Središnja uloga transformirajućeg faktora rasta (TGF-) u razvoju bubrežne fibroze
Mar 26, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com
DIO Ⅰ: Uloga ljudskog primarnog bubrežnog fibroblasta u TGF- 1-posredovanim uređajima za oponašanje fibroze
Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee i dr.
1. Uvod
Bubrežna fibroza, posljednji uobičajeni put bezbrojnih progresivnih bolesti bubrega, karakteriziran je povećanjem proizvodnje proteina izvanstaničnog matriksa (ECM), smanjenjem razgradnje matriksa, disfunkcijom interakcije stanica-matriks, transformacijom rezidentnih stanica i infiltracijom upalnih stanica.Transformirajući faktor rasta-(TGF-) je multifunkcionalni dimerni peptid koji regulira biološke procese kao što su stanična proliferacija, diferencijacija i imunološki odgovori [1]. Među brojnim fibrogenim čimbenicima, TGF- (Transformirajući faktor rasta-) ima središnju ulogu i djeluje protuupalno. TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)-deficijentni miševi umiru od masivne upale. Transgeni miševi s prekomjernom ekspresijom TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)gotovo su zaštićeni od razvoja bubrežne fibrozne patologije, uglavnom svojim protuupalnim djelovanjem [2]. Profibrotična i protuupalna svojstva TGF-a(Transformirajući faktor rasta-)dvosjekli su mačevi u pogledu terapijske primjene TGF-a.(Transformirajući faktor rasta-)inhibicija. Uloženi su značajni napori da se opstruira TGF-(Transformirajući faktor rasta-)djelovanje za sprječavanje napredovanjabubrežnifibroza[3]. Iako su mnogi pristupi korišteni za borbububrežnifibroza, eksperimentalni model za procjenu trenutno dostupnih lijekova nije idealan.
cistanche herb spriječitibubrežne bolesti
Općenito, studije na životinjama igraju ključnu ulogu u pretkliničkim ispitivanjima u predviđanju farmakokinetike i učinkovitosti lijeka. Međutim, postoje različite razlike između životinja i ljudi, što nas tjera da preispitamo točnost testova učinkovitosti i sigurnosti lijekova na životinjama 4. Prethodna su izvješća ovisila o pretkliničkim studijama na životinjama tijekom razvoja lijeka kako bi se procijenila nefrotoksičnost i sigurnost lijekova. Funkcija bubrega životinja je više nego dvostruko bolja od ljudske bubrega. Stoga se lijekovi metaboliziraju brže u životinja nego u ljudi, što otežava razjašnjavanje rezultata testova toksičnosti lijekova pomoću studija na životinjama. Nadalje, rezultati pokusa na životinjama ne mogu se koristiti za predviđanje odgovora na lijekove kod ljudi, jer životinje imaju različite fiziološke funkcije. Na životinjskoj bazifibroza bubregamodeli imaju poteškoća u reprodukciji čovjekafibroza bubrega; stoga su u tijeku istraživanja kako bi se prevladale postojeće prepreke i optimizirale platforme za otkrivanje lijekova [5].
Tehnologija Organ-on-a-chip (OoC) pojavila se kao novi koncept za rješavanje ovih problema. Ova je platforma osmišljena uzimajući u obzir trenutne nedostatke i pokazala je veliko obećanje u području nefrologije [6]. Osim toga, OoC modeli imaju veliki potencijal kao zamjena za eksperimentalne životinjske modele, pružaju rješenje za razlike među vrstama i mogu pomoći okončati okrutnost prema životinjama i etičke rasprave [7]. Malo je in vitro modela koji istovremeno koriste primarne bubrežne fibroblaste s endotelnim i epitelnim stanicama, koje su važne stanice ububregfibroza. Uloga svake stanice ufibrozaproučava se zasebno; međutim, postoji ograničeno znanje o međudjelovanju stanica.
