Sustav glioksalaze u bolestima povezanim sa starenjem: Nutritivna intervencija kao strategija protiv starenja, 1. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Sažetak:Sustav glioksalaze kritičan je za detoksikaciju uznapredovalih krajnjih proizvoda glikacije (AGE). AGE su toksični spojevi koji nastaju neenzimskom modifikacijom biomolekula pomoću šećera ili njihovih metabolita kroz proces koji se naziva glikacija. AGE imaju štetne učinke na mnoga tkiva, igrajući patogenu ulogu u napredovanju molekularnog i staničnog starenja. Zbog opadanja različitih anti-AGE mehanizama povezanog sa starenjem, uključujući mehanizme detoksikacije i proteolitičke kapacitete, glikirane biomolekule se nakupljaju tijekom normalnog starenja u našem tijelu na način ovisan o tkivu. Gledano na ovaj način, anti-AGE sustavi detoksikacije predlažu se kao terapeutski ciljevi za borbu protiv patološke disfunkcije povezane s nakupljanjem AGE-a i citotoksičnošću. Ovdje sažimamo trenutno stanje znanja o zaštitnim mehanizmima protiv glikacijskog stresa, s posebnim naglaskom na sustav glioksalaze kao primarnog mehanizma za detoksikaciju reaktivnih intermedijera glikacije. Ovaj pregled usredotočen je na glioksalazu 1 (GLO1), prvi enzim sustava glioksalaze i enzim koji ograničava brzinu ovog katalitičkog procesa. Iako je GLO1 sveprisutno izražen, razine i aktivnosti proteina regulirane su na način ovisan o tkivu. Pružamo usporednu analizu proteina GLO1 u različitim tkivima. Naša otkrića ukazuju na ulogu sustava glioksalaze u homeostazi u mrežnici oka, visoko oksigeniranom tkivu s brzim prometom proteina. Također opisujemo modulaciju sustava glioksalaze kao terapeutski cilj za odgađanje razvoja bolesti povezanih sa starenjem i sažimamo literaturu koja opisuje trenutno znanje o prehrambenim spojevima sa svojstvima modulacije sustava glioksalaze.

Ključne riječi:glikacijski stres; sustav glioksalaze; starenje; proteotoksičnost

Kliknite ovdje da saznate više

1. Uvod: Glikativni stres i nezdravo starenje

Sve veći broj literature ukazuje na to da je nakupljanje oštećenih proteina specifično obilježje starenja i mnogih bolesti povezanih sa starenjem, uključujući dijabetes tipa 2, rak, neurodegenerativne, kardiovaskularne i poremećaje povezane s očima [1-7]. Aberantni proteini oštećuju staničnu homeostazu stvaranjem nefunkcionalnih i toksičnih nakupina, a to dovodi do inaktivacije ne samo aberantnog proteina, već također može narušiti funkciju drugih esencijalnih proteina zbog stresa na - ili nedostatnosti - strojeva za kontrolu kvalitete proteina u ćeliji. Jedan istaknuti mehanizam koji dovodi do aberantnih molekula je modifikacija krajnjim produktima napredne glikacije (AGE).

Nastaju dikarbonilni spojevi

iz različitih metaboličkih putova (Slika 1) koji uključuju prehrambeni metabolizam šećera i ugljikohidrata u formiranje AGE-a. Ovi dikarbonilni spojevi stupaju u interakciju s biomolekulama, kao što su proteini, lipidi i nukleinske kiseline u neenzimskoj post-translacijskoj modifikaciji koja se naziva glikacija. Glavni glikirajući dikarbonilni agensi su metilglioksal (MG), glioksal ili 3-deoksiglukozon [8]. Ti se dikarbonili održavaju na niskim razinama u homeostatskim uvjetima, ali proces starenja povećava te glikacijske reagense na patološke razine, pojačavajući stvaranje toksičnih AGE-a i, u konačnici, ugrožavajući sposobnost tkiva. S obzirom da stvaranje AGE-a ovisi o koncentraciji glukoze, konzumacija dijete s visokim glikemijskim indeksom ili dijabetičkih stanja dovodi do dramatičnog sustavnog nakupljanja AGE-a. To je u izravnoj korelaciji s promijenjenim metabolizmom, povećanom upalom i napredovanjem teških medicinskih stanja. Suprotno tome, uzimanje dijete s niskim glikemijskim indeksom ograničava nakupljanje AGE-a i povezano je sa sporijim napredovanjem nekih od ovih bolesti [9-13]. U tom kontekstu, hiperglikemija nameće dodatni stres na proizvodnju glikiranih proteina povezanu sa starenjem i pogoršava štetne posljedice naslaga AGE-a na funkciju organa.

