Kako proteini za popravak stanične membrane reguliraju transdukciju signala faktora transkripcije za kontrolu fibroze bubrega

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Haichang Li

Bubregfibroza je povezana s progresijom akutnebubregozljeda kronične bolesti bubrega. Pokazalo se da MG53, protein za popravak stanične membrane, štiti od oštećenja epitelnih stanica bubrega i akutne ozljede bubrega. Ovdje smo procijenili ulogu MG53 u modulacijibubregfibroza u starijih miševa i u miševa s jednostranom ureteralnom opstrukcijom (UUO) poznati model progresivne fibroze bubrega. Miševi s ablacijom MG53 razvili su više intersticijske fibroze s godinama od MG53-intaktnih miševa iste dobi. Slično, u nedostatku MG53,bubregfibroza je bila pojačana u usporedbi s miševima s intaktnim MG53 u opstruiranom bubregu u usporedbi s kontralateralnim nezačepljenim bubregom ili bubrezima lažno operiranih miševa. Mokraćovod začepljenbubregaiz miševa s nedostatkom MG53 također su pokazali značajno veću upalu nego bubrezi začepljeni ureterom iz intaktnih miševa s MG53. Pokusi in vitro pokazali su da MG53 može ući u jezgre proksimalnih tubularnih epitelnih stanica i izravno komunicirati s p65 komponentom transkripcijskog faktora NF-kB, pružajući moguće objašnjenje pojačane upale u odsutnosti MG53. Kako bi se to testiralo, poboljšana ekspresija MG53 kroz projektirane stanice ili izravna isporuka rekombinantnog proteina dana je miševima podvrgnutim UUO. Ovo je smanjilo NF-kB aktivaciju i upalu te oslabilu fibrozu bubrega. Stoga MG53 može imati terapeutsku ulogu u liječenju kronične upale bubrega i time pružiti zaštitu odfibrozašto dovodi do fenotipa kronične bubrežne bolesti.

Cistanche tubulosa sprječava bolesti bubrega, kliknite ovdje za uzorak

Prijevodna izjava Kronična upala dovodi do fibroznog preoblikovanja koje također može biti temelj prijelaza iz akutne ozljede bubrega u kroničnu bubrežnu bolest. Aktivacija proteina upalnog transkripcijskog faktora nuklearnog faktora-kB (NF-kB) uključena je u patogenezu upale bubrega. Ovdje pružamo dokaze da MG53, prethodno identificirani protein za popravak stanične membrane, izravno stupa u interakciju s NF-kB i smanjuje njegovu transkripcijsku aktivnost. Istodobno, egzogeno primijenjen MG53 može smanjiti fibrotično preoblikovanje upaljenog bubrega. Ovi nalazi ukazuju na zaštitnu interakciju između MG53 i NF-kB za ublažavanje razvoja fibroze bubrega posredovane upalom. Farmakološka primjena MG53 mogla bi biti obećavajući pristup za liječenje progresivne fibroze bubrega.

Disfunkcija bubrega, koja se može klasificirati kao akutna ozljeda bubrega (AKI) ili kronična bubrežna bolest (CKD), prerasla je u epidemiju u starijoj populaciji. U 2017. prevalencija kronične bubrežne bolesti dosegnula je 14,5 posto ljudi u dobi od 65 godina i više, što je rezultiralo troškovima Medicarea od preko 84 milijarde USD za liječenje.^1,2AKI i CKD su češći kod starijih osoba, uglavnom zbog povećane osjetljivosti na ozljede plus smanjene sposobnosti popravljanja bubrega koji stari. Kliničke studije su pokazale da je kronična bubrežna bolest glavni čimbenik rizika za AKI, i obrnuto, epizode AKI mogu ubrzati napredovanje KBB-a prema završnom stadiju bolesti bubrega. Trenutačno je liječenje AKI uglavnom suportivno, a liječenje utvrđenog CKD-a usmjereno je na usporavanje progresije inhibicijom sustava renin-angiotenzin-aldosteron i sada moguće inhibicijom kotransportera natrij-glukoza-2.^3,4

