Uloga genetskog testiranja u dijagnostičkom radu pedijatrijskih bolesnika s bubrežnim bolestima: iskustvo jedne ustanove

SažetakSvrhaNasljedne bolesti bubrega među vodećim su uzrocima zatajenja bubrega u djece, što rezultira povećanom smrtnošću, visokim troškovima zdravstvene skrbi i potrebom za transplantacijom organa. Tehnologije sekvenciranja sljedeće generacije mogu pomoći u dijagnozi rijetkih monogenih stanja, omogućujući optimizirano medicinsko upravljanje i terapijske izbore.

Metode Kliničko sekvenciranje egzoma (CES) provedeno je na kohorti od 191 pedijatrijskog pacijenta iz jedne ustanove, nakon čega je uslijedilo Sangerovo sekvenciranje za potvrdu identificiranih varijanti i za studije segregacije obitelji. Rezultati Svi pacijenti su imali kliničku dijagnozu bubrežne bolesti: glavne kategorije bolesti bile su glomerularne bolesti (32,5%), ciliopatije (20,4%), CAKUT (17,8%), nefrolitijaza (11,5%) i tubularna bolest (10,5%). 7,3% pacijenata imalo je druga stanja. Konačan genetski test, temeljen na CES i Sanger validaciji, dobiven je u 37,1% pacijenata. Najveća stopa otkrivenosti je postignuta za ciliopatije (74,4%), zatim za nefrolitijazu (45,5%) i tubularne bolesti (45%), dok je većina glomerularnih bolesti i CAKUT ostala nedijagnosticirana. Zaključci Rezultati pokazuju da genetsko testiranje koje se dosljedno koristi u dijagnostičkom tijeku rada djece s kroničnom bubrežnom bolešću može (i) potvrditi kliničku dijagnozu, (ii) omogućiti ranu dijagnozu u slučaju nasljednih stanja, (iii) i genetski uzrok prethodno neprepoznatih bolesti. bolesti i (iv) prilagođeni programi transplantacije.

Ključne riječi Kliničko sekvenciranje egzoma, Sekvenciranje sljedeće generacije,Bolesti bubrega, Genetsko testiranje, Pedijatrijska kohorta

KLIKNITE OVDJE DA DOBIJETE CISTANCHE ZAZAVRŠNI STADIJ BUBREŽNE BOLESTI

Uvod

Pedijatrijske nefropatije obuhvaćaju vrlo različite bolesne entitete u smislu kliničke slike, evolucije i terapijskih opcija [1-4]. Približno 30% djece s kroničnom bubrežnom bolešću (CKD) pati od monogenog stanja, a taj se postotak povećava kada se u obzir uzmu djeca sa završnom fazom bubrežne bolesti (ESRD) [5, 6]. Mnoga od te djece ostaje nedijagnosticirana u vrijeme transplantacije [4, 6, 7]. Postavljanje dijagnoze za ove pacijente ne samo da znači kraj dijagnostičke odiseje, već predstavlja nekoliko prednosti za prognozu, liječenje i liječenje

Pionirske studije dosljedno pokazuju da je implementacija tehnika sekvenciranja sljedeće generacije (NGS) značajno poboljšala dijagnostički učinak u bolesnika s nasljednim bolestima bubrega (IKB) [8]. U novije vrijeme, široka uporaba NGS-a učinila je genetsku dijagnozu dostupnom u razumnom vremenu i po pristupačnoj cijeni, postavljajući pitanje treba li i kada biti integrirana u rutinski tijek dijagnostike [5].

Genetska dijagnoza kod djece je od iznimne važnosti za različite aspekte. Prvi je da može biti relevantan u kliničkom pristupu bolesti, tipičan primjer je onaj nefrotskih sindroma gdje identifikacija strukturnih varijanti u genima povezanim s podocitima argumentira protiv imunosupresivnih terapija koje bi se inače rutinski koristile tijekom razdoblja od nekoliko mjeseci [9]. Drugo je da može biti vrlo relevantno za djetetovu obitelj i za identifikaciju drugih članova koji nose varijantu koja se može prenijeti na buduće generacije. Nakon što se identificira patogena varijanta kod probanda, kaskadno testiranje članova obitelji i genetsko savjetovanje kod nositelja varijante predstavljaju standardnu ​​praksu u kliničkoj genetici [5]. Treće je da je poznavanje patogene varijante bitno u kontekstu transplantacije gdje donor može biti rođak. Doista, ključno je isključiti prisutnost iste varijante(a) kod donora organa, kao što je kritično identificirati sve članove obitelji kojima je potencijalno potrebna transplantacija. Četvrto je da neke bolesti predstavljaju visok rizik od recidiva nakon transplantacije organa, kao što je žarišna segmentalna glomeruloskleroza [10] ili se njihov ishod može poboljšati prilagođenijim odabirom transplantacije koja će se izvesti, kao u slučaju primarne hiperoksalurija gdje kombinirana transplantacija bubrega i jetre može rezultirati boljim ishodom [11]. Konačno, imati jasnu dijagnozu bolesti može biti korisno za pacijenta da sudjeluje u kliničkim ispitivanjima i da ima koristi od novih mogućnosti liječenja [12, 13].