Slika 1. Shematski dijagram stvaranja -dikarbonila i putova detoksikacije protiv oštećenja uzrokovanih AGE-om u starenju. Formiranje visoko reaktivnih -dikarbonila kao što je metilglioksal(MG) je putem neenzimske razgradnje glikolitičkih međuprodukata, uključujući dihidroksiaceton fosfat i gliceraldehid 3-fosfat i druge izvore, uključujući metabolizam aminokiselina i lipida. Kako bi se izbjeglo oštećenje AGE-om, sustav glioksalaze je primarni mehanizam koji ograničava sintezu AGE-a, pretvarajući visoko reaktivne biomolekule, kao što je MG, u manje reaktivne biomolekule (D-laktat). Ovaj proces uključuje sekvencijalnu aktivnost dva enzima GLO1 i GLO2 i reducirani oblik glutationa (GSH). Ostali mehanizmi detoksikacije podrazumijevaju aktivnost DJ-1, aldehid dehidrogenaza (ALDH), aldo-keto reduktaza (AKR) i enzima za razgradnju acetoacetata. Jednom kada se formiraju, AGE se mogu očistiti pomoću dva proteolitička puta: sustavom ubikvitin-proteasom (UPS) i autofagijom. Ovi zaštitni mehanizmi (istaknuti zelenom bojom) slabe starenjem i doprinose nastanku bolesti povezanih sa starenjem kao što su neurodegeneracija, bolesti povezane s očima (AMD, katarakta, DR), nefropatije, metabolički sindrom i rak. GLO1: glioksalaza 1; GLO2: glioksalaza 2; GSH: glutation.

Cistanche može spriječiti starenje

Prekomjerni stres glikacije potiče netopivost proteina, deregulaciju signalizacije i putove kontrole kvalitete proteina. Promjene izvedene iz AGE-a u proteomskim perturbirajućim signalnim putovima u fiziologiji tkiva (putevi MAP/ERK, JAK-STAT i PI3K-AKT) koje dovode do nuklearne translokacije faktora transkripcije uključenih u višestruke stanične funkcije, uključujući upalu, apoptozu, ER stres , autofagija, oksidativni stres, funkcija mitohondrija itd. (pregled u [2,14]). Glikirani proteini također mogu preopteretiti ili ograničiti funkcionalnost proteolitičkih kapaciteta. Ove promjene u konačnici doprinose nastanku višestrukih poremećaja povezanih sa starenjem.

Brojne studije pokazale su da je stvaranje MG-a i AGE-a izvedenih iz MG-a važan čimbenik u patogenezi dijabetesa i njegovih komplikacija, kao što su retinopatija, nefropatija i neuropatija [15-19]. Dikarbonilni stres je također posrednik koji pridonosi pretilosti i kardiovaskularnim bolestima [20,21]. MG može doprinijeti aterosklerozi kroz nekoliko mehanizama, uključujući akumulaciju AGE-a izvedenih iz MG-a u aterosklerotskim plakovima [22] i MG-om izazvanu glikaciju lipoproteina niske gustoće [23]. Povezanost između MG i hipertenzije također je primijećena u nekoliko studija, pokazujući povećane razine MG u aorti i bubrežnom tkivu [24,25]. Nekoliko je studija također potvrdilo da je nakupljanje AGE-a povezano s mnogim neurodegenerativnim poremećajima, utječući tako na funkciju mozga, poput Alzheimerove bolesti, Parkinsonove bolesti i shizofrenije [26-28]. Jedan od najboljih primjera odnosa između nakupljanja AGE-a i posljedica povezanih sa starenjem javlja se u očnim tkivima što rezultira poremećajima očnog tkiva izazvanim glikacijom, kao što su katarakta, makularna degeneracija povezana sa starenjem (AMD) i dijabetička retinopatija (DR)[{ {15}}]. Što se tiče katarakte, vodećeg uzroka sljepoće u cijelom svijetu, kristalini leće postaju progresivno žuto-smeđe pigmentirani s godinama kao rezultat nakupljanja nusproizvoda AGE-a [31]. Kao i leća, AGE mrežnice raste s godinama i dijabetesom, osobito u vanjskoj mrežnici. AMD je vodeći uzrok sljepoće kod starijih osoba u razvijenim zemljama. Više razine AGE-a nađene su kod bolesnika s AMD-om u usporedbi s kontrolnim subjektima, kao i kod mišjih modela s AMD-om [32-36]. DR je karakteriziran nakupljanjem AGE-a u retini, izazivajući mikrovaskularno oštećenje [37].mikronizirana pročišćena flavonoidna frakcija 1000 mg koristiTe patološke promjene dovode do nepovratnog oštećenja krvno-retinalne barijere i edema makule, što u konačnici dovodi do gubitka vida. Ukratko, AGE se nakupljaju u cijelom tijelu tijekom starenja, osobito kod dijabetičara. To ugrožava homeostazu organizma i doprinosi nastanku i napredovanju mnoštva bolesti povezanih sa starenjem.

