanjem EMT glomerularnih stanica i suzbijanjem upale, aktivacije komplementa i aktivnosti faktora rasta izravno ili neizravno putem aktivacije puta proteina C i smanjenja ekspresije HMGB1. Poboljšanje dijabetičke nefropatije kod miševa s povećanom cirkulirajućom TM domenom sličnom lektinu i pogoršanje bolesti kod miševa kojima nedostaje domena slična lektinu podupiru povoljan učinak rhTM na bubrežnu fifibrozu.20,21
Inhibicija apoptoze podocita
Podociti igraju ključnu ulogu u održavanju barijere glomerularne filtracije i formiranju prorezane dijafragme kako bi se spriječio gubitak esencijalnih cirkulirajućih proteina.47Ozljeda bubregauzrokovan reaktivnim vrstama kisika, visokom glukozom ili upalnim medijatorima uključujući TGFb1 inducira apoptozu podocita što dovodi do smanjenja broja podocita što na kraju može uzrokovati bubrežnu disfunkciju.47 Nakon vezanja i aktivacije serin/treonin kinaze transmembranskog heteromernog receptorskog kompleksa tipa I i tipa II , TGFb1 emitira unutarstanične signale kroz obitelj transkripcijskih faktora Smad ili putem signalnih putova neovisnih o Smad.48 Aktivacija puta ovisnog o Smad događa se kada aktivirani TGFb1 receptor fosforilira Smad2 i Smad3, koji sa Smad4 translociraju u jezgru.49 Smad2/ Kompleks Smad3/Smad4 stimulira transkripciju proapoptotskih čimbenika i smanjuje transkripciju antiapoptotičkih čimbenika koji dovode do apoptoze stanice.49 U skladu s tim, otkrili smo visoku bubrežnu razinu proapoptotičkog faktora Bax i nisku razinu antiapoptotičkih čimbenika Bcl2 i Bcl-XL. u TGFb1- TG miševa. TM može inhibirati apoptozu različitih tipova stanica.21,41,49 U skladu s ovim, ovdje smo otkrili da rhTM inhibira apoptozu podocita induciranu vodikovim peroksidom, visokom glukozom ili TGFb1, a ovo otkriće može objasniti povoljan učinak rhTM u KBB-u . Osim toga, rhTM je nagnuo ravnotežu prema inhibiciji apoptoze smanjenjem ekspresije Baxa, povećanjem ekspresije Bcl2, Bcl-XL, BIRC5 i BIRC6 te povećanjem aktivacije Akt puta utkiva bubrega. Sveukupno, ova opažanja sugeriraju da rhTM stimulira preživljavanje podocita favorizirajući aktivaciju Akt i ekspresiju antiapoptotskog faktora.
cistanche za kroničnu bolest bubrega
Inhibicija EMT-a
EMT podocita također pridonosi fifibrozi bubrega. Podociti koji su podvrgnuti EMT-u oslobađaju proteine izvanstaničnog matriksa koji se akumuliraju i talože tijekom bubrežne fifibrogeneze povezane s TGFb1-.50 TGFb1 potiče EMT putem aktivacije kompleksa Smad2/Smad3/Smad4 posredovane receptorima. Fosforilirani Smad3 potiče EMT stimuliranjem transkripcije proteina matriksa i smanjenjem ekspresije epitelnih markera.51 U skladu s tim, pronašli smo povećani EMT podocita u TGFb1-TG miševa i podocita uzgojenih u prisutnosti TGFb1 ili pod stanja oksidansa ili visoke glukoze. Prethodna izvješća sugerirala su da rhTM potiskuje EMT.52,53 Ovdje smo otkrili da rhTM inhibira EMT podocita i tubulointersticijskih epitelnih stanica u TGFb1-TG miševa. Čini se da je inhibicija aktivacije proteina Smad mehanizam blagotvornog učinka rhTM na EMT jer TGFb1-TG miševi i primarni podociti tretirani s rhTM prikazuju značajno smanjenu fosforilaciju Smad2 i Smad3 u usporedbi s neliječenim uvjetima. Ovi nalazi podupiru inhibitornu aktivnost TM na EMT.
