Trenutni status neuroprotekcije kod prirođenih srčanih mana, 3. dio

3.2. Polu-kvantitativna procjena ektopične mitohondrijske DNA

Slike bojenja Hsp60 (matrica mitohondrija) i bojenja histon-H2B (nuklearni marker) oduzete su od slika bojenja dsDNA. Zatim su pomoću funkcije "AdjustThreshold" softvera lmage] (National Institutes of Health) slike binarizirane.

Mitohondriji su tvornice energije u stanicama, odgovorne za sintezu ATP-a za osiguravanje energije potrebne stanicama. Mitohondrijski matriks je unutarnja tekućina mitohondrija, koja sadrži niz enzima i iona te je ključno mjesto za razne biokemijske reakcije mitohondrija. Pamćenje je jedna od najvažnijih kognitivnih sposobnosti ljudskih bića. Iako se to dvoje može činiti nepovezanim, usko su povezani.

Istraživanja pokazuju interakciju između mitohondrijskog matriksa i pamćenja. Enzimi i ioni u mitohondrijskom matriksu mogu izravno utjecati na ekscitabilnost neurona reguliranjem metabolizma energije i statusa ionskih kanala u neuronskim stanicama, čime utječu na pamćenje. Osim toga, postoji niz signalnih molekula u mitohondrijskom matriksu, koje se mogu prenijeti nizvodno do neurona kroz aksone i sinapse neurona, utječući na učinkovitost transdukcije signala neurona, utječući tako na formiranje i konsolidaciju pamćenja.

Istodobno, aktivnost pamćenja također izravno utječe na stanje matriksa mitohondrija. Aktivnosti pamćenja povećat će potrošnju energije neurona i pospješiti redoks reakciju u matrici mitohondrija, čime će utjecati na metaboličku razinu mitohondrija i unutarstaničnu ionsku ravnotežu, dodatno utječući na ekscitabilnost i učinkovitost transdukcije signala neurona.

Stoga je održavanje dobrog zdravlja mitohondrija presudno za održavanje dobre funkcije pamćenja. Održavanjem dobrih životnih navika, poput redovite prehrane, umjerene tjelovježbe, odgovarajućeg sna itd., možete pomoći u održavanju zdravlja mitohondrijske matrice. Osim toga, funkcija pamćenja također se može poboljšati odgovarajućom farmaceutskom intervencijom za promicanje biokemijskih reakcija i signalizacije unutar mitohondrijske matrice.

U svakodnevnom životu možemo vježbati pamćenje na mnoge načine, kao što su čitanje, učenje, razmišljanje, igre itd. U isto vrijeme, također bismo trebali obratiti pozornost na održavanje dobrog zdravlja kako bismo bolje održali zdravlje mitohondrijske matrice. Vjerujem da ćemo ovim naporima sigurno bolje pamtiti i bolje se nositi s raznim izazovima u životu i radu. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje, jer Cistanche deserticola također može regulirati ravnotežu neurotransmitera, poput povećanja razine acetilkolina i faktora rasta. Te su tvari vrlo važne za pamćenje i učenje. Osim toga, Cistanche deserticola također može poboljšati protok krvi i pospješiti opskrbu kisikom, što može osigurati da mozak dobije dovoljno hranjivih tvari i energije, čime se poboljšava vitalnost i izdržljivost mozga.

Kliknite znajte dodatke za jačanje pamćenja

Odabrali smo dsDNA točke veličine od 2 do 20 um' (kružnost 0.1-1.0) pomoću funkcije "Analiza-analiziraj čestice". ako je bilo potrebno, originalne slike su ispitane za konačni broj. Kad bi signal histona H2B bio mali. tada su oduzete slike pokazivale strukture poput krafni.

One predstavljaju citosolnu dsDNA nuklearnog podrijetla i treba ih eliminirati iz količine citosolne dsDNA mitohondrijskog podrijetla. Raspon veličine može se modificirati prema vrsti stanice ili podrijetlu histoloških uzoraka. Slika lE prikazuje primjer brojanja ektopične mitohondrijske DNA

točke pomoću 1B D.

Alternativno, slike Hsp60 bojenja su oduzete od slika dsDNA bojenja. Zatim je broj točaka dsDNA izbrojan korištenjem funkcija "Podešavanje praga "Analiza-Analiza čestica". Nakon toga su točke dsDNA bez signala histon-H2B izbrojane izravnim promatranjem. Posljednja metoda je prikladna kada slike histona-H2B pokazuju nizak omjer signala i šuma.