Postoji više sustava za detoksikaciju AGE-a. To uključuje sustav glioksalaze, najbolje okarakterizirani mehanizam za inhibiciju stvaranja AGE-a i jedan od putova koji mogu detoksificirati intermedijere glikacije. Međutim, kapaciteti protiv AGE-a opadaju s godinama što dovodi do ubrzanog nakupljanja AGE-a u 'normalnim starijim tkivima'. Iako postoje različiti obrambeni mehanizmi za ograničavanje nakupljanja AGE-a u tkivima, njihovo razvijanje radi sprječavanja nakupljanja AGE-a i povezanih patologija još uvijek se ne iskorištava [38]. U sljedećem odjeljku sažimamo trenutačnu literaturu o mehanizmima detoksikacije s fokusom na sustav glioksalaze kako bi se smanjilo nakupljanje ovih toksičnih nusproizvoda u stanicama i tkivima. Na kraju, raspravljamo o korisnosti prehrambenih intervencija za jačanje sustava glioksalaze kao strategije protiv starenja.

2. Mehanizmi detoksikacije protiv glikativnog stresa: glavna uloga sustava glioksalaze

Zabilježeno je više mehanizama detoksikacije protiv nakupljanja AGE-a. Slika 1 je shematski pregled stvaranja -dikarbonila i različitih putova detoksikacije protiv oštećenja uzrokovanih AGE-ima u starenju. Glavni putovi sinteze AGE-a uključuju reakciju reaktivnih dikarbonila izvedenih uglavnom iz metabolizma glukoze s primarnim aminima (N-terminalni ili bočni lanac lizina) ili gvanidinskom skupinom bočnog lanca arginina [39]. Formiranje visoko reaktivnih -dikarbonila, kao što je MG, dolazi kroz metabolizam glikolitičkih međuprodukata, kao što su dihidroksiaceton fosfat i gliceraldehid 3-fosfat, i drugih izvora, uključujući metabolizam aminokiselina i lipida.

AGE-i su ireverzibilni i, kada se jednom formiraju, mogu se eliminirati samo proteolitičkim putovima [5,9,40,41]. Predlaže se da dva glavna proteolitička kapaciteta doprinose uklanjanju AGE-a: ubikvitin-proteasomski sustav (UPS) i autofagni lizosomski proteolitički sustav (ALPS) [5,9,40,41] (Slika 1). UPS uglavnom radi na topivim pogrešno savijenim proteinima. U UPS-u, supstrati su prepoznati i označeni ubikvitinom i usmjereni na proteasom za razgradnju. ALPS se sastoji od usmjeravanja tereta u lizosomski odjeljak za razgradnju. Autofagijski teret može biti raznolik, uključujući netopljive proteine, proteinske agregate, pa čak i cijele organele. Oba proteolitička puta su funkcionalno kooperativna i sve veća literatura podupire preslušavanje između dvaju putova s ​​recipročnim izravnim i neizravnim interakcijama[42-46]. Ovaj preslušavanje jamči rezervni mehanizam i, u slučaju nedostatka jednog od putova, drugi proteolitički put nastoji kompenzirati kako bi održao pravilan i funkcionalan proteom [47].