Posredovanje receptora u zaštitnoj aktivnosti rhTM
Prethodne studije su pokazale da GPR15 ili FGFR1 posreduju u citoprotektivnoj aktivnosti TM.26,27,54 Testirali smo posreduju li ti receptori u zaštitnoj aktivnosti rhTM protiv apoptoze i EMT. Dok je niža regulacija GPR15 proteina pomoću siRNA potpuno ukinula supresivnu aktivnost rhTM na TGFb1-posredovanu apoptozu podocita, ni FGFR1 siRNA ni njegov inhibitor nisu je ukinuli, što sugerira da GPR15 posreduje u rhTM zaštitnoj aktivnosti. Došlo je do pojačane fosforilacije Akt u uzgojenim podocitima i podocitima izoliranim iz TGFb1-TG miševa nakon tretmana s rhTM, što ukazuje na uključenost unutarstaničnog Akt puta. Rad koji pokazuje da rhTM aktivira put Akt u endotelnim stanicama podupire ovo otkriće.55 Aktivacija signalnog puta Akt može dodatno pojačati učinak rhTM povećanjem površinske ekspresije GPR15.56 Ova opažanja pokazuju da rhTM štiti podocite od apoptoze u našem TGFb{ {13}}TG miševi aktiviranjem osi GPR15/Akt što dovodi do pojačane ekspresije antiapoptotskih čimbenika i smanjene ekspresije proapoptotičkih čimbenika.57 S druge strane, prethodne studije pokazale su da anafilatoksini C3a i C5a putem svojih GPR-ova mogu doprinijeti CKD ozljeđivanjem podocita i da APC može inhibirati apoptozu podocita i fifibrozu bubrega preko svog receptora endotelnog proteina C i receptora aktiviranog proteazom 1.23,58–61 Ovdje smo otkrili da rhTM inhibira sustav komplementa i povećava stvaranje APC-a. Stoga, osim aktivacije puta GPR15/Akt, inhibicija faktora komplementa i povećana aktivacija proteina C i njegovih receptora također mogu objasniti korisne učinke rhTM u našem TGFb1-povezanommodel fifibroze bubrega.
Osim toga, regulacija GPR15, ali ne i FGFR1, blokirala je inhibitorni učinak rhTM na EMT, što sugerira da GPR15 također posreduje u ovoj rhTM zaštitnoj aktivnosti. Inhibicija Smad proteina uključena je u supresiju EMT-a jer je tretman s rhTM inhibirao fosforilaciju i Smad2 i Smad3 u TGFb1-TG miševima i uzgojenim podocitima. Međutim, točan mehanizam inhibicije proteina Smad putem GPR15 nije jasan. Neki dokazi pokazuju da se put Akt može preslušavati i regulirati signalni put Smad, 62-64 i da Akt može spriječiti fosforilaciju Smad3 izravnom interakcijom s nefosforiliranim Smad3 kako bi ga odvojio izvan jezgre što dovodi do inhibicije transkripcije i EMT-a.62- 64 Na temelju ovih izvješća, moguće je da se Akt aktivira nakon što se rhTM veže na GPR15, izdvaja nefosforilirani Smad3 što dovodi do inhibicije EMT podocita. Vrijedno je napomenuti da se ovaj Akt-posredovani povoljan učinak opaža samo u nemalignim stanicama.65-67 U malignim stanicama, interakcija TGFb1 s njegovim receptorima može izravno aktivirati fosfoinozitid 3-kinazu/Akt/Puž put i uzrokovati EMT.65–67 Sve u svemu, rezultati naše studije podržavaju ulogu GPR15 kao receptora koji posreduje u korisnim učincima rhTM na podocite.
Zaključak
Ukratko, ovdje po prvi put izvješćujemo o novom transgenom TG mišu koji prekomjerno izražava punu duljinu ljudskog TGFb1 gena posebno u glomerulima koji razvijaju spontanu i progresivnu glomerularnu sklerozu, tubulointersticijsku fifibrozu izatajenje bubregai ublažavanje utvrđene bubrežne fifibroze/zatajenja bubrega pomoću rhTM interakcije s GPR15 koji inhibira apoptozu i mezenhimalnu tranziciju podocita.