U ovoj studiji razvili smofibroza-oponašanje uređaja koji koriste ljudske primarne fibroblaste. Potvrdili smo da je TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)liječenje ima različite učinke nafibroza bubregamodel. Naime, fibroblasti igraju ključnu ulogu kao efektorske stanice, potiču stvaranje profibrotičnog mikrookruženja i izlučuju faktore rasta i citokine. Stoga, na temelju ove nove metode, fibroblasti mogu pružiti idealan sustav staničnih modela za proučavanje bolesti bubrega. Procijenili smo utječu li fibroblasti koji potječu iz fibrozne bubrežne bolesti na cjelovitost stanica uzgojenih u tri dimenzije (3D). Na kraju, predstavljamo studiju dokaza principa koja pokazuje potencijal čovjekafibroza bubrega-uređaji za oponašanje kao model za predviđanje odgovora na čovjekafibroza bubrega.
učinci cistanche: liječiti infekciju bubrega
2. Rezultati
2.1. Identifikacija alfa aktina glatkih mišića (a-SMA) i keratina-8(KRT-8) pomoću TGF-a- 1(Transformirajući faktor rasta-)u ćelijama HK-2
U ranoj fazi ispitali smo poznate markerefibrozai citoskelet u dvodimenzionalnim (2D) kulturama. Provedeni su testovi imunofluorescentnog bojenja za procjenu -SMA ekspresije fibroze i biljega tubularnog epitela u mezenhimalni prijelaz (EMT) i razine KRT8 kao markera citoskeleta. Imunofluorescentno bojenje pokazalo je da je ekspresija -SMA izvorno bila slaba, a razine KRT8 bile su visoke u jednoslojnim epitelnim stanicama HK-2. Nije bilo značajnih promjena u intenzitetu fluorescencije od strane TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)(5 ng/mL) ili tretman specifičnim inhibitorima HK-2 epitelnih stanica tijekom 24 sata (Slika 1).
Slika 1. Imunofluorescencija pokazuje da je ekspresija alfa-SMA i keratina-8(KRT8) održana tretmanom TGF-om- 1(Transformirajući faktor rasta-)ili inhibitor u HK-2 stanicama.(A) Ekspresija alfa-SMA i (B)CCK-8 nije imala učinak na HK-2stanice pomoću TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)(5ng/mL) ili inhibitor. Stanice su izvorno nasađene na ploču u gustoći od 1×10 stupnjeva po jažici (ac)netretiranoj kontroli i （df）stimulirane s 5ng/mL TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-) ili（gi）10 μM inhibitor（SB431542） tijekom 24 sata i fiksiran s 4 posto paraformaldehida. Stanice su zatim obojene s anti- -SMA i anti-citokeratin-8 tijekom 20 minuta. Provedeno je zajedničko bojenje s Hoechst bojom H33342 za identifikaciju staničnih jezgri. Mjerne trake na mikrografijama pokazuju 200 um.
prašak cistanke poboljšava rad bubrega
2.2. Ekspresija KRT8 smanjena za TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)na čipu
Zatim smo procijenili razine ekspresije -SMA i KRT8 u 3D kultiviranom HK-2 i ukupnu duljinu GFP-ljudskih endotelnih stanica umbilikalne vene (HUVECs) tretiranih s TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)i specifični inhibitor. Da bismo to postigli, najprije smo uspostavili uzorak čipa tkiva koji se sastoji od dvije vrste stanica, epitelnih stanica HK-2 i GFP-HUVEC. Nakon potvrde konstrukcije, izložili smo čip tkiva s TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)(5 ng/mL) ili specifični inhibitor (10 um SB431542) tijekom 24 h.
Kao što je prikazano na slici 2A-C, ekspresiju -SMA nije specifično promijenio TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)ili liječenje specifičnim inhibitorima. Međutim, ekspresija KRT8 bila je smanjena u dvostaničnom kokultiviranom čipu. Štoviše, dodavanje inhibitora TGF-ß1 povećalo je ekspresiju KRT8.