Promjene u stopama razgradnje proteina povezane sa starenjem dokumentirane su za mnoga tkiva prije više od 3 desetljeća, čak i prije nego što je definirana molekularna karakterizacija proteolitičkih putova [48]. Danas se molekularni i stanični pad dva glavna proteolitička puta s godinama bolje razumije i postoje razlike u stupnjevima smanjenja između UPS i lizosomalnih sustava. Mnoga su izvješća pokazala pad UPS-a ovisan o tkivu, dok se čini da je autofagijski pad univerzalan (pregled u [49-51). Što se tiče autofagije, i lizosomski i autofagosomski odjeljci prolaze kroz upečatljive modifikacije. Promjene koje pridonose neispravnom funkcioniranju autofagije uključuju smanjenje stabilnosti lizosoma, aktivnost hidrolaze, nakupljanje neprobavljivog materijala (lipofuscina) u lumenu lizosoma, disfunkcionalni lizosomalni pH, smanjenu razinu transkripcije proteina povezanih s autofagijom, smanjenu stabilnost šaperona posredovanog autofagijski receptor LAMP2A u lizosomskoj membrani i smanjeno povezivanje motoričkih proteina u autofagijskim odjeljcima ([49,51,52]). Za razliku od autofagije, sada se prihvaća da su promjene u proteolitičkim sposobnostima proteasoma s godinama više kvalitativne nego kvantitativne.oteflavonoidPromjene u sastavu katalitičkih aktivnosti proteasomske jezgre i modulatornih podjedinica, smanjena ekspresija proteasoma, kao i promjene u oksidacijskom stanju podjedinica proteasoma i supstrata proteasoma, doprinose inhibiciji UPS kapaciteta povezanoj sa starenjem (pregled u [53] ,54). U nekim slučajevima može postojati samo nedovoljan kapacitet proteolitičkih sustava za podnošenje opterećenja. Nažalost, učinkovitost ova dva mehanizma opada s godinama, što rezultira nedovoljnom sposobnošću prepoznavanja i uklanjanja oštećenih proteina i, stoga, intracelularnim nakupljanjem proteinskih agregata i disfunkcionalnih organela [55,56]. Neto razine AGE-a određene su ravnotežom brzine sinteze ili stvaranja i brzine uklanjanja. Neposredna posljedica opadanja proteolitičkog kapaciteta je nakupljanje dugovječnih proteina u ostarjelim organizmima, od kojih mnogi nakupljaju oštećenja nastala glikacijom u svojim aminokiselinskim sekvencama. Akumulacija AGE-a događa se na način vezan uz dob ([4,9]), a nedavna analiza proteoma u istraživanju starenja otkrila je da biologija AGE-a sadrži obogaćeni metabolički put povezan s proteomima povezanim sa starenjem [57].

Iako UPS i ALPS opadaju s godinama, postoje različiti zaštitni putevi koji mogu smanjiti sintezu AGE-a. U ovom pregledu fokusiramo se na ove zaštitne mehanizme koji ograničavaju biogenezu AGE-a, s posebnim naglaskom na sustav glioksalaze, primarni put za detoksikaciju reaktivnih dikarbonila [58]. U ovom dijelu ćemo detaljno opisati sustav glioksalaze. Također ukratko opisujemo druge mehanizme u detoksikaciji AGE-a: protein DJ-1 povezan s Parkinsonom, aldehid dehidrogenaze (ALDH), aldo-keto reduktaze (AKR) i razgradnju acetoacetata.

2.1. Sustav glioksalaze: glavni put detoksikacije za reakcijske dikarbonile

Ogromna literatura podržava sustav glioksalaze kao glavni put detoksikacije za reaktivne dikarbonile u citosolu svih stanica sisavaca [58]. Sustav glioksalaze je najbolje okarakteriziran put za metabolizam MG. Geni za glioksalazu su evolucijski očuvani i široko rasprostranjeni u različitim živim sustavima, kao što su ljudi, biljke, kvasci, bakterije, gljive i protisti. Prisutnost u mnogim različitim taksonima ukazuje na veliku važnost enzima glioksalaze u fiziološkoj funkciji biološkog života. Kombinirane aktivnosti glioksalaza 1 i 2 (GLO1, GLO2) kataliziraju pretvorbu reaktivnih, acikličkih -oksoaldehida u odgovarajuće -hidroksi kiseline [58]. Ove reakcije također zahtijevaju katalitički GSH. U početnom koraku GLO1 pretvara svoj supstrat, hemitioacetal, nastao spontanom reakcijom aldehida dikarbonila MG i GSH, u SD-laktoilglu tron. Zatim, GLO2 hidrolizira SD-laktoilglu tation u D-laktat i reformira GSH (Slika 1).puritanski vitamin cAktivnost GLO1 izravno je proporcionalna koncentraciji GSH. Aktivnost GLO1 se smanjuje kada se GSH ukloni, kao što je nakon oksidativnog stresa kada se GSH pretvara u GSSG [59].

MG nastaje tijekom glikolize i glukoneogeneze razgradnjom dihidroksiacetonfosfata i gliceraldehid 3-fosfata, kao i katabolizmom treonina, oksidacijom ketonskih tijela i razgradnjom glikiranih proteina. Drugi supstrati, uključujući glioksal, fenilglioksal i hidroksipiru aldehid, također se metaboliziraju ovim putem [60]. GLO1, enzim koji ograničava brzinu u sustavu glioksalaze, katalizira primarni korak detoksikacije [61], stoga je promjena proteina GLO1 uključena u mnoge patološke procese starenja, poput dijabetesa, neurodegenerativnih bolesti, raka i očnih bolesti. bolesti [20.

