Čitač RNA M6 A YTHDF2 kontrolira antitumorski i antivirusni imunitet NK stanica 3. dio

YTHDF2 je potreban za preživljavanje NK stanica posredovano IL-15, proliferaciju i efektorske funkcije

IL-15 je jedan od, ako ne i najvažniji citokin za pleiotropne funkcije NK stanica. Mi i drugi smo ranije otkrili da IL-15 igra ključnu ulogu u regulaciji homeostaze NK stanica, preživljavanja i efektorskih funkcija (Becknell i Caligiuri, 2005; Carsonet sur., 1997; Carson et al., 1994; Wang et al., 2019b; Yu i sur., 2013).

Pleiotropija stanica odnosi se na njihovu sposobnost obavljanja različitih funkcija u različitim okruženjima. Stanična pleiotropija usko je povezana s imunitetom jer mnoge stanice u imunološkom sustavu mogu igrati različite uloge.

U imunološkom sustavu, T stanice su vrlo kritična vrsta stanica. Oni prepoznaju i napadaju patogene, dok također reguliraju aktivnost drugih imunoloških stanica. Pleiotropija T stanica vrlo je važna jer kada imunološki sustav naiđe na novi patogen, T stanice moraju odigrati različite uloge u kratkom razdoblju kako bi učinkovito odgovorile. Na primjer, kada se imunološki sustav susreće s bakterijskom infekcijom, T-stanice trebaju igrati ulogu ubijanja bakterija, a kada se imunološki sustav susreće s virusnom infekcijom, T-stanice trebaju igrati ulogu regulacije drugih imunoloških stanica.

Osim toga, u imunološkom sustavu klasa stanica koje se nazivaju makrofagi također ima pleiotropne učinke. Oni mogu fagocitirati i razgraditi strane patogene, a također mogu aktivirati druge imunološke stanice da napadnu patogene. Pleiotropija makrofaga je važna jer oni moraju igrati različite uloge u različitim okruženjima. Na primjer, kod virusnih infekcija, makrofagi moraju lučiti neke tvari za borbu protiv virusa, dok kod bakterijskih infekcija, makrofagi moraju progutati i probaviti bakterije kako bi očistili patogen.

Ukratko, postoji tijesan odnos između stanične pleiotropije i imuniteta. Pleiotropne stanice mogu igrati različite uloge u okruženjima zaraženim različitim patogenima, čime se poboljšava sposobnost imunološkog sustava da odgovori i poboljšava imunitet tijela na različite patogene. Stoga bismo trebali obratiti pozornost na pleiotropiju stanica i također ojačati uzgoj imuniteta kako bismo održali ljudsko zdravlje. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje, jer Cistanche deserticola također može regulirati ravnotežu neurotransmitera, poput povećanja razine acetilkolina i faktora rasta. Ove tvari su vrlo važne za pamćenje i učenje. Osim toga, Cistanche deserticola također može poboljšati protok krvi i pospješiti opskrbu kisikom, što može osigurati da mozak dobije dovoljno hranjivih tvari i energije, čime se poboljšava vitalnost i izdržljivost mozga.

Kliknite na način da poboljšate svoje pamćenje

U trenutnoj studiji pokazujemo da je IL-15 povećao razinu mRNA i proteina YTHDF2 u NK stanicama (Slika 6 A; i Slika 1, D–F). Stoga smo nagađali da je YTHDF2 potreban za preživljavanje posredovano IL-15 i efektorske funkcije NK stanica.

Prvo smo pokušali identificirati potencijalne faktore transkripcije nizvodno od IL-15 signalizacije koji izravno reguliraju ekspresiju YTHDF2. Analizirali smo Encyclopedia of DNA Elements koristeći Genome BrowserDatabase Sveučilišta u Kaliforniji, Santa Cruz (https://genome.ucsc.edu), koja pruža predviđanja veznih mjesta u cijelom genomu, u kombinaciji s JASPAR-om (http://jaspar.genereg .neto).

Otkrili smo da STAT5, koji je ključni faktor nizvodno od IL-15 u NK stanicama, ima četiri vezna mjesta unutar 2 kb uzvodno od mjesta početka transkripcije (TSS) Ythdf2, što ukazuje da IL-15 može pozitivno reguliraju Ythdf2 transkripciju u mišjim NK stanicama putem STAT5.

Upotrebom inhibitora STAT5 STAT5-IN-1 (Müller et al., 2008.), pokazali smo da je inhibicija STAT5 rezultirala smanjenjem Ythdf2 i na razinama mRNA i proteina u mišjim NK stanicama (Slika S4, A i B). Kako bismo dodatno potvrdili da je YTHDF2 nizvodni faktor reguliran pomoću STAT5, koristili smo Stat5fl/fl Ncr1-iCre miševe (u daljnjem tekstu Stat5ΔNK miševi), gdje je STAT5 posebno izbrisan u mišjim NK stanicama (Wiedemann i dr. al., 2020).