Ovisno o težini ozljede, proksimalne tubularne stanice, glavna meta akutne ozljede, mogu doživjeti promjene u napredovanju staničnog ciklusa,5,6 metabolizmu,7 izlučivanju proteinskih upalnih i profibrotičkih citokina ili djelomičnoj epitelno-mezenhimskoj tranziciji,8 koji će odrediti hoće li remodeliranje/popravak biti uspješno ili neprilagodljivo i rezultirati fibrozom bubrega, obilježjem CKD.9,10 Ovo remodeliranje općenito se događa u pozadini upale bubrega,

smanjena vaskularna opskrba i proizvodnja proteina izvanstaničnog matriksa (ECM) i uključuje gubitak epitelnih stanica i nakupljanje kolagena, a-aktina glatkih mišića i fibronektina; također ima visoku korelaciju s pogoršanjem funkcije bubrega.

Kronična upala dovodi do fibroznog remodeliranja koje također može biti temelj prijelaza iz AKI u CKD.11-13 Kumulativna istraživanja sugeriraju uključenost transkripcijskog faktora nuklearnog faktora-kB (NF-kB) u patogenezi upale bubrega uzrokovane infekcijom, ozljedom, ili transplantacija.11,12,14 Aktivacija kanonskog puta NF-kB počinje aktivacijom inhibitora NF-kB (IkB) kinaze, što dovodi do fosforilacije i razgradnje IkBa i nuklearne translokacije heterodimera NF-kB.15 Aktivacija NF-kB signalizacije u bubrežnim epitelnim stanicama i infiltrirajućim imunološkim stanicama može biti izazvana patofiziološkim okidačima kao što je izloženost lipopolisaharidima (LPS) ili ishemijsko-reperfuzijska ozljeda.16 Studije molekularnog profiliranja otkrivaju nfkb1 kao glavnog pokretača fibroze bubrega.¹⁷Uz bubrežne tubularne stanice, urođene imunološke stanice kao što su makrofagi i dendritične stanice također pridonose ozljedi bubrega, upali i fibrotičnom preoblikovanju.^13,18–20

cistanche je učinkovit u liječenju disfunkcije bubrega

Sve više dokaza sugerira da sekretorni čimbenici koji potiču iz mišića (tj. miokini) moduliraju sistemsku fiziologiju preko preslušavanja tkiva kako bi utjecali na napredovanje bolesti bubrega.²¹MG53 (također nazvan TRIM72) je protein tripartitnog motiva obogaćenog mišićima (TRIM) s kritičnom funkcijom u popravku stanične membrane.22,23 Proteini obitelji TRIM imaju različite funkcije u rasponu od regulacije imunološkog signaliziranja do popravka tkiva.²⁴MG53-posredovani popravak membrane uključen je u ublažavanje akutne ozljede skeletnih mišića,²⁵bubrezi,²⁶srce,²⁷ pluća, 28 mozgova,^29,30i kože.³¹Naše prethodne studije identificirale su nisku razinu ekspresije MG53 u bubrezima, što je ključna komponenta u zaštiti od AKI, a miševi s manjkom MG53 (mg53 / ) bili su osjetljiviji na AKI izazvanu stresom.²⁶Također smo nedavno pokazali da trajno povišenje MG53 u cirkulaciji poboljšava popravak i regeneraciju ozljeda tkiva.32 Relativne uloge specifičnog za bubrege i ekstrinzičnog cirkulirajućeg MG53 u modulaciji bubrežne fibroze tijekom progresivne CKD još su nepoznate.