Krajem 2018., u suradnji između pedijatara nefrologa i genetičara, počeli smo provoditi genetske testove za monogena stanja koja potencijalno mogu dovesti do ESRD-a, a time i transplantacije. Naša je bolnica najveća u sjeverozapadnoj Italiji, s područja od oko 5 milijuna ljudi. Odabrali smo vrstu analize "jedna veličina za sve", sa sekvenciranjem kliničkog egzoma, tj. približno 6700 gena koji su povezani s monogenim stanjima, fokusirajući analizu na genske ploče prilagođene kliničkoj sumnji i stoga ograničavajući slučajne nalaze i smanjenje vremena za analizu sekvence.

Sveukupno, primjenom ovog niza dobili smo dijagnostički učinak u skladu s objavljenim podacima, uz određenu heterogenost među različitim kliničkim sumnjama, kao što je i očekivano. Dobiveni rezultati potvrđuju važnost uključivanja rutinskog genetskog testiranja i savjetovanja u dijagnostički rad pedijatrijskih bolesnika s nefropatijama. Doista, identifikacija uzročnih varijanti ključna je za njihovo kliničko liječenje, a potencijalno i za optimalan odabir živih darivatelja.

Materijali i metode

Zapošljavanje pacijenata

Studija se temeljila na dijagnostičkoj kohorti od 191 uzastopnog pedijatrijskog pacijenta (dob pri zapošljavanju < 18 godina), regrutiranih od strane Jedinica za pedijatrijsku nefrologiju, dijalizu i transplantaciju u Dječjoj bolnici Regina Margherita i upućenih Službi za imunogenetiku i transplantacijsku biologiju za genetske analize. Svi pacijenti uključeni u studiju dali su pismeni informirani pristanak potpisan od strane oba roditelja, kad god je to bilo moguće.

Priprema uzoraka, sekvenciranje i bioinformatičke analize

Ekstrakcija nukleinske kiseline iz periferne krvi, analiza kvalitete DNA, priprema biblioteke i sekvenciranje provedeni su kao što je prethodno objavljeno [14]. Neobrađeni podaci dobiveni sekvenciranjem pretvoreni su u FASTQ datoteke i zatim usklađeni s Enrichment 3.1.0 ili DRAGEN Enrichment tools (Illumina) i mapirani na TruSight One Expanded v2.0 manifestu koristeći Homo Sapiens UCSC GRCh37 genom kao referenca za dobivanje varijanti jednog nukleotida, varijanti broja kopija (CNV) i strukturnih varijanti datoteka. Za identifikaciju broja kopija, korištena je osnovna linija napravljena od podataka sekvenciranja od 5 različitih pacijenata, svi negativni na CNV (prema nizu komparativnih podataka genomske hibridizacije). Ovaj pristup omogućuje otkrivanje CNV-a čak iu spolnim kromosomima budući da su referentnu skupinu činile i ženske i muške osobe, a spol subjekta koji se analizira uvijek je određen tijekom faze usklađivanja. Pozivanje varijanti i određivanje prioriteta izvršeno je prema definiranim kriterijima. Poravnanje očitavanja i pokrivenost egzona gena od interesa provjereni su i prikazani pomoću Integrative Genomics Viewer IGV, besplatno dostupnog na UC San Diego—University of California i Broad Institute of MIT i Harvard University—Boston (https://software.broadinstitute. org/softver/igv/). Varijante koje će biti uključene u konačno genetsko izvješće klasificirane su prema kriterijima Američkog koledža za medicinsku genetiku i genomiku (ACMG).

Generiranje in silico popisa gena bolesti

Geni koje treba razmotriti za identifikaciju varijanti i određivanje prioriteta definirani su na temelju kliničkih sumnji. In silico popisi gena generirani su podudarajući (i) podatke iz različitih baza podataka, korelirajući genotip s fenotipom (OMIM, PanelApp Engleska, ClinGen, Malacards) i (ii) podatke iz literature. Dostupni popisi gena ažuriraju se jednom godišnje na temelju novih dokaza povezanosti gena i bolesti.