Regulacija ekspresije i aktivnosti GLO1 je složena i još uvijek nije dobro shvaćena (Slika 2). Sekvenca promotora GLO1 sadrži element odgovora na metal (MRE), element odgovora na inzulin (IRE), ranu izoformu 2-faktora gena (E2F) i aktivirajući pojačivač-vezujući protein 2 (AP{{10) }} ) i element antioksidativnog odgovora (ARE). Funkcija IRE i MRE potvrđena je u reporter testovima gdje je tretman inzulinom i cinkovim kloridom proizveo povećan transkripcijski odgovor 62]. Slične funkcionalne aktivnosti primijećene su za E2F i AP-2 [63,64]. ARE koji se nalazi u eksonu 1 Glo1 služi za spajanje Glo1 s transkripcijskim sustavom koji reagira na stres nuklearnim eritroidnim 2-srodnim faktorom 2 (NRF2) [65]. Nekoliko gena povezanih s metabolizmom MG i zaštitom od oksidativnog stresa pod kontrolom su NRF2-ARE puta [66]. NRF2 je u kompleksu s KEAP1, supstratnim adapterskim proteinom za kulin-3-ovisan E2 ubikvitin ligazni kompleks, usmjeravajući NRF2 na razgradnju pomoću 26S proteasoma u fiziološkim uvjetima. Oksidativni stres dovodi do destabilizacije ovog kompleksa, uzrokujući translokaciju NRF2 u jezgru i pokrećući regulaciju antioksidativnih gena [67,68]. Vezanje NRF2 na Glo1-ARE povećava bazalnu i inducibilnu ekspresiju GLO1.[65]. NRF2 i antioksidativni odgovori također su pojačani kada MG uzrokuje dimerizaciju KEAP-a oslobađajući Nrf2 [69].

Nekoliko studija pokazuje da NRF2 povećava aktivnost GLO1 i ublažava unutarstanični MG stres; stoga je modulacija GLO1 pomoću NRF2 agonista rezultirala smanjenjem MG-a i proteinskih adukata izvedenih iz MG-a u stanicama i tkivima [70-73]. Štoviše, Glol mRNA i protein u jetri, mozgu, srcu, bubrezima i plućima smanjeni su kod miševa s nokautom NRF2 [65]. Sve u svemu, ova izvješća sugeriraju da je GLO1 nizvodna meta kojom put NRF2/KEAP1 obavlja svoje zaštitne funkcije smanjujući MG i dikarbonil stres. Međutim, upalna aktivacija NF-kB (nuklearni faktor kB) s NRF2 smanjuje ekspresiju Glola [74]. Ekspresiju sjaja također negativno regulira HIFl (hipoksija-inducibilni faktor 1) u hipoksičnim uvjetima, važan fiziološki pokretač dikarbonilnog stresa [75].

Uz transkripcijsku regulaciju postoji i posttranslacijska regulacija GLO1 proteina (Slika 2). GLO1 acetilira citosolni sirtuin-2[76,77], a njegova se ekspresija može smanjiti aktivacijom RAGE (receptora za uznapredovale krajnje produkte glikacije); međutim, ti mehanizmi nisu jasno shvaćeni [78].sistancheNedavna studija pokazala je da se protein GLO1 može modificirati fosforilacijom treonina 107 (T107) i nitrozilacijom cisteina 139 [79]. U ovoj studiji, fosforilacija T107 pomoću kinaze II delta ovisne o kalmodulinu u proteinu GLO1 navedena je kao precizan mehanizam koji regulira sustav glioksalaze. Konkretno, fosforilacija GLO1 na T107 utječe na kinetičku učinkovitost detoksikacije MG-a i stopu proteasomalne razgradnje. Stoga je njegovo promijenjeno stanje povezano s razvojem bolesti povezanih sa starenjem [79].

Slika 2. Mehanizmi regulacije glioksalaze 1(GLO1). Aktivnost GLO1 može se regulirati kroz više mehanizama, uključujući regulaciju transkripcije i posttranslacijske modifikacije. Promotor Glo1 sadrži različite regulatorne elemente, kao što su antioksidativni odgovor (ARE), elementi odgovora na metal (MRE) i inzulinski odgovor (IRE), te vezna mjesta za AP-2 i E2F. U normalnim uvjetima, eritroidni 2-faktor 2 (NRF2) povezan s nuklearnim faktorom u kompleksu je s KEAP1, supstratnim adaptorskim proteinom za kulin-3-ovisan E2 kompleks ubikvitin ligaze, usmjeravajući NRF2 na razgradnju sustavom ubikvitin-proteasom (UPS). Oksidativni stres dovodi do destabilizacije kompleksa NRF2-KEAP1, uzrokujući odvajanje NRF2 koji se translocira u jezgru što pokreće regulaciju različitih antioksidativnih gena. Vezanje NRF2 na Glo1-ARE povećava ekspresiju GLO1. U uvjetima hipoksije, ekspresija sjaja obrnuto je regulirana hipoksijom inducibilnim faktorom 1 (HIFlx). Različite posttranslacijske modifikacije u citosolu mogu utjecati na stabilnost GLO1.