Ispitali smo formiranje 3D cjevaste kapilarne mreže pomoću TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretman u HUVEC-ovima, jer endotelne stanice mogu spontano formirati 3D tubularnu kapilarnu mrežu. U skladu s našim kulturnim uvjetima, stvaranje debelih linija je značajno smanjeno. Međutim, tanke linije poput kapilara povećane su u TGF-u- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretirani GFP-HUVEC-ovi. U slučaju TGF-a- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretman inhibitora na 3D uzgojenom čipu, ukupna duljina debelih i debelih linija pokazala je obrnutu tendenciju prema TGF-u- 1(Transformirajući faktor rasta-)liječenje. Uočeno je povećanje duljine debele linije u usporedbi s netretiranom kontrolnom skupinom. Sličan uzorak primijećen je u promjeru debele linije u GFP-HUVEC nakon TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)liječenje i liječenje inhibitorima. Promjer GFP-HUVEC-a potisnuo je TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)liječenje, ali povećano bez obzira na debljinu linije od strane inhibitora u usporedbi s kontrolama i TGF-om- 1(Transformirajući faktor rasta-). Ukupna duljina i promjer debele linije dramatično su povećani tretmanom inhibitorom TGF- 1 u usporedbi s netretiranom kontrolom i tretmanom TGF- 1. Naime, dobiveni rezultati ukazuju na povećanu gustoću sitnih žila u TGF-u(Transformirajući faktor rasta-)-liječena skupina u usporedbi s njihovim neliječenim kolegama. Nasuprot tome, gustoća debelih krvnih žila u TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)liječenoj skupini bila niža od one u neliječenoj kontrolnoj skupini (Slika 2D, E).
Slika 2. Ekspresija KRT8 u HK-2 i ukupna duljina i promjer HUVEC-ova.(A) Imunofluorescencija pokazuje da je ekspresija -SMA održana, a ekspresija KRT8 dramatično smanjena tretmanom TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)u HK-2. Stanice su nasađene i stimulirane s 5 ng/mL TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)ili 10 μm inhibitor （SB 431542） tijekom 24 sata i fiksiran s 4 posto paraformaldehida. Stanice su bojene s anti- -SMA i anti-citokeratin-8 tijekom 20 minuta. Provedeno je zajedničko bojenje s Hoechst bojom H33342 za identifikaciju staničnih jezgri. Ekspresija -SMA(ac) nije bila promijenjena, ali KRT8(df) u HK-2 stanicama i GFP u HUVEC (gi) ekspresiji značajno su promijenjeni TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)(5 ng/mL) i inhibitor (B, C). U ukupnoj duljini HUVEC-ova, tanka krvna žila je povećana, ali debela krvna žila je smanjena za TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-). Promjer je povećan i kod tankih i kod debelih posuda. Ovi rezultati su poništeni inhibitorom SB431542 (D, E). Mjerne trake na mikrografijama pokazuju 100 μm.*str<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
za što se koristi cistanche: liječenje kroničnih bolesti bubrega
2.3. TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)Utječe na tri vrste stanica čipa sa strukturom s više odjeljaka
Za proučavanje TGF-a- 1(Transformirajući faktor rasta-)odgovora predloženog 3D čipa, izvršili smo imunološko bojenje na svakom odjeljku zasebno (Slika 3). U ovoj analizi korišteni su primarni humani bubrežni fibroblasti. Uzorci su analizirani pomoću FACS-a i potvrđeno je da su pozitivni na antitijela markera fibroblasta. Nakon inkubacije tri vrste stanica s TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tijekom 24 h, provedeno je imunološko bojenje kako bi se procijenila ekspresija -SMA i KRT8. Ekspresija a-SMA je regulirana prema gore tretmanom TGF-1, a suprotni rezultati uočeni su s TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)liječenje inhibitorima. Suprotno tome, TGF je smanjio ekspresiju KRT8- 1(Transformirajući faktor rasta-)i pokazao je suprotan odgovor na TGF-(Transformirajući faktor rasta-)inhibitor (Slika 4A-C).