Sangerovo sekvenciranje i pojačanje sonde ovisno o multipleksnoj ligaciji (MLPA)

Sanger sekvencioniranje i/ili MLPA analize su provedene kako bi se potvrdile varijante koje je identificirao NGS i za studije segregacije obitelji. Ukratko, DNK je ekstrahirana počevši od drugog nezavisnog alikvota periferne krvi probanda i od roditelja. Područja DNA od interesa umnožena su PCR-om koristeći specifične eksperimentalne uvjete. Čistoća i specifičnost umnoženih regija provjerene su 0.8 ili 1,5% agaroznim gelom. Umnoženi PCR produkti zatim su Sanger sekvencirani korištenjem istih početnica. Za varijante PKD1, validacija je provedena pomoću PCR-a dugog dometa nakon kojeg je uslijedio ugniježđeni PCR kako bi se izbjegao bilo kakav zaključak iz pseudogena.

Rezultati

Definiranje kriterija za povrat rezultata genetske analize

We previously reported on the design and set-up of a "kidney" gene panel that comprises>400 gena uključenih u različite oblike bubrežnih bolesti [14]. Za ovu smo studiju proveli analizu s potpanelima usmjerenim na specifičnu kliničku kategoriju sumnje (npr. CAKUT, glomerulopatija, tubulopatija, itd.) i prethodno odredili određenu skupinu gena za analizu. Ovaj pristup ograničio je broj analiziranih gena, pojednostavio analize i smanjio broj slučajnih nalaza. Tek kada je na kraju analitičkog polja s relevantnim panelom(ima) genetski rezultat bio negativan i (i) klinički fenotip nije jasno naznačen ili (ii) preklapaju se različite kategorije bolesti, genetička analiza je proširena na tzv. "kidney full-list ili kidneyome", super-panel koji sadrži sve gene uključene u podpanele.

Kao prvi korak definirali smo skup kriterija za tumačenje NGS rezultata. Nakon izvođenja sekvenciranja kliničkog egzoma (CES) i usklađivanja podataka, određen je niz analiza za filtriranje relevantnih varijanti. Konkretno, na temelju kliničke sumnje, identificirane varijante filtrirane su na temelju in silico popisa gena, specifičnih za različite makrokategorije bolesti. Sinonimne varijante koje ne utječu na mehanizam spajanja ili introničke varijante koje se ne mapiraju unutar regije spajanja bile su isključene, uzimajući u obzir samo nesinonimne varijante, besmislice, pomak okvira i varijante koje utječu na spajanje. Uključeno je deset, samo rijetkih varijanti (učestalost manja od 1% u populaciji) i varijante s učestalošću alela u bolesnika od najmanje 0.2 i pokrivenošću od najmanje 20 čitanja. Preostale su varijante označene i dodatno odabrane na temelju (i) načina nasljeđivanja, (ii) očuvanja nukleotida, (iii) utjecaja proteina, iskorištavanja različitih baza podataka za provjeru rezultata i (iv) literature, ako postoji. U ovom su trenutku filtrirane varijante navedene u takozvanom "tehničkom izvješću". Tehničko izvješće protumačio je medicinski genetičar kako bi proizveo konačno genetsko izvješće za pacijenta i njegovu/njezinu obitelj. Tijekom genetskog savjetovanja predložene su studije o obiteljskoj segregaciji za (i) potvrđivanje varijanti u probandu i (ii) za uključivanje/isključivanje nekauzalnih varijanti na temelju njihove segregacije u obitelji (slika 1).

Usvajanjem ovih kriterija uspjeli smo definirati tri različite kategorije genetskih izvješća. Prvo, "završno izvješće" koje uključuje patogene (C5) i vjerojatno patogene (C4) varijante. Izvješća o varijantama nepoznatog značaja (C3) smatrana su konačnima samo ako su u potpunosti kompatibilna s kliničkom slikom i ako su studije o obiteljskoj segregaciji potvrdile njihovu moguću ulogu. Drugo, "nesigurno izvješće" koje je uključivalo varijante C3 koje je identificirao CES, a koje još nisu ili se nisu mogle potvrditi u kontekstu studija o obiteljskoj segregaciji ili varijante C4/C5 koje nisu bile u potpunosti u skladu s kliničkim fenotipom. Treće, "neuvjerljivo izvješće" koje je uključivalo (i) negativnu CES analizu, što znači da NGS nije identificirao nikakve varijante; (ii) pojedinačne varijante u recesivnim genima; i (iii) C3 varijante koje nisu u skladu s kliničkim fenotipom, identificirane kada je analiza proširena na svegeni povezani s bolestima bubrega(Sl. 1).