Nedavno je evoluirala nova uloga MG53 u modulaciji zaštite tkiva kroz inhibiciju upale, posebno putem modulacije NF-kB signalizacije. Na primjer, MG53 smanjuje neurotoksičnost izazvanu LPS-om i neuro-upalu inhibicijom puta TLR4/NF-kB,33 a srčani MG53 regulira ekspresiju KChIP2 za kontrolu elektrofiziološkog preoblikovanja tijekom kardiohipertrofije.34 Osim toga, pokazali smo dvostruku funkciju MG53 u sprječavanje maladaptivnog hiperupalnog odgovora tijekom subletalne infekcije virusom influence A, koju karakterizira prekomjerna proizvodnja interferona-b, putem supresije aktivacije IRF3/NF-kB i inhibicije aberantnog intracelularnog Ca2þ signaliziranja u makrofazima.35 Nadalje, nakon smrtonosne doze virusa influence A infekcije virusom, pokazalo se da MG53 sprječava smrtnost i oštećenje pluća, ne izravnim utjecajem na virusne titre per se, već ublažavanjem oluje citokina (interferon-b, interleukin-6 i interleukin-1b) kroz negativnu regulaciju upale NLRP3 i prevencija piroptoze pluća.36 Štoviše, kronično liječenje visokim dozama egzogenog MG53 povezano je sa supresijom NF-kB – posredovana upala u starijem srcu.37 Ove studije sugeriraju da MG53 može modulirati nenormalno NF-kB signaliziranje tijekom upale, ali nije ispitano događa li se to u kontekstu upale bubrega.

Pretpostavili smo da MG53 regulira upalu bubrega moduliranjem transkripcijske aktivnosti NF-kB i na taj način može ublažiti fibrozu bubrega koja se javlja kao posljedica kronične upale. Ova studija je poduzeta kako bi se pozabavila ovom hipotezom.

cistanche je učinkovit u liječenju bolesti bubrega

METODE

Studije na životinjama

Svi pokusi sa životinjama pridržavali su se Vodiča Nacionalnog instituta za zdravlje za skrb i korištenje laboratorijskih životinja i slijedili su protokole koje je odobrilo Institucionalno povjerenstvo za skrb i korištenje životinja Državnog sveučilišta Ohio. Divlji tip koji odgovara dobi (WT) ili mg53^-/-nerodovi iz legla soja 129S1/SvImJ korišteni su22 za utvrđivanje uloge MG53 u modulaciji bubrežne fibroze ovisne o dobi i unilateralne opstrukcije uretera (UUO). C57B6/J miševi (9-10 tjedana) kupljeni su od Jackson Labs.

Za studije oštećenja bubrega, miševi (9-12 tjedana) bili su podvrgnuti UUO kako bi se izazvala fibroza bubrega. Miševi su anestezirani izofluranom (1,5 posto –2.0 posto) kako bi se osigurala duboka razina anestezije. UUO postupak izveden je ligiranjem lijevog uretera s 5-0 kirurškom svilom dva puta prema objavljenim protokolima.38 Lažni miševi imali su samo rez na abdominalnoj koži. Kako bi se procijenio učinak rhMG53 na opstruktivnu ozljedu bubrega, 1 skupina UUO miševa primila je rhMG53 (2 mg/kg) injekcijom u repnu venu počevši odmah nakon operacije UUO (dan 0), a zatim svakodnevno tijekom 7 dana, s 2 dodatne doze 9. i 11. dana. Kontrolna skupina UUO miševa primila je injekcije fiziološke otopine prema istom rasporedu. Miševi su ubijeni 12. dana nakon operacije UUO, bubrezi su perfundirani in situ fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom, a uzorci tkiva iz UUO bubrega i kontralateralnog bubrega su prikupljeni za histologiju i Western blot analizu.

U odvojenim studijama, WT i mg53^-/-miševi su podvrgnuti UUO ili lažnoj operaciji i ubijeni su 7. dana nakon operacije. MG53 je davan miševima korištenjem pristupa stanične terapije.39 Makrofagi RAW 264.7 zaraženi su virusnim česticama Ad tPA-MG53-trešnje ovisnim o doksiciklinu (DOX) tijekom 24 sata. Inficirane stanice (u koncentraciji od {{10}} /100 ml fiziološke otopine po mišu) ubrizgane su u repnu venu miševima odmah nakon operacije (injekcija 0. dan). Miševi su primili 4 injekcije RAW stanica transduciranih s Ad-tPA-MG53 0., 1., 3. i 6. dana. Odmah nakon injekcije stanica 0. dana, miševi su randomizirani u skupinu koja je primila i skupinu koja nije primila DOX (2 mg/ml u 5 postotnoj otopini saharoze) u vodi za piće tijekom 7 dana i zatim ubijeni. Uzorci tkiva iz UUO bubrega i kontralateralnog bubrega prikupljeni su za histologiju, RNA i analizu proteina.