METODE
Generacija TGFb1 BAC TG miša
TGFb1-BAC-TG miš koji eksprimira ljudski gen TGFb1 pune duljine pod kontrolom mišjeg promotora podocina stvoren je pronuklearnom injekcijom u 392 C57BL/6J mišja embrija (CLEA Japan, Inc., Tokio, Japan). Procijenili smo osnivače TG-a i prijenos germinativne linije BAC TG konstrukta pomoću Southern blottinga (dodatni materijali i metode).
Pokusne životinje
TGFb1-TG miševi uzgajani su više od 10 generacija pod C57BL/6 pozadinom prije upotrebe u eksperimentima. WT srodnici iz legla korišteni su kao kontrolne životinje. Sve su životinje držane u specifičnom okruženju bez patogena i podvrgnute 12--satnom ciklusu svjetlo-tama na temperaturi i vlažnosti okoline u rasponu između 22 i 26 stupnjeva te 40 posto i 70 posto, te uz ad libitum pristup na hranu i vodu u nastambi za životinje Sveučilišta Mie (Dodatni materijali i metode).
Etička izjava
Odbor za sigurnost pokusa rekombinantne DNK (br. odobrenja I-629; datum: 19. rujna 2013.) i Odbor za istraživanje životinja Sveučilišta Mie (br. odobrenja 27-4; datum: 19. kolovoza 2015.) odobrio protokole studije. Svi postupci na životinjama izvedeni su u skladu s institucionalnim smjernicama Sveučilišta Mie i prema međunarodno odobrenim načelima skrbi za laboratorijske životinje koje je objavio Nacionalni institut za zdravlje (https://olaw.nih.gov/).
Za kliničko ispitivanje, pismeni informirani pristanak dali su svi pacijenti i zdravi subjekti, a protokol studije odobrilo je Etičko povjerenstvo za klinička ispitivanja Sveučilišta Mie (br. odobrenja 1043 i 2194).
Eksperimentalni dizajn
Za karakterizacijububregmodelu fifibroze, podijelili smo mužjake TGFb{{0}}TG miševa (n=24) i mužjake WT miševa (n=12) starosti 4 tjedna i težine 20 do 23 g u 3 skupine skupine s 8 TGF b1-TG miševa i 4 WT miša u svakoj skupini. Miševi iz svake skupine WT i TGFb1-TG eutanazirani su u tjednu 0, 8 ili 16 kako bi se prikupili uzorci urina, krvi i bubrega za procjenu promjena u fifibrozi i parametrima bubrežne funkcije tijekom vremena.
Za procjenu terapijske učinkovitosti rhTM (rhTM je ljubazno osigurao Asahi Kasei Pharma Corporation, Tokyo, Japan) u fifibrozi bubrega, TGFb1-TG miševi (n= 8) ili WT legla (n {{2 }}) tretirani su rhTM (3 mg/kg) ip injekcijom, 3 puta tjedno tijekom 4 tjedna prije nego što su miševi ubijeni. TGFb1-TG miševi (n =8) ili WT iz legla (n= 8) koji su primali jednaku količinu fiziološkog SAL-a ip injekcijom korišteni su kao miševi negativne kontrole.
Protokol ove studije slijedio je smjernice Istraživanje na životinjama: Izvještavanje o pokusima in vivo (ARRIVE) za istraživanje na životinjama. Miševi su bili randomizirani, a istraživači koji su mjerili parametre bili su slijepi za skupine za liječenje.
Biokemijska analiza
Koncentracije ukupnog proteina (BCA komplet za ispitivanje proteina; Pierce, Rockford, IL), TGFb1 (R&D System, Minneapolis, MN), monocitnog kemoatraktantnog proteina-1 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), trombina, antitrombinskog kompleksa (Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Kanada) mjereni su korištenjem komercijalnih setova za enzimski imunotest prema uputama proizvođača (Dodatni materijali i metode).