2.2. Alternativni mehanizmi detoksikacije kao navodni rezervni sustavi za nadoknadu nedostatka aktivnosti glioksalaze

Iako je primarni mehanizam za detoksikaciju reaktivnih dikarbonila u sustavu glioksalaze, postoje alternativni putovi s kapacitetom detoksikacije dikarbonila nastalih tijekom metabolizma šećera. To uključuje ALDH, AKR, protein DJ-1 povezan s Parkinsonovom bolešću i uklanjanje pomoću acetoacetata u 3-hidroksi heksan-2,5-dion (3-HHD )[80]. Fiziološka važnost ovih sustava ostaje nejasna i postavlja se pitanje jesu li ti enzimi ključni za detoksikaciju AGE-a u tkivima zbog visoke aktivnosti sustava glioksalaze. Čini se da su komponente rezervnih sustava koji rade u odsutnosti aktivnosti glioksalaze, iako se uloga ovih putova ovisna o tkivu ne može odbaciti.

DJ-1, također poznat kao protein 7 Parkinsonove bolesti (PARK7), igra ključnu ulogu u Parkinsonovoj bolesti (PD). Pokazalo se da nedostatak funkcionalnog proteina DJ-1 uzrokuje autosomno recesivnu PD [81,82]. Prijavljeno je da DJ-1 ima dvije različite aktivnosti: (1) aktivnost glioksalaze in vitro, pretvarajući MG u laktat i sprječavajući oštećenje tkiva izazvano MG-om u Caenorhabditis elegans [83], i (2) aktivnost deglikaze in vitro, smanjujući nusprodukti MG u ranoj fazi [84]. Nedavno su druge studije također pokazale da DJ-1 igra relevantnu ulogu u DNK deglikazi [85-87].što je cistancheSposobnost detoksikacije DJ-1 u nedostatku glutationa (GSH) čini ovo alternativnim putem za sustav glioksalaze, koji zahtijeva prisutnost GSH. Međutim, Pfaff i suradnici koristeći oba DJ-1 nokdauna u stanicama Drosophile i DJ-1 nokaut u cijelom organizmu nisu primijetili razlike u nakupljanju adukata MG proteina [88].

AKR su superfamilija proteina koji mogu reducirati aldehide i ketone u primarne i sekundarne alkohole. AKR metaboliziraju MG u hidroksi aceton ili laktaldehid. Neke su studije pokazale da transgena ekspresija i ljudske i mišje Aldo-keto reduktaze u stanicama fibroblasta glodavaca štiti od oštećenja izazvanih MG-om, sugerirajući da AKR mogu sudjelovati u detoksikaciji MG-a i smanjenju razina AGE-a [89-91]. Visoka aktivnost AKR1B3 otkrivena je u Glo1 knockout mišjim Schwannovim stanicama, kao i povećana ekspresija tijekom izlaganja MG-u, što sugerira da bi to mogao biti kompenzacijski mehanizam izazvan nedostatkom sustava glioksalaze ili prekomjernim glikacijskim stresom [92]. Zanimljivo je da je nedostatak AKR1B3 rezultirao višim razinama MG i AGE u srcima dijabetičkih miševa [91].

LED diode su druga skupina enzima koji metaboliziraju -dikarbonil koji oksidiraju MG u piruvat. Ekspresija ALDH bila je povećana u mišjim Schwannovim stanicama divljeg tipa nakon tretmana MG-om [92]. U modelu zebrice, glo1 knockout riba pokazala je da inducirana aktivnost ALDH kompenzira nedostatak GLO1 [93]. Međutim, barem kod miševa, kompenzacijski mehanizmi ovise o tkivu, budući da je povećana ekspresija AKR i ALDH primijećena u tkivu jetre, ali samo AKR su prijavljeni u bubrezima kod Glo1 nokaut miševa [94]. U studijama na ljudima, metabolit 3-DG koji proizvodi aktivnost aldehid dehidrogenaze 1A1 (ALDH1A1) bio je povećan u plazmi i eritrocitima dijabetičara [92]. Nedavno je također pokazano da acetoacetat ketonskih tijela smanjuje koncentraciju MG neenzimskom reakcijom tijekom dijabetičke i dijetalne ketoze [95,96]. Otkrili su da ovaj metabolički put uključuje neenzimsku aldolnu reakciju između MG-a i acetoacetata ketonskog tijela, što dovodi do 3-hidroksi heksana-2,5-diona, koji je prisutan u krvi pacijenata koji su gladovali inzulina. Alternativni putovi koji bi mogli kompenzirati nedostatak sustava glioksalaze mogli bi potencijalno generirati toksične molekule kao što su y-diketoni, koji su povezani s perifernom degeneracijom aksona i ozljedom testisa [97,98].