Statističke analize Podaci su izraženi kao srednje vrijednosti -SD. Usporedba unutar skupina provedena je pomoću Studentovog t-testa pri usporedbi 2 eksperimentalna temeljna istraživanja H Li et al.: MG53 modulira NF-kB u fibrozi bubrega 2 Kidney International (2021) -, -–-skupine i 1-način analize varijance za više od 2 skupine (Graphpad Prism 8.2; GraphPad) nakon čega slijedi Bonferroni ili Holm-Sidak test višestruke usporedbe ad hoc. Vrijednost P < 0,05="" smatrana="" je="" statistički="">

Dopunske metode Potpune metode uključujući histološku evaluaciju, mjerenja kreatinina u serumu, plazmidne konstrukcije, stanične kulture i izolaciju primarnih tubularnih epitelnih stanica, pripremu adenovirusa i infekciju stanica, NF kB p65 nuklearni test translokacije, imunohistokemiju i konfokalne slike, NF-kB luciferazni reporter test, citokine imunoenzimski test, frakcioniranje tkiva, imunobloting, koimunoprecipitacija, kvantitativna lančana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu (dodatna tablica S1) i proizvodnja rhMG53 nalaze se u dopunskim metodama.

ekstrakt cistanche tubulosa: liječenje bolesti bubrega

REZULTATI

Miševi s ablacijom MG53 razvijaju fibrozu bubrega ovisnu o dobi

Usporedili smo učinak starenja na funkciju bubrega i fibrozu u mg53^-/-i WT miševi. Potvrdili smo naše prethodno zapažanje da, iako se razine kreatinina u serumu mladih miševa (2 mjeseca) sa i bez MG53 nisu značajno razlikovale, stariji (16-20 mjeseci) mg53-/-miševi su pokazali značajno viši kreatinin u serumu nego WT kontrole iste dobi (Slika 1a). Na temelju bojenja trikromom, otkrili smo da mg53-/-miševi su imali više fibroze bubrega u usporedbi s WT miševima, počevši od dobi od 5 mjeseci i nastavljajući se do dobi od 20 mjeseci (Slika 1b i c). Imunohistokemijsko bojenje korišteno je za procjenu utjecaja ablacije MG53 na infiltraciju leukocita, monocita i makrofaga u bubrezima miša starih 2- i 5- mjeseci (Slika 1d i e). Bubrezi mladih WT i mg{8}}/- miševa imali su slične razine intrarenalnih leukocita, ali značajno više upalnih stanica pronađeno je u mg53/bubrezima nego WT bubrezima u 5-mjesečnih miševa.

Štoviše, imunohistokemija za aktin a-glatkog mišića i fibronektin, 2 proteina izvanstaničnog matriksa koji se obično nalaze u područjima fibroze bubrega, pokazala je pojačano (3- do 8-struko) bojenje u glomerulima i tubulointersticiju bubrega od { {4}}mjesečni miševi stari mg53-/- u usporedbi s 10-mjesečni miševi WT (dodatna slika S1).

UUO izaziva pogoršanu upalu bubrega i fibrozu kod mg53-/- miševa. Razine MG53 u bubrezima otkrivene imunoblotingom značajno su porasle 7 dana nakon UUO (Slika 2a). Bubrezi s mg53- /- UUO pokazali su pretjeranu fibrozu, s 30 posto dodatnog područja obojenog trikromom, nego bubrezi s WT UUO (Slika 2b).

