Trenutačni status neuroprotekcije kod prirođenih srčanih mana, 1. dio

Sažetak:

Prisutnost ektopične DNA u citoplazmi izaziva upalu i smrt stanice. Opširno je objavljeno da se istjecanje nuklearne DNA u citoplazmu uglavnom može osjetiti pomoću cikličke GMP-AMP sintaze (cGAS).

DNK je molekula koja određuje genetske informacije svake osobe i nalazi se u svakoj našoj stanici. Nedavna istraživanja pokazuju da DNK može procuriti u citoplazmu određenim putovima i utjecati na naše pamćenje.

Ovaj je fenomen čest kod starijih osoba i osoba s kognitivnim oštećenjem. Kada DNK procuri u citoplazmu, ometa normalne funkcije unutar stanice i povećava rizik od gubitka pamćenja i kognitivnog oštećenja.

Međutim, ne moramo se zbog toga osjećati depresivno i beznadno. Postoji mnogo načina za poboljšanje pamćenja i kognitivnih sposobnosti koji nam pomažu održati zdrav mozak.

Prije svega, morate voditi zdrav način života. To uključuje uravnoteženu prehranu, dovoljno sna, umjerenu tjelovježbu i smanjenje stresa. Ove prakse promiču zdravlje mozga, čime se izbjegava curenje DNK i poboljšava pamćenje.

Drugo, potreban je kognitivni trening. To može uključivati igranje matematičkih igara, čitanje, učenje novih vještina itd. Ove aktivnosti mogu pomoći u stimulaciji mozga i promicanju neurogeneze kako bi se izbjeglo curenje DNK.

Konačno, zadržite pozitivan stav. Emocionalna nestabilnost i pretjerani stres mogu uzrokovati promjene u kemiji mozga koje potiču curenje DNK. Stoga se moramo naučiti pozitivno suočiti s izazovima u životu i zadržati optimističan stav.

Ukratko, iako curenje DNK u citoplazmu može utjecati na pamćenje, možemo poboljšati zdravlje mozga, izbjeći curenje DNK i u konačnici poboljšati svoje pamćenje usvajanjem ispravnog načina života, uključivanjem u kognitivni trening i održavanjem pozitivnog načina razmišljanja. Pamćenje i kognitivne sposobnosti. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje jer je Cistanche deserticola tradicionalni kineski ljekoviti materijal koji ima mnogo jedinstvenih učinaka, a jedno od njih je i poboljšanje pamćenja. Djelotvornost Cistanche deserticola proizlazi iz brojnih aktivnih sastojaka koje sadrži, uključujući taninsku kiselinu, polisaharide, flavonoidne glikozide itd. Ovi sastojci mogu promicati zdravlje mozga na različite načine.

improve memory

Kliknite na 10 načina za poboljšanje pamćenja

Nedavno smo izvijestili da citoplazmatska dvolančana DNA (dsDNA) izvedena iz mitohondrija koja je izbjegla lizosomsku razgradnju izaziva značajnu citotoksičnost u kultiviranim stanicama i in vivo. Pretpostavlja se da je citoplazmatska mitohondrijska DNA uključena u razne bolesti i poremećaje, a objavljeno je sve više radova koji to potvrđuju. S druge strane, trenutna metoda za procjenu mitohondrijske DNK u citoplazmi možda nije kvantitativna.

Ovdje detaljno predstavljamo metodu za procjenu ektopičnih stanica mitohondrijske DNK. Ova metoda je korisna u osnovnim istraživanjima kao iu proučavanju starenja, Parkinsonove bolesti, Alzheimerove bolesti, zatajenja srca, autoimunih bolesti, raka i drugih stanja.

Ključne riječi: ektopična DNA; mitohondrijska DNA; mitohondrijski transkripcijski faktor A (TFAM); Parkinsonova bolest.

1. Uvod

DNK sadrži važne informacije za preživljavanje i nasljeđivanje, te ju je potrebno zaštititi od raznih stresora, uključujući oksidanse i mutagene. Eukariotske stanice sadrže mitohondrije, koji proizvode energiju, zajedno s mnogo aktivnih vrsta kisika, kroz aerobno disanje.

Dakle, u eukariotskoj stanici DNA postoji u jezgri ili mitohondrijima, upakirana unutar nuklearne membrane, odnosno mitohondrijske membrane. Međutim, DNA može biti prisutna u citoplazmi pod određenim uvjetima, kao što su tijekom virusnih ili nevirusnih infekcija [1– 4].