Iako ne postoji sustavna analiza starenja proteina uključenih u GLO1-neovisne alternativne puteve, prijavljene su promjene vezane uz starenje tih molekularnih igrača. Na primjer, postoji korelacija između razina ekspresije D]-1 i oksidativnog stresa, a različita su izvješća pokazala porast DJ-1 s godinama. Razine DJ-1 mRNA i proteina porasle su od 8 do 20 tjedana starosti kod miševa [99], a razine DJ-1 značajno su porasle kao funkcija dobi u ljudskoj cerebrospinalnoj tekućini [100]. U tkivima oka pokazalo se da se DJ-1 eksprimira u pigmentnom epitelu retine i fotoreceptorima, a ekspresija se povećava u starim očima [101]. To bi moglo odražavati kompenzacijski mehanizam zbog pada aktivnosti sustava glioksalaze.

2.3. O tkivu ovisna aktivnost sustava glioksalaze

Iako je GLO1 sveprisutni protein, razine ovog enzima regulirane su na način ovisan o tkivu. Kako bismo procijenili ulogu sustava glioksalaze u različitim tkivima, ispitali smo ekspresiju i aktivnost GLO1 u neokularnim (jetra, mozak, srce i bubrezi) i očnim tkivima (mrežnica, RPE/žilnica i leća) od divlji tip C57BL/6] miševa. Korištenjem antitijela koja specifično prepoznaju GLO1, Western blotting i imunohistokemija su provedeni da se kvantificiraju razine proteina. Aktivnost GLO1 u citosolnim ekstraktima određena je spektrofotometrijski kao početna brzina stvaranja SD-laktoilglutationa, kao što je ranije objavljeno [30,102]. Ovi rezultati su sažeti na slici 3.

Slika 3. Usporedna analiza GLO1 proteina i aktivnosti u očnim i neočnim tkivima. (A) Aktivnost GLO1 ispitana je u neokularnim tkivima i tkivima mrežnice WT miševa kao što je prethodno opisano [29], a aktivnost je izražena kao postotak (postotak) u usporedbi s jetrom. (B) Reprezentativna Western blot analiza jetre i (C) mrežnice transgenih miševa WT i Glow prekomjerne ekspresije (Glo1 Tg plus / plus ) korištenjem monoklonskog antitijela (nekomercijalno) i poliklonskog antitijela za Glol (komercijalno, GeneTex)[36,103,104]. (D) Reprezentativna Western blot analiza ekstrakata neokularnog tkiva (50 ug) WT miševa upotrebom monoklonskog antitijela za Glo1 (nekomercijalno) i (E) kvantifikaciju proteina GLO1 normaliziranog za kontrolu opterećenja (ponceau bojanje). (F) Aktivnost GLO1 izvedena je u očnim tkivima (mrežnica, RPE/koroideja i leća) kod WT miševa kao što je prethodno opisano [29], a aktivnost je izražena kao milijedinice po miligramu proteina. Vrijednosti su srednje ± SEM. Veličina uzorka je n=4iz GLO1 testova proteina i aktivnosti.

Prethodno objavljeni podaci pokazuju da mrežnica i jetra pokazuju najveću aktivnost GLO1 ([30]; Slika 3A). Imajte na umu da je aktivnost mrežnice bila najveća vrijednost dok su jetra, bubrezi, mozak i srce predstavljali samo 46 posto, 27 posto, 22 posto odnosno 11 posto detoksikacijskog kapaciteta mrežnice. Procijenili smo je li aktivnost GLO1 u korelaciji s razinom enzima procjenom razine GLO1 proteina Western blotom. Antitijelo protiv GLO1 prethodno je potvrđeno u prethodnim izvješćima i korišteno za analizu GLO1 u uzorcima retine [36,103,104]. Kao pozitivna kontrola, također je provedena komparativna analiza u retini i jetrenom tkivu transgenih miševa koji prekomjerno izražavaju GLO1 na pozadini C57BL/6J (B6) [105]. Kako bismo ispitali razine GLO1, koristili smo dva različita antitijela: poliklonsko zečje antitijelo (komercijalno antitijelo iz GeneTex-a) i monoklonsko mišje antitijelo (nekomercijalno antitijelo) prijavljeno u različitim životinjskim modelima za proučavanje biologije GLO1 [103,106]. Uspjeli smo detektirati protein GLO1 u tkivima divljeg tipa jetre i mrežnice pomoću Western blottinga, a najveću ekspresiju pronašli smo u transgenih miševa u oba tkiva (Slika 3B, C i Dodatna slika S1). Dvije trake su prepoznate za oba antitijela. Diferencijalni elektroforetski profili ovih GLO1-pozitivnih sugeriraju da bi posttranskripcijske promjene mogle biti vitalne u ulozi proteina. Sukladno tome, nedavna studija pokazala je da je fosforilirani GLO1 učinkovitiji i stabilniji, podupirući te posttranskripcijske promjene kao precizan mehanizam koji regulira aktivnost GLO1 [79]. Međutim, malo je informacija o tome kako posttranskripcijske modifikacije moduliraju aktivnost glioksalaze 1.