Kultura stanica
Ljudske primarne stanice podocita kupljene su od CELPR OGEN (Torrance, CA). Primarne stanice ljudskih podocita uzgajane su u Dulbeccovom modificiranom Eagle mediju u vlažnoj atmosferi s 5 posto CO2 na 37 stupnjeva. Medij je dopunjen s 10 posto fetalnog goveđeg seruma inaktiviranog toplinom (Bio Whittaker, Walkersville, MD), 100 IU/ml penicilina, 100 mg/ml streptomicina i L-glutamina (dodatni materijali i metode).
Statistička analiza
Podaci su izraženi kao medijan±interkvartilni raspon. Statistička razlika između varijabli izračunata je Kruskal-Wallis analizom varijance s post hoc analizom pomoću Dunnovog testa. Za procjenu razlika između 2 skupine korišten je Mann-Whitney U test. Statističke analize učinjene su korištenjem GraphPad Prism verzije 8.0.1 (GraphPad Software, San Diego, CA). Statistička značajnost smatrana je kao P <>
RAZOTKRIVANJE
ECG, CND-G i YY imaju patent na TGFb1-TG mišu sfifibroza bubregakorišten u ovoj studiji. CND-G i YY dobili su potporu od Ministarstva obrazovanja, kulture, sporta, znanosti i tehnologije Japana za ovu studiju. ECG, TY, CND-G i MT dobili su potporu od Shionogi Pharmaceuticals. Svi ostali autori izjavili su da nemaju suprotstavljenih interesa.
ZAHVALA
Ovo je istraživanje djelomično podržano potporama Ministarstva obrazovanja, kulture, sporta, znanosti i tehnologije Japana (Kakenhi br. 17K09824 za YY; Kakenhi br. 17K08442 za CND-G), a dijelom potporom Shionogija & Co, Ltd., Japan. Financijeri nisu imali nikakvu ulogu u dizajnu studije, analizi podataka, odluci o objavljivanju ili pripremi rukopisa.
Dio ovog rada objavljen je u obliku sažetka.
AUTORSKI PRILOZI
AT je pripremio model bolesti i napisao prvi nacrt rukopisa. TY, KN, TT, RI i CND-G pripremili su modele bolesti i izmjerili parametre. AM i SW su proveli transmisijsku mikroskopsku studiju. MT, YO i AU mjerili su parametre i izvodili in vitro eksperimente. YT, LQ, TK i VFD dali su intelektualne doprinose. YY i ECG ispravili su nacrt rukopisa i dizajnirali studiju.
cistanche za simptome zatajenja bubrega
DOPUNSKI MATERIJAL
Dodatna datoteka (PDF) Dodatni materijali i metode.
Tablica S1. Karakteristike subjekata.
Tablica S2. Primeri za RT-PCR mišjih tkiva.
Tablica S3. Primeri za RT-PCR ljudskih podocita.
Slika S1. Topljivi fragmenti trombomodulina koreliraju s TGFb1 i kreatininom u bolesnika s DM.
Slika S2. Konstrukt ljudskog TGFb1–bakterijskog umjetnog kromosoma (BAC). Slika S3. Miševi osnivači koji izražavaju ljudski gen TGFb1 pune duljine.
Slika S4. Karakterizacija glomerul-specifičnog transformirajućeg faktora rasta b1 transgenog miša.
Slika S5. Ljudski TGFb1 transgeni miš ima povećane markere oštećenja bubrega.
Slika S6. Terapija rekombinantnim humanim trombomodulinom (rhTM) smanjuje brisanje podocita i zadebljanje glomerularne bazalne membrane.
Slika S7. TGFb1 transgeni miševi tretirani rekombinantnim humanim trombomodulinom (rhTM) imaju nisku koncentraciju profibrotskih faktora i HMGB1 u bubrežnom tkivu. Slika S8. Terapija s rekombinantnim ljudskim trombomodulinom (rhTM) povećava stvaranje aktiviranog proteina C, inhibira sustav komplementa, smanjuje cirkulirajući topljivi podocin, iako ne djeluje na koagulacijski sustav kod TGFb1 transgenih miševa.