Tretirali smo NK stanice slezene miševa Stat5WT i Stat5ΔNK s IL-15. Otkrili smo da se YTHDF2 značajno smanjio u NK stanicama Stat5ΔNK miševa u usporedbi s NK stanicama Stat5WT miševa i na razini RNK i proteina (Slika 6, B i C; i Slika S4, C i D).

Analiza luciferaze reportera pokazala je da i STAT5a i STAT5b izravno aktiviraju transkripciju gena Ythdf2 (Slika 6, D i E). Rezultati imunoprecipitacije kromatina (ChIP)–qPCR pokazali su da STAT5 ima značajno obogaćenje na četiri mjesta u odnosu na normalnu kontrolu IgG, što ukazuje na izravno vezanje u mišjim NK stanicama (Slika 6 F). Zajedno, naši rezultati pokazuju da je ekspresija YTHDF2 regulirana STAT5 nizvodno od IL-15 signalizacije u NK stanicama.

Zatim smo se zapitali jesu li NK stanice s manjkom Ythdf2-defektne u svom odgovoru na IL-15. Izolirali smo NK stanice slezene iz Ythdf2ΔNK miševa i Ythdf2WT miševa i uzgajali ih in vitro u prisutnosti IL-15. Otkrili smo da je rast NK stanica značajno smanjen kod Ythdf2ΔNK miševa u usporedbi s Ythdf2WT miševima (slika 6 G). Test označavanja CellTrace Violet (CTV) pokazao je da je proliferacija NK stanica oslabljena nedostatkom Ythdf2 (slika 6 H).

 Analiza distribucije staničnog ciklusa otkrila je značajno povećan udio NK stanica iz Ythdf2ΔNK miševa u G0/G1 fazi, ali značajno smanjen udio NK stanica iz Ythdf2ΔNK miševa u S fazi (Slika 6 I), što sugerira da nedostatak Ythdf2 rezultira u zaustavljanju G0/G1 faze u NK stanicama.

Osim toga, došlo je do dvostrukog do trostrukog povećanja apoptotskih (aneksin V+Sytox-Blue+/−) NK stanica iz Ythdf2ΔNK miševa u usporedbi s onima iz Ythdf2WT miševa (Slika 6 J), što ukazuje na manjkavo preživljavanje NK stanica nakon gubitka Ythdf2. Ovi rezultati sugeriraju da YTHDF2 regulira odgovor NK stanica na IL-15 in vitro. Budući da se IL-15 slabo prevodi i izlučuje in vivo u stabilnom stanju (Corbel et al., 1996; Fehniger et al., 2001), kako bi se istražilo jesu li NK stanice s nedostatkom Ythdf2-defektne u svom odgovoru na IL-15 in vivo, tretirali smo miševe s IL-15.

Utvrdili smo da su Ythdf2-deficijentne u odnosu na WT NK stanice pokazale značajno smanjenu proliferaciju stanica i povećanu apoptozu stanica kada su miševi bili tretirani s IL-15 (Slika 6 K; i Slika S4, E–J). Ovi podaci sugeriraju da YTHDF2 regulira odgovor NK stanica na IL-15, posebno u nekim uvjetima s visokom razinom IL-15. Također smo otkrili da su razine mRNA i proteina IFN-, granzima B i perforina značajno smanjene u Ythdf2ΔNK NK stanicama u usporedbi s Ythdf2WT NK stanicama kao odgovor na IL-15 (Slika 6, L–N), što ukazuje da YTHDF2 također doprinosi IL-15-posredovanim efektorskim funkcijama NK stanica in vitro.

Zajedno, naši podaci pokazuju da je YTHDF2 neophodan za preživljavanje, proliferaciju i efektorne funkcije posredovane IL-15 NK stanicama. Zatim smo istražili nizvodne mehanizme kojima YTHDF2 regulira preživljavanje, proliferaciju i efektorsku funkciju posredovanih IL-15. Otkrili smo da NK stanice Ythdf2ΔNK miševa i Ythdf2WT miševa imaju slične razine IL-15 receptora CD122 (IL-15R) i CD132 (IL-15R c; Slika S4 K). IL-15 signalizacija je posredovana s najmanje tri nizvodna signalna puta u NK stanicama: Ras–Raf–MEK–ERK, PI3K–AKT–mTOR i JAK1/3–STAT3/5 (Mishra et al., 2014.).

Kako bismo istražili koji signalni put regulira YTHDF2 u NK stanicama, ispitali smo razine fosforilacije ERK, AKT, S6, STAT3 i STAT5 u NK stanicama Ythdf2ΔNK miševa ili Ythdf2WT miševa nakon stimulacije s IL-15.