Sve u svemu, ova metoda može jasno pokazati ektopičnu mitohondrijsku DNA koja curi u citoplazmu i omogućuje objektivnu i statističku procjenu takve ektopične mitohondrijske DNA u stanicama.

4. Rasprava

U našem istraživanju razvili smo metodu koja omogućuje brojanje citoplazmatske mitohondrijske DNA. Zabilježeno je otkrivanje citoplazmatske mitohondrijske DNA korištenjem tehnika imunofluorescencije, ali metode u većini slučajeva nisu bile kvantitativne za procjenu citoplazmatske mitohondrijske DNA [15,25]. U drugoj studiji, PCR kapljicama je proveden kako bi se kvantificirala cirkulirajuća mitohondrijska DNA [9].

nedavno, Sato et al. [26,27] objavili su izvrstan protokol za procjenu citoplazmatske DNA imunofluorescentnomikroskopijom koristeći antitijela Lamin B1 (LMNB1) kao marker nuklearne strukture i podjedinicu 4 citokrom c oksidaze (COX4) kao marker mitohondrijske strukture. Ovaj se protokol čini vrlo korisnim za kvantificiranje citoplazmatske dsDNA nuklearnog podrijetla.

Međutim, kada smo isprobali COX4 ili druge markere mitohondrijske membrane, uključujući i unutarnje i vanjske markere, bilo je vrlo teško precizno razlikovati citoplazmu od mitohondrija.

Na primjer, ako smo promatrali kružne signale pomoću markera mitohondrijske membrane i promatrali signale dsDNA unutar, tada bi ta dsDNA mogla predstavljati ili mitohondrijsku DNA unutar kružnih mitohondrija (normalno) ili citoplazmatsku mitohondrijsku DNA izvan mitohondrija poput krafne (ektopična). Stoga smo upotrijebili Hsp60 kao marker za označavanje njihove mitohondrijske matrice za procjenu ektopične mitohondrijske DNA u citoplazmi.

Kao što je opisano u nedavnom pregledu [23], postoji mnogo različitih vrsta citoplazmatske DNA nuklearnog podrijetla, a većina njih je pozitivna na histonske markere. Zbog ograničenja kombinacije antitijela koja se koriste za trostruko bojenje, koristili smo histon H2Bas kao histonski marker.

Međutim, ako se ovo ograničenje riješi, H2AX bi mogao biti bolji marker za citoplazmatsku dsDNA nuklearnog podrijetla. Histon-H2B-negativna citoplazmatska dsDNA rijetko je opažena u kontrolnim HeLa stanicama korištenim u ovoj studiji, ali takva dsDNA nuklearnog porijekla može biti prisutna ako se koriste druge stanične linije ili uvjeti.

In situ hibridizacija mitohondrijske DNA korištena u našem nedavnom radu prikladna je za kvalitativnu procjenu, ali bi moglo biti teško koristiti in situ hibridizaciju za kvantitativnu procjenu [8].

Hibridizacija in situ izlaže uzorak visokim temperaturama, što može rezultirati deformacijom ili šumom nekih dijelova uzorka. S druge strane, imunocitokemijska metoda predstavljena u ovom radu može dobiti signale s niskim pozadinskim šumom. U našem nedavnom radu, u ljudskim stanicama i zebricama korištenim kao modeli Parkinsonove bolesti, pokazali smo da je mitohondrijska DNK iscurila u citoplazmu, što je toksično za Stanice. Također smo primijetili da je količina citosolne mitohondrijske DNA povećana u postmortalnom tkivu mozga pacijenata s Parkinsonovom bolešću [8].

Ove linije dokaza sugeriraju da povećana količina ektopične mitohondrijske DNK koja iscuri iz mitohondrija može izazvati akutnu i kroničnu upalu koja rezultira raznim bolestima, uključujući Parkinsonovu bolest i zatajenje srca; stoga bi pojačana regulacija razgradnje citosolne DNA ili inhibicija njezinih senzora mogla biti potencijalni terapeutski cilj za ove bolesti [8,28].

Metoda predstavljena u ovom radu za kvantitativnu procjenu ektopične mitohondrijske DNA služi kao važan alat za daljnja istraživanja u ovom području.

Doprinosi autora: HM i MTH formulirali su hipoteze, dizajnirali većinu eksperimenata, izveli eksperimente, analizirali podatke i napisali rukopis. NM je izvodio pokuse vezane uz uzgoj stanica. Svi su autori pročitali i složili se s objavljenom verzijom rukopisa.