Slika S9. Terapija rekombinantnim humanim trombomodulinom (rhTM) smanjuje koncentraciju podocina u mokraći.
Slika S10. Terapija rekombinantnim humanim trombomodulinom (rhTM) smanjuje apoptozu glomerularnih stanica.
Slika S11. Liječenje fifibroze bubrega povezane s prekomjernom ekspresijom TGFb1- rekombinantnim ljudskim trombomodulinom (rhTM) inhibira apoptozu u bubrežnom tkivu.
Slika S12. Rekombinantni ljudski trombomodulin (rhTM) povećava ekspresiju antiapoptotskih čimbenika u podocitima.
Slika S13. Rekombinantni ljudski trombomodulin (rhTM) suzbija apoptozu podocita induciranu vodikovim peroksidom.
Slika S14. Rekombinantni ljudski trombomodulin (rhTM) suzbija apoptozu podocita izazvanu visokim razinama glukoze.
Slika S15. Rekombinantni ljudski trombomodulin (rhTM) povećava aktivaciju Akt putova u podocitima.
Slika S16. Terapija s rekombinantnim ljudskim trombomodulinom (rhTM) povećava Akt fosforilaciju u podocitima TGFb1-TG miševa.
Slika S17. Podociti iz svake tretirane skupine miševa eksprimiraju GPR15 mRNA.
Slika S18. Bojanje GPR15 u podocitima zdrave osobe i bolesnika s žarišnom segmentnom glomerulosklerozom.
Slika S19. Receptor faktora rasta fibroblasta-1 nije uključen u inhibitornu aktivnost rekombinantnog humanog trombomodulina (rhTM) u podocitima.
Slika S20. Rekombinantni ljudski trombomodulin (rhTM) inhibira epitelno-mezenhimalni prijelaz podocita.
Slika S21. Terapija rekombinantnim humanim trombomodulinom (rhTM) inhibira ekspresiju aktina glatkih mišića u bubrežnim tubulima.
Slika S22. G-protein spregnuti receptor (GPR15) posreduje u inhibicijskoj aktivnosti rekombinantnog humanog trombomodulina (rhTM) na epitelno-mezenhimskom prijelazu podocita.
Dopunske reference.
REFERENCE
1. Webster AC, Nagler EV, Morton RL, et al. Kronična bolest bubrega. Lanceta. 2017;389:1238-1252.
2. Bello AK, Levin A, Tonelli M, et al. Procjena globalnog statusa zdravstvene zaštite bubrega. JAMA. 2017;317:1864-1881.
3. Levin A, Tonelli M, Bonventre J, et al. Globalno zdravlje bubrega 2017. i kasnije: putokaz za uklanjanje praznina u skrbi, istraživanju i politici. Lanceta. 2017;390:1888-1917.
4. Ackland P. Prevalencija, otkrivanje, procjena i liječenje kronične bubrežne bolesti. BMJ. 2014;348:f7688.
5. Turner JM, Bauer C, Abramowitz MK, et al. Liječenje kronične bolesti bubrega. Kidney Int. 2012;81:351-362.
6. Breyer MD, Susztak K. Sljedeća generacija terapeutika za kroničnu bubrežnu bolest. Nat Rev Drug Discov. 2016;15:568-588.
7. Liu Y. Bubrežna fifibroza: novi uvidi u patogenezu i terapiju. Kidney Int. 2006;69:213-217.
8. Liu Y. Stanični i molekularni mehanizmi fifibroze bubrega. Nat Rev Nephrol. 2011;7:684-696.
9. Xavier S, Vasko R, Matsumoto K, et al. Smanjenje endotelnog TGF-beta signaliziranja dovoljno je za smanjenje endotelno-mezenhimalne tranzicije i fifibroze u CKD. J Am Soc Nephrol. 2015;26:817-829.
10. Higgins SP, Tang Y, Higgins CE, et al. TGF-beta1/p53 signalizacija u fifibrogenezi bubrega. Stanični signal. 2018;43:1–10.