Čak i u nekim neinfektivnim stanjima (na primjer, starenje ili različiti poremećaji povezani sa starenjem ili rak), DNK može procuriti u citoplazmu iz jezgre ili mitohondrija [5-7].

DNA u citoplazmi može biti upalna i toksična za stanice. Opširno je objavljeno da istjecanje nuklearne DNA u citoplazmu izaziva upalu, citotoksičnost i sekretorni fenotip (SASP) povezan sa starenjem, uglavnom putem cikličke GMP-AMP sintaze (cGAS) - stimulatora puta gena za interferon (STING) [ 5,6].

Nedavno smo izvijestili da se pokazalo da citosolna dvolančana DNA (dsDNA) mitohondrijskog podrijetla koja izmiče lizosomskoj degradaciji inducira citotoksičnost i neurodegeneraciju u staničnim modelima Parkinsonove bolesti [8]. Prisutnost ili povećanje takve ektopične DNK često je naznačeno reprezentativnim mikroskopskim slikama i posrednim dokazima, a ne povećanjem samog curenja DNK.

short term memory how to improve

Očekuje se da će procjena ove ektopične DNK postati sve važnija, ne samo za osnovna istraživanja, već i za istraživanja starenja i drugih bolesti, kao što su Parkinsonova bolest, Alzheimerova bolest, amiotrofična lateralna skleroza, zatajenje srca, autoimune bolesti, dijabetes, nealkoholni steatohepatitis (NASH) i karcinomi. Prijavljeno je da je cGAS-STING put ključan ne samo u starenju, već i u patogenezi ovih bolesti [8-17].

Vjerojatno zbog oksidativnih okolnosti oko mitohondrija i nedostatka učinkovitog sustava za popravak DNK mitohondrijske DNK, mitohondrijska DNK je mnogo osjetljivija na mutacije ili oštećenja od nuklearne DNK [18,19].

Za razliku od nuklearne DNK, mitohondrijska DNK postoji u više kopija u jednoj stanici i sintetizira se prema potrebi. Stoga bi mitohondrijska DNK mogla imati mnogo veće šanse da procuri u citoplazmu tijekom starenja ili u malignim stanjima kao što su poremećaji povezani sa starenjem, mitohondrijska disfunkcija , odnosno karcinoma.

Otkrivanje i mjerenje takve citoplazmatske mitohondrijske DNA moglo bi biti važno u razumijevanju patogeneze raznih bolesti i starenja te bi moglo postati biomarker i terapeutska meta.

Razvili smo polukvantitativnu metodu za procjenu ektopične mitohondrijske DNA koja curi u citoplazmu, a ovdje detaljno opisujemo metodu. Ovaj rad omogućuje objektivnu procjenu curenja mitohondrijske DNA i koristan je u proučavanju različitih patologija bolesti.

2. Materijali i metode

2.1. Stanične linije, liječenje siRNA i kvantitativna PCR (qPCR) analiza

Stanice HeLa izvedene su iz stanica raka grlića maternice pacijentice (ATCC,CCL-2). Stanice HeLa uzgajane su na 37 ◦C pod 5% CO2 u Dulbeccovom modificiranom EagleMediumu (DMEM) (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) s dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (Biowest, Nuaillé, Francuska) i otopinom penicilin-streptomicin ( 100 jedinica/mL penicilina G i 100 µg/mL streptomicin sulfata, Wako, Osaka, Japan).

Jedan dan prije transfekcije, HeLa stanice su nasađene u gustoći od 600 stanica/µL. Ekspresija gena od interesa utišana je u HeLa stanicama pomoću Stealth RNAi siRNA (mitohondrijski transkripcijski faktor A, TFAM: HSS144251, glukocerebrozidaza, GBA: HSS178140, Thermo FisherScientific, Waltham, MA, SAD) u Lipofectamine RNAiMAX transfekcijskom reagensu (ThermoFisher Scientific) prema uputama proizvođača (konačna koncentracija RNA od 10 nM).

Tri dana nakon nokdauna siRNA, ukupna stanična RNA izolirana je pomoću TRIzolreagensa prema uputama proizvođača (Thermo Fisher Scientific). Predlošci cDNA sintetizirani su iz pročišćene RNA korištenjem ProtoScript II First StrandcDNA Synthesis Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, SAD) s oligo (dT)20 početnicama. qPCR je izveden korištenjem TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio, Kusatsu , Japan) i analiziran u Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Takara Bio). PCR početnice korištene u ovoj studiji bile su GBA naprijed (TGCTGCTCAACATCCTTGCC), GBA reverzno (TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC), TFAM naprijed (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC), TFAM reverzno (GCATCTGGGTTCTGAGCTTTA), gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH) naprijed (CAGCCTCAAGATCATC). AGCA) i GAPDH obrnuti (TGTGGTCATGAGTCCTTCCA).