MG53 modulira aktivaciju NF-kB i lokalizaciju jezgre p65

Aktivnost NF-kB (p65) procijenjena je u UUO modelu. Broj ukupnog p65 (t-p65) bio je značajno povećan u UUO bubrezima iz WT i mg53 / miševa, ali aktivacija NF-kB, procijenjena kao fosforilacija p65, bila je veća (16- puta) u mg53 / UUO bubrega od WT UUO bubrega (2- puta) u usporedbi s lažno operiranim životinjama (Slika 3a). Analizirali smo relativne razine RNK transformirajućeg čimbenika rasta b1 (TGF-b1), inhibitora aktivatora plazminogena -1 (PAI-1) i kolagena tipa I alfa 1 (Col1a1) u začepljenom bubregu.40 Mi otkrili su niske razine ekspresije gena u lažnih životinja i sličnu indukciju (TGF-b1, w10 puta; PAI-1, w40 puta; Col1a1, w40 puta) u UUO bubregu iz WT i mg53 / (Slika 3b). Kako bi se ispitala prostorna distribucija MG53 u korteksu bubrega u normalnim uvjetima, analizirane su frakcije bubrežnog tkiva. Redovito smo dobivali 10-put više ukupnog proteina citosola od ukupnog ekstrahiranog nuklearnog proteina. Razine t-p65 bile su usporedive u citosolnoj frakciji između WT i mg53-/- miševa, ali su bile veće u nuklearnoj frakciji mg53-/- miševa (Slika 3c). MG53 je otkriven u frakciji citosola (s tubulinom kao markerom citosola). Neočekivano, značajna količina MG53 otkrivena je u nuklearnoj frakciji (s histonom H3 kao markerom nuklearne frakcije).

Kako bismo potvrdili ovaj nalaz, također smo ispitali lokalizaciju MG53 u frakcijama skeletnih mišića (dodatna slika S2). Reproducirali smo naše prethodne studije u kojima se MG53 lokalizirao na citosol i sarkolemalnu membranu (natrij-kalij adenozin trifosfataza kao marker frakcije membrane)22,23,25, ali je također detektirao obogaćeni nuklearni MG53 iz skeletnih mišića.

MG53 stupa u interakciju s p65 radi kontrole transkripcijske aktivnosti izazvane faktorom nekroze tumora-a. Kako bismo potvrdili naše rezultate frakcioniranja tkiva, proveli smo sljedeća imunohistokemijska istraživanja. U kultiviranim WT proksimalnim tubularnim epitelnim stanicama, p65 je pronađen uglavnom u citosolu, ali lokaliziran na jezgri u odsutnosti MG53 (Slika 4a). Kada su te stanice tretirane LPS-om (5 mg) tijekom 8 sati, izlučivanje proupalnih citokina bilo je značajno veće u mg53/stanici nego u WT stanicama (Slika 4b).

Budući da ovi podaci sugeriraju da MG53 može djelovati s p65 kako bi regulirao ekspresiju upalnih citokina, izravna interakcija između p65 i MG53 procijenjena je testovima koimunoprecipitacije korištenjem HEK293 stanica kotransficiranih s Flag-p65 i HA-MG53. Pokazali smo slabu interakciju (slika 4c). Kotransfekcija plazmida GFP-p65 i RFP-MG53 i konfokalna analiza potvrdile su kolokalizaciju p65 i MG53 (Slika 4d). Zatim smo kvantificirali utječe li MG53 na transkripcijsku aktivnost NF-kB (p65) nakon stimulacije TNF-om mjerenjem aktivnosti luciferaze iz stabilne NF-kB/293-GFP-Luc transkripcijske reporterske stanične linije koja je privremeno transficirana bilo kojim pHM6 vektorom ili HA-MG53. Reporterske stanice sadrže transduciran reporter luciferaze krijesnice za ekspresiju lentivirusa kojeg pokreće minimalni promotor citomegalovirusa u kombinaciji s 4 kopije konsenzusnih NF-kB transkripcijskih odgovornih elemenata (kB mjesto) uzvodno. U nedostatku TNF-a, otkrivena je vrlo niska intrinzična aktivnost luciferaze u reporterskim stanicama koje eksprimiraju proteine ​​MG53. MG53 potisnuo je transkripcijsku aktivnost NF-kB (p65) izazvanu TNF-a za oko 40 posto (Slika 4e).