11. Conway EM. Trombomodulin i njegova uloga u upali. Semin Immunopathol. 2012;34:107-125.
12. Martin FA, Murphy RP, Cummins PM. Trombomodulin i vaskularni endotel: uvid u funkcionalne, regulatorne i terapijske aspekte. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2013;304:H1585-H1597.
13. Morser J. Thrombomodulin povezuje koagulaciju s upalom i imunitetom. Curr Ciljevi lijekova. 2012;13:421-431.
14. Roeen Z, Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. Trombomodulin inhibira aktivaciju eozinofila i mastocita. Cell Immunol. 2015;293:34-40.
15. Takagi T, Taguchi O, Toda M, et al. Inhibicija alergijske bronhijalne astme trombomodulinom je posredovana dendritskim stanicama. Am J Respir Crit Care Med. 2011;183:31-42.
16. Tateishi K, Imaoka M, Matsushita M. Dualne modulirajuće funkcije trombomodulina u alternativnom putu komplementa. Biosci Trendovi. 2016;10:231-234.
17. Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, et al. Trombomodulin modulira dendritične stanice putem oba antagonizma proteina B1 skupine visoke pokretljivosti i nezavisnog mehanizma. Allergol Int. 2014;63:57-66.
18. Van de Wouwer M, Plaisance S, De Vriese A, et al. Domena trombomodulina slična lektinu ometa aktivaciju komplementa i štiti od artritisa. J Tromb Hemost. 2006;4:1813-1824.
19. Sharfuddin AA, Sandoval RM, Berg DT, et al. Topljivi trombomodulin štiti ishemijske bubrege. J Am Soc Nephrol. 2009;20:524-534.
20. Wang H, Vinnikov I, Shahzad K, et al. Domena trombomodulina slična lektinu ublažava dijabetičku glomerulopatiju putem inhibicije komplementa. Tromb Hemost. 2012;108:1141-1153.
21. Yang SM, Ka SM, Wu HL, et al. Trombomodulinska domena 1 ublažava dijabetičku nefropatiju kod miševa putem upale posredovane anti-NF-kappaB/NLRP3, pojačavanjem antioksidativne aktivnosti NRF2 i inhibicijom apoptoze. Diabetologia. 2014;57:424-434.
22. Ohlin AK, Larsson K, Hansson M. Aktivnost topljivog trombomodulina i topljivi antigen trombomodulina u plazmi. J Tromb Hemost. 2005;3: 976–982.
23. Gil-Bernabe P, D'Alessandro-Gabazza CN, Toda M, et al. Egzogeni aktivirani protein C inhibira napredovanje dijabetičke nefropatije. J Tromb Hemost. 2012;10:337-346.
24. Yasuma T, Yano Y, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. Ublažavanje dijabetesa proteinom S. Dijabetes. 2016;65:1940-1951.
25. Havasi A, Borkan SC. Apoptoza i akutna ozljeda bubrega. Kidney Int. 2011;80:29-40.
26. Kuo CH, Sung MC, Chen PK, et al. FGFR1 posreduje rekombinantnom domenom trombomodulina induciranu angiogenezu. Cardiovasc Res. 2015;105:107–117.
27. Pan B, Wang X, Kojima S, et al. Peta regija trombomodulina slična epidermalnom faktoru rasta ublažava sepsu izazvanu LPS-om kroz interakciju s GPR15. Tromb Hemost. 2017;117:570-579.
28. Lu Y, Ye Y, Bao W, et al. Genomska identifikacija gena bitnih za citoskelete podocita na temelju jednostaničnog RNA sekvenciranja. Kidney Int. 2017;92:1119-1129.
29. Vigolo E, Marko L, Hinze C, et al. Kanonska BMP signalizacija u tubularnim stanicama posreduje u oporavku nakon akutne ozljede bubrega. Kidney Int. 2019;95:108-122.
30. Nangaku M. Kronična hipoksija i tubulointersticijska ozljeda: posljednji zajednički put do zatajenja bubrega u završnoj fazi. J Am Soc Nephrol. 2006;17: 17–25.