Slika 3. Uzorak slike sa shematskim prikazom uređaja za izradu i eksperimentalni raspored.(A) Gornje dvije slike prikazuju izgled. Lijeva slika prikazuje cjelokupnu fotografiju uređaja odozgo prema dolje. Donje slike prikazuju presjek. Shematski prikaz s detaljima dimenzija vodilica tekućine. (B) Ova slika opisuje eksperimentalne rasporede zafibroza-uređaji za oponašanje. Proces punjenja u četiri koraka za svaku jažicu. Lokacija svakog područja uzorkovanja hidrogela, kao i postavljanje medija u presjeku odozgo prema dolje i izometrijskom presjeku. (1) Ukupno 1,5 uL hidrogela 1 spontano se vodi u središnji kanal. (2) Središnji kanal ispunjen je s 5 uL hidrogela. (3) Ukupno 10 uL hidrogela 3 ima uzorak na dnu rezervoara. （4）Dodijeljeno je ukupno 200 μL medija. Crvena skala =9 mm.
Kao što je prikazano na slici 4D-G, TGF je značajno povećao duljinu tanke linije poput kapilare- 1(Transformirajući faktor rasta-)liječenje u GFP-HUVEC-ovima. Međutim, debljina debele linije smanjena je u TGF-u- 1(Transformirajući faktor rasta-)liječenih HUVEC-ova. Promjer je u prosjeku smanjen za tanke i debele posude u HUVEC-ovima. U slučaju TGF-a- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretman inhibitorom na 3D uzgojenom čipu, ukupna duljina debelih i debelih linija pokazala je suprotan trend od tretmana TGF- 1. Nadalje, duljina debele linije je povećana u usporedbi s netretiranom kontrolnom skupinom.
Slika 4. Promjena 3D uzgojenih HK-2 i HUVEC s primarnim bubrežnim fibroblastima.Ukupne stanice su nasađene pri gustoći od 5×10 stupnjeva po 3D čipu i stimulirane s 5 ng/mL TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)ili 10 μm inhibitor （SB 431542） tijekom 24 sata i fiksiran s 4 posto paraformaldehida. (A) Stanice u 3D čipu obojene su anti-o-SMA i anti-citokeratinom-8. Ekspresija -SMA (ac) je povećana, a ekspresija KRT8(df) je značajno smanjena za TGF- 1(5 ng/mL). Ukupna duljina HUVEC-ova; tanke krvne žile dramatično su povećane, a debele krvne žile smanjene TGF-ß1(Transformirajući faktor rasta-)（D, E). Promjer je smanjen za tanke i debele posude (F, G). Ovi rezultati su poništeni inhibitorom SB431542. Mjerne trake na mikrografijama pokazuju 100 μm.*str<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 Modulira posrednike upale i faktore rasta
Zatim smo istražili upalne citokine i faktore rasta u supernatantu; IL-1 , FGF-2, TGF- 2(Transformirajući faktor rasta-)i TGF- 3(Transformirajući faktor rasta-)izlučivanje proteina bilo je dramatično veće u čipovima uzgojenim u 3D nego u bušotinama uzgojenim u 2D fibroblastima, iako su imali isti ukupni broj stanica. Međutim, TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-) razine su bile slične jer su 2D ili 3D uzgojeni modeli tretirani sličnim koncentracijama TGF-a- 1(Transformirajući faktor rasta-)(Slika 5A-E). Konkretno, oslobađanje FGF-2 iz ljudskih primarnih bubrežnih fibroblasta bilo je 20.9 ± 0.4 pg/dan/5× 10 stupnjeva stanica 2D jednoslojne kulture i 3094,8± 0,2 pg/dan/5 × 10 stupnjeva stanica uključujući HUVEC i HK-2 3D uzgojenog čipa u netretiranoj kontroli. Izlučivanje FGF-2 pomoću TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)stimulacija je bila 31.0±0.2 pg/dan/5×10 stupnjeva stanica za 2D kulturu i 3683.9± 0.8 pg/dan/5×10 stupnjeva stanica za 3D -kultivirani čip. Ovo povećanje proizvodnje FGF-2 proteina u 2D monoslojnoj kulturi bilo je paralelno s povećanjem u 3D-kultiviranom modelu čipa pomoću TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretman (Slika 5B).