Rezultati su pokazali da manjak Ythdf2 nije utjecao na fosforilaciju ERK, AKT, S6 i STAT3 nakon stimulacije IL-15 (Slika S4, L i M), ali je značajno inhibirao aktivaciju STAT5, što je dokazano smanjenim razinama fosforilacije STAT5 u Ythdf{{ 7}}nedostatnim NK stanicama nego u NK stanicama miševa Ythdf2WT (Slika 6 O), što ukazuje da je YTHDF2 potreban za optimalno IL-15/STAT5 signaliziranje u aktiviranim NK stanicama.

Budući da smo pokazali da se fosforilirani STAT5 nizvodno od IL-15veže na promotor Ythdf2 (Slika 6, D–F), a ovdje smo pokazali da je YTHDF2 potreban za optimalnu fosforilaciju STAT5, naši podaci sugeriraju STAT5–YTHDF2 petlju pozitivne povratne sprege nizvodno IL-15 koji može kontrolirati preživljavanje, proliferaciju i efektorske funkcije NK stanica.

Analiza cijelog transkriptoma identificira Tardbp kao YTHDF2 cilj u NK stanicama

Kako bismo se pozabavili molekularnim mehanizmom kojim YTHDF2 regulira NK stanice, prvo smo izvršili sekvenciranje RNA (seq) u IL-2-proširenim Ythdf2WT i Ythdf2ΔNK NK stanicama. Brisanje Ythdf2 u NK stanicama rezultiralo je sa 617 različito izraženih gena, uključujući 252 gena s pojačanom regulacijom i 365 gena s nižom regulacijom (Sl. S5 A).

Analiza genske ontologije (GO) pokazala je da su različito eksprimirani geni značajno obogaćeni staničnim ciklusom, staničnom diobom i procesima povezanim s diobom, uključujući mitotičku citokinezu, segregaciju kromosoma, vreteno, nukleosom, središnje tijelo i kromosom (Slika 7. A).

Analiza obogaćivanja skupa gena (GSEA) pokazala je značajno obogaćivanje E2F ciljeva, G2/Mcheckpoint i setova gena obilježja mitotičkog vretena u stanicama Ythdf2ΔNKNK (slika S5 B). Geni povezani sa staničnim ciklusom i staničnom diobom, uključujući Aurka, Aurkb, Cdc20, Cdc25b, Cdc25c, Cdk1, E2f2 i Plk1 (Bertoli et al., 2013.), značajno su smanjeni u NK stanicama miševa Ythdf2ΔNK (Slika 7 B ).

Vretenasti i kromosomski segregacijski geni kao što su Anln, Aspm, Birc5, Bublb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3 i Tpx2 (Gorbsky, 2015.) također su značajno smanjeni u NK stanicama Ythdf2ΔNK miševa u usporedbi s NK stanicama Ythdf2WT miševa (Slika 7 C).

Osim toga, geni za preživljavanje stanica, uključujući Birc5 (Niu i sur., 2010.), Septin4 (Larisch i sur., 2000.) i Rffl (Yanget sur., 2007.), značajno su smanjeni u NK stanicama Ythdf2ΔNK miševa (Sl. 7 D). Geni efektorske funkcije NK stanica, uključujući Klrk1, Ncr1, CD226 i Gzma (Bezman et al., 2012.), također su značajno smanjeni u NK stanicama Ythdf2ΔNK miševa (Slika 7 D).

Ovi podaci podupiru našu karakteriziranu ulogu YTHDF2 u regulaciji proliferacije NK stanica, preživljavanja i efektorskih funkcija. Zatim smo izveli m6A-seq u IL-2-proširenim NK stanicama Ythdf2WT i Ythdf2ΔNK miševa. Analiza glavnih komponenti pokazala je da su tri biološke replike svakog genotipa grupirane zajedno (podaci nisu prikazani), što ukazuje na dobru ponovljivost m6A-seq uzoraka.

Analiza hipergeometrijske optimizacije obogaćivanja motiva (HOMER) identificirala je konsenzusni motiv m6A (GGAC), što ukazuje na uspješno obogaćivanje m6A-modificiranih transkripata (Slika 7 E). Modifikacije m6A uglavnom su bile smještene u transkriptima koji kodiraju proteine, a vrhovi su bili obogaćeni u 59 neprevedenih regija (UTR) i 39UTR, posebno oko početnih i završnih kodona (Sl. 7 F i Sl. S5 C).

Analiza GO obogaćivanja gena s vrhovima m6A otkrila je da je većina m6A-označenih transkripata u NK stanicama obogaćena putovima koji su uključeni u stanični ciklus i staničnu proliferaciju (Sl. S5 D).

For more information:1950477648nn@gmail.com