As expected, we found GLO1 protein in all non-ocular tissues analyzed, with the liver showing the highest expression. The relative order of GLO1 expression was liver>kidney>brain>srce (Slika 3D, E). Ovo potvrđuje rezultate prethodne studije[30]. Postoje ograničeni podaci o ulozi GLO1 u očnim tkivima. Kao što smo ranije izvijestili, enzimska analiza otkrila je da je aktivnost GLO1 oko 10 puta veća u retini u usporedbi s lećom ili RPE/žilnicom (Slika 3F, [30]). Prekomjerna ekspresija glioksalaze I poboljšava preživljavanje retinalnog pericita u ljudi u uvjetima hiperglikemije [107], a pokazalo se da blokator angiotenzinskih receptora koji obnavlja GLO1 u dijabetičkih štakora smanjuje retinalne acelularne kapilare [18]. Dodatno, nedostatak GLO1 kod zebrica utječe na strukturu žila mrežnice odrasle osobe, iako se povećano stvaranje angiogene klice opaža samo kod zebrica koje su prekomjerno hranjene glo1-, ali ne i kod normalnog hranjenja [93].

Mrežnica je vrlo složeno, vrlo dinamično tkivo s različitim vrstama stanica (Slika 4A). Prokrvljenost, te posljedična izloženost ksenobioticima i drugim stresorima, među najvišima su u tijelu. Svakog jutra 10 posto vanjskih vrhova fotoreceptora mrežnice otpada i moraju ih ukloniti susjedne pigmentirane epitelne stanice mrežnice. Proveli smo imunohistokemijsku analizu kako bismo po prvi put karakterizirali prostorne razlike GLO1 u retini. Protein GLO1 bio je prisutan u svim tipovima stanica unutar retine, s visokim razinama unutar staničnih tijela unutarnjeg nuklearnog sloja i umivaonika ganglijskih stanica. Tijela fotoreceptorskih stanica u vanjskom sloju jezgre imala su niže razine. U fotoreceptorima, većina GLO1 proteina pronađena je unutar unutarnjeg i vanjskog segmenta. RPE je također imao visoke razine proteina GLO1, dok su žilnica i bjeloočnica imale nižu količinu proteina GLO1 (Slika 4B, C).

Slika 4. Imunohistokemija GLO1 u tkivima mišje retine. (A) Poprečni presjek stanične sheme mrežnice koji prikazuje njezina tri primarna sloja koja se sastoje od sloja ganglijskih stanica (GCL), koji sadrže ganglijske stanice mrežnice (RGC), unutarnji nuklearni sloj (INL), u kojem se nalaze interneuroni amakrini, bipolarni i horizontalni stanice, kao i Müllerove glijalne stanice, i vanjski nuklearni sloj (ONL), koji sadrži štapićaste i čunjićne fotoreceptore. Osjetno tkivo ili neuroretina povezano je s pigmentiranim epitelom retine (RPE). Crvene strelice označavale su RPE sloj. (B) Reprezentativna slika GLO1 imunološkog bojenja u retinalnim uzorcima WT miševa. (C) Srednji intenzitet fluorescencije GLO1 normaliziran na vrijednost u RPE. Prikazani podaci su srednja vrijednost ± standardne pogreške srednjih vrijednosti (SEM). Naši rezultati u retini su relevantni jer je retina visoko diferencirano postmitotsko tkivo, gdje se oštećenja nastala glikacijom ne mogu smanjiti staničnom diobom [5,9]. Nadalje, promjene u GLO1 povezane su s oštećenjem retine [108]. Sličan scenarij mogao bi se dogoditi u drugim tkivima sastavljenim od stanica s niskim kapacitetom regeneracije, kao što je središnji živčani sustav, gdje je velika većina neurona postmitotička. Procjena razina GLO1 zajedno s markerima specifičnim za stanicu mogla bi nam omogućiti da procijenimo varijaciju stanica do stanice unutar određenog tkiva. Naši rezultati sugeriraju da bi visoka razina retinalnog GLO1 proteina i aktivnosti mogla igrati važnu zaštitnu ulogu protiv oštećenja uzrokovanih AGE-om s godinama.

Ovaj je članak izvađen iz Cells 2021, 10, 1852. https://doi.org/10.3390/cells10081852 https://www.mdpi.com/journal/cells