Slika 5. Usporedba 2D i 3D uzgojenih modela kao platformi koje oponašaju fibrozu bubrega.Stanice su nasađene pri gustoći od 5×10 stupnjeva po 2D jažici ili 3D čipu i stimulirane s 5ng/mL TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)ili 10 um inhibitor (SB 431542) tijekom 24 h. Primarni humani bubrežni fibroblasti korišteni su u 2D uzgojenom iu 3D uzgojenom modelu. Fibroblasti su korišteni u gustoći od 8×10* uzgojeni s HUVEC i HK-2. Primarni omjer humanih bubrežnih fibroblasta i HUVEC-a, ili omjer F:H, bio je 1:5 za procjenufibroza.HK-2 stanice korištene su u gustoći od 2×104. Detekcija (A)IL-1, (B)osnovnog faktora rasta fibroblasta (FGF-2) i (CE)TGF-beta 1, 2 i 3 u supernatantu provedena je multipleks analizom citokini i imunotest s višestrukim kuglicama. Svaka traka predstavlja srednju vrijednost± SE.*str<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(Transformirajući faktor rasta-).
dobrobiti cistanche tubolosa: liječenje bolesti bubrega
Nadalje, procijenili smo ekspresiju mRNA proupalnih citokina kao što su IL-1, IL-6, IL-8 i TNF-. Rezultati su značajno smanjeni rekombinantnim humanim TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)tretman u 3D uzgojenom čipu kao protuupalno svojstvo TGF-a(Transformirajući faktor rasta-). Otkrili smo da je ekspresija mRNA regulirana prema gore pomoću TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)inhibitor (SB431542). Nadalje, ekspresija IL-6, IL-8 i TNF-a posredovana inhibitorima bila je specifično smanjena u usporedbi s netretiranom kontrolom (Slika 6A-D). TGF je značajno povećao razinu mRNA VEGF-a, fibroznog faktora- 1(Transformirajući faktor rasta-)liječenje. Razinu mRNA VEGF-a smanjio je inhibitor TGF- 1 (Slika 6E), dok je ekspresija mRNA IL-10 s antifibroznim učinkom smanjena u fibroznim stanjima izazvanim TGF- 1 . Nasuprot tome, ekspresija I-10mRNA povećana je tretmanom TGF- 1inhibitorom (Slika 6F).
Slika 6. PCR u stvarnom vremenu pokazuje ukupnu ekspresiju mRNA 3D čipa.Stanice su nasađene pri gustoći od 5 × 10 stupnjeva po 3D čipu i stimulirane s 5 ng/mL TGF- 1(Transformirajući faktor rasta-)ili 10 um inhibitor (SB431542) tijekom 24 sata. Ukupna RNK ekstrahirana iz 3D uzgojenog čipa. Ekspresija mRNA (A)IL-1, (B)TNF-, (C)IL-6 i (D)IL-8 predstavlja protuupalni učinak TGF{ {10}}(Transformirajući faktor rasta-)liječenje. Povećana je ekspresija (E)VEGF kao angiogenog faktora. Ekspresija (F)IL-10 kao antifibroznog faktora značajno je smanjena TGF- 1.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(Transformirajući faktor rasta-).