31. Thomas R, Kanso A, Sedor JR. Kronična bubrežna bolest i njezine komplikacije. Prim Care. 2008;35:329-344, vii.
32. Mozes MM, Bottinger EP, Jacot TA, et al. Bubrežna ekspresija proteina fibroznog matriksa i izoformi transformirajućeg faktora rasta-beta (TGF-beta) u TGF-beta transgenih miševa. J Am Soc Nephrol. 1999;10:271-280.
33. Arif E, Solanki AK, Srivastava P, et al. Motorni protein Myo1c regulira beta-signalizaciju transformirajućeg faktora rasta i fifibrozu u podocitima. Kidney Int. 2019;96:139-158.
34. Ebefors K, Wiener RJ, Yu L, et al. Endotelinski receptor-A posreduje u razgradnji površinskog sloja glomerularnog endotela putem patološkog preslušavanja između aktiviranih podocita i glomerularnih endotelnih stanica. Kidney Int. 2019;96:957-970.
35. Fu J, Lee K, Chuang PY, et al. Ozljeda endotelnih stanica glomerula i razgovor u dijabetičkoj bolesti bubrega. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308:F287-F297.
36. Masum MA, Ichii O, Elewa YHA, et al. Modificirana skenirajuća elektronska mikroskopija otkriva patološki preslušavanje između endotelnih stanica i podocita u mišjem modelu membranoproliferativnog glomerulonefritisa. Sci Rep. 2018; 8: 10276.
37. Abbate M, Zoja C, Rottoli D, et al. Proksimalne tubularne stanice potiču fifibrogenezu TGF-beta1-posredovanom indukcijom peritubularnih miofibroblasta. Kidney Int. 2002;61:2066-2077.
38. Liu BC, Tang TT, Lv LL, et al. Ozljeda bubrežnih tubula: pokretačka snaga prema kroničnoj bolesti bubrega. Kidney Int. 2018;93:568-579.
39. Loefflfler I, Wolf G. Transformirajući faktor rasta-beta i progresija bubrežne bolesti. Nephrol Dial transplantacija. 2014;29(dodatak 1):i37–i45.
40. Murakami K, Takemura T, Hino S, et al. Urinarni transformirajući faktor rasta-beta u bolesnika s glomerularnim bolestima. Pediatr Nephrol. 1997;11:334-336.
41. Fujiwara K, Kobayashi T, Fujimoto H, et al. Inhibicija stanične apoptoze i ublažavanje plućne fifibroze trombomodulinom. Am J Pathol. 2017;187:2312-2322.
42. Kataoka K, Taniguchi H, Kondoh Y, et al. Rekombinantni humani trombomodulin u akutnoj egzacerbaciji idiopatske plućne fifibroze. Prsa. 2015;148:436-443.
43. Tsushima K, Yamaguchi K, Yokoyama T, et al. Trombomodulin za akutne egzacerbacije idiopatske plućne fifibroze: studija dokaza koncepta. Pulm Pharmacol Ther. 2014;29:233-240.
44. Umemura Y, Yamakawa K. Optimalan odabir pacijenata za antikoagulantnu terapiju kod sepse: prijedlog Japana utemeljen na dokazima. J Tromb Hemost. 2018;16:462-464.
45. Chen Q, Guan X, Zuo X, et al. Uloga grupe visoke pokretljivosti box 1 (HMGB1) u patogenezi bolesti bubrega. Acta Pharm Sin B. 2016;6:183–188.
46. Miyake Y, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, et al. Dozno ovisni diferencijalni učinci trombina u alergijskoj bronhalnoj astmi. J Tromb Hemost. 2013;11:1903-1915.
47. Assady S, Wanner N, Skorecki KL, et al. Novi uvidi u biologiju podocita u zdravlju i bolesti glomerula. J Am Soc Nephrol. 2017; 28: 1707–1715.
48. Derynck R, Zhang YE. Smad-ovisni i Smad-neovisni putovi u signalizaciji obitelji TGF-beta. Priroda. 2003;425:577-584.