Financiranje: Ovaj rad su podržali grantovi AMED-a (brojevi grantova JP21gm6110028 i JP19dm0107154 (HM)), Takeda Science Foundation (HM), JSPS KAKENHI (brojevi grantova JP14516799 (HM), JP 16690735 (HM) i JP 17925674 (HM) ), JST (Moonshot R&D; broj granta JPMJMS2024 (HM)) i Grants-in-Aid od TBRF-a (broj granta TBRF-RF 21-135 (HM)).

Izjava o dostupnosti podataka: Podaci i alati opisani u ovom rukopisu dostupni su na zahtjev.

Zahvale: Odajemo priznanje Shinanu Kobayashiju za sudjelovanje u korisnim raspravama i pružanje stalne podrške. Zahvaljujemo Tokijskoj zakladi za biokemijska istraživanja (TBRF) na pružanju TBRF postdoktorske stipendije za strane istraživače u MH (TBRF-RF 21-135).

Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Reference

1. Li, XD; Wu, J.; Gao, D.; Wang, H.; Sun, L.; Chen, ZJ Ključne uloge cGAS-cGAMP signalizacije u antivirusnoj obrani i imunoadjuvantnim učincima. Znanost 2013, 341, 1390–1394. [CrossRef] [PubMed]

2. Ansari, MA; Dutta, S.; Veettil, MV; Dutta, D.; Iqbal, J.; Kumar, B.; Roy, A.; Chikoti, L.; Singh, VV; Chandran, B. Acetilacija nuklearnog IFI16 inducirana prepoznavanjem genoma herpesvirusa ključna je za njegovu citoplazmatsku translokaciju, inflamasomski i IFN-odgovor. PLoS Patog. 2015, 11, e1005019. [CrossRef] [PubMed]

3. Orzalli, MH; Broekema, NM; Diner, BA; Hancks, DC; Elde, NC; Cristea, IM; Knipe, DM stabilizacija IFI16 posredovana cGAS-om potiče urođenu signalizaciju tijekom infekcije virusom herpes simplex. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 2015, 112, E1773–E1781.[CrossRef] [PubMed]

4. Woodward, JJ; Iavarone, AT; Portnoy, DA c-di-AMP koji luči intracelularna Listeria monocytogenes aktivira interferonski odgovor tipa domaćina. Znanost 2010, 328, 1703–1705. [CrossRef] [PubMed]

5. Dou, Z.; Ghosh, K.; Vizioli, MG; Zhu, J.; Sen, P.; Wangensteen, KJ; Simithy, J.; Lan, Y.; Lin, Y.; Zhou, Z.; et al. Citoplazmatski kromatin izaziva upalu kod starenja i raka. Priroda 2017, 550, 402–406. [CrossRef]

6. Takahashi, A.; Plijen.; Okada, R.; Kamachi, F.; Watanabe, Y.; Wakita, M.; Watanabe, S.; Kawamoto, S.; Miyata, K.; Barbir, GN; et al. Smanjena regulacija citoplazmatskih DNAza uključena je u nakupljanje citoplazmatske DNA i SASP u starim stanicama. Nat.Commun. 2018, 9, 1249. [CrossRef]

7. McArthur, K.; Whitehead, LW; Huddleston, JM; Li, L.; Padman, BS; Oorschot, V.; Geoghegan, ND; Chappaz, S.; Davidson, S.; Chin, HS; et al. BAK/BAX makropore olakšavaju herniaciju mitohondrija i efluks mtDNA tijekom apoptoze. Znanost 2018, 359, eaao6047. [CrossRef]

8. Matsui, H.; Ito, J.; Matsui, N.; Uechi, T.; Onodera, O.; Kakita, A. Citosolna dsDNA mitohondrijskog podrijetla izaziva citotoksičnost i neurodegeneraciju u staničnim modelima i modelima zebrice Parkinsonove bolesti. Nat. Komun. 2021, 12, 3101. [CrossRef]

9. Sliter, DA; Martinez, J.; Hao, L.; Chen, X.; Sunce, N.; Tara, D.; Fischer, TD; Burman, JL; Li, Y.; Zhang, Z.; et al. Parkin i PINK1 ublažavaju upalu izazvanu STING-om. Priroda 2018, 561, 258–262. [CrossRef]

10. Hou, Y.; Wei, Y.; Lautrup, S.; Yang, B.; Wang, Y.; Cordonnier, S.; Mattson, MP; Croteau, DL; Bohr, VA Dodatak NAD(+) smanjuje neuroupalu i starenje stanica u transgeničnom mišjem modelu Alzheimerove bolesti putem cGAS-STING-a. Proc. Natl.Acad. Sci. SAD 2021, 118, e2011226118.

For more information:1950477648nn@gmail.com