Prekomjerna ekspresija MG53 spriječila je nuklearnu translokaciju NF-kB p65 nakon liječenja TNF-a NF-kB p65 se translocirao u jezgru nakon liječenja TNF-a u epitelu proksimalnog tubula bubrega.41 Istražiti može li liječenje MG53 oslabiti nuklearnu translokaciju NF-kB p65 nakon stimulacije TNF-a, prekomjerno smo eksprimirali MG53 u HKC-8 stanicama putem DOX-ovisne Ad-tPA-MG53 virusne transdukcije ili tretmanom s rekombinantnim ljudskim MG53 (rhMG53). Upotrebom MG53-specifičnog monoklonskog antitijela, nakon indukcije ovisne o DOX-u, MG53 je otkriven imunoblotingom. MG53 je bio prisutan na vrlo visokoj razini u stanicama HKC-8 transduciranim s Ad-tPA-MG53,

ekvivalentno 1 ng rhMG53/mg staničnog lizata. Nasuprot tome, HKC-8 je preuzeo i eksprimirao mnogo manju količinu rhMG53 (Slika 5a). Preuzimanje FL fluorescentno obilježenog rhMG53 pomoću HKC-8 potvrđeno je konfokalnom mikroskopijom (dodatna slika S3). Nakon tretmana TNF-a, vrijeme do vršne aktivacije p65 bilo je 15 do 30 minuta (Slika 5b). Pod bazalnim uvjetima, NF-kB p65 nalazio se uglavnom u citosolu, a prekomjerna ekspresija MG53 to nije promijenila (Slika 5c i d). Međutim, nakon stimulacije TNF-a, p65 se translocirao u jezgre u HKC-8 stanicama koje ne eksprimiraju prekomjerno MG53. Za usporedbu, nuklearna translokacija p65 pala je za 33 posto (stanice kojima je dat rhMG53) do 50 posto (transducirane stanice koje su dobile DOX) u stanicama s prekomjernom ekspresijom MG53 (Slika 5c i d).

Adoptivni prijenos konstruiranih RAW stanica u UUOmouse model izveden je s 1 - 106 stanicama primijenjenim injekcijom u repnu venu odmah nakon operacije UUO. Miševi su nasumično podijeljeni u skupinu koja je dobivala normalnu vodu za piće (-DOX) i skupinu koja je dobivala DOX (2 mg/ml) u vodi za piće. UUO miševi su primali RAW svaki drugi dan za ukupno 4 injekcije. Bubrezi su sakupljeni 7 dana nakon operacije.

Miševi kojima je ubrizgan projektirani RAW nakon čega je uslijedila indukcija DOX-a pokazali su značajno smanjenu (za 30 posto) bubrežnu fibrozu u usporedbi s onima koji nisu primili stanice ili onima kojima su ubrizgane modificirane RAW stanice, ali bez indukcije Dox-a (66 posto fibrotičnog područja; slika 6a i b).

Samo je mala populacija RAW/Ad-tPA-MG53 preživjela nadzor retikuloendotelnog sustava do kraja eksperimenata. Imunohistokemijsko bojenje potvrdilo je da je liječenjem DOX-om izazvano RAW posredovano izražavanje MG53 u bubregu (Slika 6c). Zanimljivo je da su UUO bubrezi miševa koji su primili RAW i MG53 inducirani s DOX-om pokazali niži omjer p-65/t-p65 (za oko 40 posto) od onih koji ili nisu primili RAW ili onih koji su primili RAW bez DOX-a (Slika 6d i e). Snižena razina p-p65 potvrđena je imunohistokemijskim bojenjem p-p65 (S536) UUO bubrega (slika 6f). Smatramo da bi cirkulirajući MG53 koji isporučuje Raw/Ad-tPA-MG53/þDOX i unos stanicama proksimalnih tubula bubrega mogao sudjelovati u smanjenju p-p65 (S536) i smanjenju UUO upale bubrega. U usporedbi s bubrezima koji sadrže samo UUO, ekspresija TGF-b1, PAI- 1 i Col1a1 bila je značajno povećana u UUO bubrezima miševa kojima je infundiran RAW bez DOX-a (bez indukcije MG53). Povećanje ovih profibrotičkih gena moglo bi se pripisati indukciji snažne reakcije alografta iz stanica koje su dobile infuziju u imunokompetentne miševe. Međutim, UUO bubrezi iz miševa kojima je dat infuziju RAW i DOX (indukcija MG53) iskazali su znatno niži (60 posto –72 posto smanjenja) PAI-1 i relativno niže razine TGF-b1 i Col1a1 od miševa bez DOX tretmana (Slika 6g).