49. Schuster N, Krieglstein K. Mehanizmi apoptoze posredovane TGF-beta. Cell Tissue Res. 2002;307:1-14.
50. Greka A, Mundel P. Stanična biologija i patologija podocita. Annu Rev Physiol. 2012;74:299-323.
51. Isaka Y. Usmjeravanje TGF-beta signalizacije u fifibrozu bubrega. Int J Mol Sci. 2018;19:2532.
52. Chang YJ, Cheng YW, Lin RK, et al. Trombomodulin utječe na preživljenje pacijenata s nemetastatskim kolorektalnim karcinomom kroz prijelaz epitela u mezenhim (EMT). PLoS jedan. 2016;11:e0160550.
53. Zheng N, Huo Z, Zhang B, et al. Trombomodulin smanjuje tumorogeni i metastatski potencijal stanica raka pluća pojačanom regulacijom E-kadherina i nižom regulacijom ekspresije N-kadherina. Biochem Biophys Res Commun. 2016;476:252-259.
54. Pan B, Wang X, Nishioka C, et al. G-protein spregnuti receptor 15 posreduje u angiogenezi i citoprotektivnoj funkciji trombomodulina. Sci Rep. 2017;7:692.
55. Chen PS, Wang KC, Chao TH, et al. Rekombinantni trombomodulin ispoljava antiautofagijsko djelovanje u endotelnim stanicama i osigurava antiaterosklerozni učinak kod miševa s nedostatkom apolipoproteina E. Sci Rep. 2017; 7: 3284.
56. Chung JJ, Okamoto Y, Coblitz B, et al. Ekspresija površine proteina posredovana signalizacijom PI3K/Akt koju osjeti 14-3-3 motiv interakcije. FEB J. 2009;276:5547-5558.
57. Sanchez-Capelo A. Dvostruka uloga TGF-beta1 u apoptozi. Cytokine Growth Factor Rev. 2005;16:15–34.
58. Griffifin JH, Zloković BV, Mosnier LO. Aktivirani protein C, receptor 1 aktiviran proteazom i neuroprotekcija. Krv. 2018;132:159-169.
59. Isermann B, Vinnikov IA, Madhusudhan T, et al. Aktivirani protein C štiti od dijabetičke nefropatije inhibicijom apoptoze endotela i podocita. Nat Med. 2007;13:1349-1358.
60. Klos A, Tenner AJ, Johswich KO, et al. Uloga anafilatoksina u zdravlju i bolesti. Mol Immunol. 2009;46:2753-2766.
61. Morigi M, Perico L, Corna D, et al. Blokada receptora C3a štiti podocite od ozljeda kod dijabetičke nefropatije. JCI Insight. 2020; 5: e131849.
62. Conery AR, Cao Y, Thompson EA, et al. Akt izravno komunicira sa Smad3 kako bi regulirao osjetljivost na apoptozu izazvanu TGF-beta. Nat Cell Biol. 2004;6:366-372.
63. Derynck R, Muthusamy BP, Saeteurn KY. Suradnja signalnih putova u TGF-beta-induciranom epitelno-mezenhimskom prijelazu. Curr Opin Cell Biol. 2014;31:56-66.
64. Remy I, Montmarquette A, Michnick SW. PKB/Akt modulira TGF-beta signalizaciju kroz izravnu interakciju sa Smad3. Nat Cell Biol. 2004;6: 358–365.
65. Hamidi A, Song J, Thakur N, et al. TGF-beta potiče PI3K-AKT signalizaciju i migraciju stanica raka prostate putem TRAF6-posredovane sveprisutnosti p85alpha. Sci Signal. 2017;10:eaal4186.
66. Peng Z, Weber JC, Han Z, et al. Učinci dihotomije Akt signalizacije kod raka dojke. Mol Rak. 2012;11:61.
67. Zhou F, Geng J, Xu S, et al. FAM83A signalizacija inducira prijelaz mezenhima epitela PI3K/AKT/puževim putem u NSCLC. Starenje (Albany NY). 2019;11:6069-6088.