Glavna obilježja regrutirane kohorte

Ova studija opisuje skupinu od 191 pedijatrijskog pacijenta (0–18 godina) koje je pedijatrijska nefrološka jedinica uzastopno upućivala na genetsku analizu od studenog 2018. do svibnja 2022., s prosječno 50 novih pacijenata uključenih svake godine . Kriteriji za genetsko testiranje bili su (i) nefropatija povezana s pozitivnom obiteljskom poviješću bubrežne bolesti ili (ii) klinička sumnja na monogensko stanje ili (iii) potreba za isključivanjem monogenskog stanja (kao u slučaju nefrotskih sindroma, gdje se razlikuje monogene naspram nemonogenih bolesti klinički je značajno za prognozu i liječenje).

Kohorta je podijeljena na temelju kliničke sumnje, s obzirom na 6 različitih makrokategorija bolesti: kongenitalne anomalije bubrega i urinarnog trakta (CAKUT; n=34), ciliopatije (n=39), glomerulopatija (n=62), nefrolitijaza (n=22), tauopatije (n=20) i druge bolesti koje uključuju i sindromske fenotipove (n=14). Osim CAKUT-a i tubulopatija koje su pokazale podjednaku distribuciju između žena i muškaraca, u svim ostalim kategorijama prevalencija je muških ispitanika (slika 2a). Kad se pogleda dob zapošljavanja, nije istaknuta značajna različita distribucija među različitim skupinama, s prosječnom dobi u rasponu od 6,7 do 10 godina u "Ostalim bolestima" odnosno glomerulopatijama. Međutim, kada se gleda medijan dobi, CAKUT bolesti su pokazale najnižu vrijednost (4,6 godina), u skladu s kongenitalnim fenotipom. S gledišta etničke pripadnosti, neovisno o razmatranoj makrokategoriji bolesti, većina pacijenata bili su Europljani, zatim Afrikanci, sa samo nekoliko pacijenata koji su bili Azijci, Latinoamerikanci ili križanci (slika 2b). Među kohortom samo je 8 pacijenata imalo roditelje u krvnom srodstvu.

Slika 1. Cjevovod analize genetskih podataka i kriteriji za uključivanje varijanti. Shematski prikaz analitičkog cjevovoda usvojenog za identifikaciju varijanti i određivanje prioriteta, uključujući sve kriterije za filtriranje i filtriranje. Dobivene varijante uključene su u konačno genetsko izvješće. Kad god je to bilo moguće, provedena je validacija varijanti(a) i studije segregacije obitelji. Genetska izvješća klasificirana su kao uvjerljiva, nesigurna ili neuvjerljiva na temelju navedenih kriterija. Na temelju ove klasifikacije izračunata je dijagnostička stopa našeg tijeka rada sekvenciranja sljedeće generacije (NGS). 1 KG: baza podataka s 1000 genoma; Alt fr: promijenjena frekvencija; C3: varijanta nepoznatog značaja; C4: vjerojatna patogena varijanta; C5: patogena varijanta; AR: autosomno recesivno

Konačno, kada se uzme u obzir obiteljska anamneza za bubrežne bolesti, uzimajući u obzir muške i ženske subjekte odvojeno, heterogenost u distribuciji između pozitivnih i negativnih slučajeva bila je očita s obzirom na različite kategorije bolesti. Sveukupno, većinu regrutirane kohorte i neovisno o spolu nije karakterizirala pozitivna obiteljska anamneza, kao što je prikazano za CAKUT, glomerulopatije, tauopatije i druge bubrežne poremećaje. Međutim, kod ciliopatija i nefrolitijaze, značajan dio slučajeva pokazao je pozitivnu obiteljsku historiju s različitom raspodjelom između žena i muškaraca (13 slučajeva od 22 za ciliopatije i 5 od 12 za nefrolitijazu; slika 2c).

S kliničkog stajališta, kohorta je bila prilično heterogena s uključenim različitim primarnim bolestima (slika 2d). Među njima, najčešće ponavljane kliničke sumnje bile su policistična bolest bubrega (n=27), CAKUT (n=25), nefrotski sindrom (n=19), žarišna segmentalna glomeruloskleroza (FSGS; n =14) i Alportov sindrom (n=13; slika 2d).

Usluga podrške Wecistanche-najvećeg izvoznika cistanche u Kini:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/telefon:+86 15292862950

Kupite za više pojedinosti o specifikacijama:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

KLIKNITE OVDJE DA DOBIJETE PRIRODNI ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE SA 25% EHINAKOZIDA I 9% AKTEOZIDA ZA BUBREŽNE INFEKCIJE