Statističke analize provedene su korištenjem softvera GraphPad Prism verzija 9.3.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, SAD). Za usporedbu aritmetičkih sredina između dviju skupina korišten je dvostrani Studentov t-test. Podaci su prikazani kao srednje vrijednosti i ± standardne pogreške srednjih vrijednosti.

2.2. Imunofluorescentna detekcija ektopične mitohondrijske DNA i analiza slike

Jedan dan prije transfekcije, HeLa stanice su nasađene u gustoći od 600 stanica/µL. Ekspresija gena od interesa je utišana u HeLa stanicama pomoću Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) u Lipofectamine RNAiMAX transfekcijskom reagensu (ThermoFisher Scientific) prema uputama proizvođača (konačna koncentracija RNA od 10 nM).

ways to improve memory

Tri dana nakon nokdauna siRNA, stanice su podvrgnute imunofluorescentnom bojenju. Za detekciju mitohondrijske DNA, anti-dsDNA antitijela (Abcam, Cambridge, UK, klon 35I9, kat. br. ab27156, RRID: AB_470907 ili EMD Millipore, Billerica, MA, SAD, klon AC-30-10 , Cat# CBL186, RRID: AB_11213573) pokazao je bolji omjer signala i šuma nego Hoechst 33258, DAPI ili Picogreen. Ovdje smo kombinirali tri primarna protutijela: anti-dsDNA protutijelo (35I9 DNA) (Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907), anti-histonsko-H2B protutijelo (Abcam, Cat# ab134211) i anti-heat- antitijelo na šok-protein-60 (Hsp60) (Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB_881444).

Druga antitijela se mogu odabrati ili fluorescentno označiti histonom, ili se Hsp60 može koristiti alternativno, ali je potrebno optimizirati uvjete trostrukog bojenja za svaku kombinaciju.

Stanice su isprane dva puta fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom (PBS) i fiksirane s ledeno hladnim metanolom 10 min na 4 ◦C. Alternativno, 4% paraformaldehid (PFA) može se koristiti za fiksaciju, ali pozadinski signali izgledaju mnogo veći u PFA fiksiranim uzorcima. Nakon fiksacije, stanice su isprane tri puta fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom s Tweenom 20 (PBST) po 5 minuta. Stanice su permeabilizirane s PBS-om koji sadrži 0,2% (w/v) Triton X-100 tijekom 10 minuta.

Nakon što su isprane tri puta s PBST-om svaki put po 5 minuta, stanice su inkubirane s 2% (w/v) albuminom goveđeg seruma (BSA) u PBST-u tijekom 30 minuta. Stanice su inkubirane s jednim primarnim protutijelom, anti-histon-H2B protutijelom (1/400, Abcam, Cat# ab134211) razrijeđenim u 2% (w/v) BSA u PBST O/N na 4 ◦C. Nakon što su isprane tri puta s PBST po 5 minuta svaki put, stanice su inkubirane s Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey anti-Chicken IgY(IgG) (H+L) (1/200, Wako, Cat# {{17) }}) razrijeđen u 2% (w/v) BSA u PBST 1 sat na sobnoj temperaturi (RT).

Nakon što su isprane tri puta po 5 minuta svaki put s PBST, stanice su inkubirane s primarnim protutijelima i anti-dsDNA protutijelima (35I9 DNA) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) i anti -Hsp60 antitijela (1/400, Abcam, Cat# ab46798,RRID: AB_881444) razrijeđena u 2% (w/v) BSA u PBST primijenjena su 1 sat na sobnoj temperaturi ili preko noći (O/N) na 4◦C.

Nakon što su isprane tri puta s PBST po 5 minuta svaki put, stanice su inkubirane s visoko unakrsno adsorbiranim Alexa Fluor 680-konjugiranim magarećim anti-zečjim IgG(H+L) (1/200, Thermo Fisher Scientific, kat. br. A10043 , RRID: AB_2534018) i Donkeyanti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200, Abcam Cat# ab150108, RRID: AB_2732073) razrijeđen u 2% (w/v) BSA u PBST 1 sat na sobnoj temperaturi.

memory enhancement