Sustavna primjena rhMG53 ublažava aktivaciju NF-kB i razvoj fibroze kod miševa podvrgnutih UUO

Testirali smo pokazuje li rhMG53 sličan antifibrotski učinak kao ranije opisana terapija RAW stanica. Naši prijašnji farmakokinetički podaci ukazivali su na kratko vrijeme poluživota u cirkulaciji (oko 90 minuta u glodavaca) rhMG53.42 Miševi su podnosili kroničnu primjenu od 2 do 6 mg/kg

rhMG5326,37 pa je korištena strategija primjene prikazana na slici 7a. UUO miševima nasumično je davan nosač (fiziološka otopina) ili rhMG53 (2 mg/kg) dnevno tijekom prvih 7 dana nakon operacije, a zatim svaki drugi dan dok nisu ubijeni 12. dana. Lažni i kontralateralni bubrezi pokazali su približno jednak t-p65 i razine ekspresije fibronektina, s neznatno povišenim razinama p-p65 u kontralateralnim bubrezima u usporedbi s lažnim bubrezima. Nakon UUO, t-p65 bubrega je povećan. U usporedbi sa životinjama liječenim fiziološkom otopinom, omjer p-65/t-p65 u UUO bubrezima životinja liječenih rhMG53- smanjen je za oko 37 posto, dok se IkBa povećao za oko 27 posto (Slika 7b i c). Dodatno, fibronektin se smanjio za oko 33 posto (Slika 7b i c). Imunohistokemija je potvrdila da je rhMG53 bio prisutan u UUO bubrezima nakon tretmana (Slika 7d). Ukupna fibroza smanjena je u bubrezima liječenim rhMG53-UUO (Slika 7e). Međutim, RNA ekspresija TGF-b1, PAI-1 i Col1a1 bila je slična kod miševa liječenih fiziološkom otopinom ili rhMG53 (Slika 7f).

cistanche je učinkovit u liječenju disfunkcije bubrega

RASPRAVA

MG53 je TRIM protein obogaćen mišićima koji je prvobitno identificiran kao istaknuta komponenta strojeva za popravak plazma membrane.22,26,42,43 Međutim, djelovanje MG53 nije ograničeno na skeletne mišiće, a MG53 se može osloboditi u cirkulaciju kao miokin.32 Prethodno smo pokazali da MG53 može kontrolirati upalu tijekom oštećenja tkiva u udaljenim organima.27,29,33,35–37 Ovo istraživanje proširuje opseg zaštite organa posredovane MG53-na bubreg. Zaključujemo da MG53 može ublažiti intrarenalnu upalu i fibrozu bubrega blokiranjem citokinima izazvane aktivacije proupalnog i profibrotičnog transkripcijskog faktora NF-kB. Ovaj se zaključak temelji na sljedećim opažanjima: (i) genetska delecija MG53 u normalnih miševa.

rezultiralo je smanjenjem funkcije bubrega kako su miševi starili, što je bilo popraćeno povećanjem fibroze bubrega i infiltracijom bubrega leukocitima i makrofagima; (ii) u mišjem UUO modelu ozljede bubrega, začepljeni bubrezi miševa s nedostatkom MG53- pokazali su više fibroze i upale nego miševi s MG53-punom količinom; (iii) Proizvodnja TNF-a i interleukina-6proksimalnih tubularnih epitelnih stanica tretiranih LPS-om oslabljena je u prisutnosti MG53; (iv) liječenje ili prekomjerna ekspresija MG53 u proksimalnoj tubularnoj epitelnoj staničnoj liniji smanjila je TNFa-induciranu aktivaciju NF-kB blokiranjem nuklearne translokacije p65 komponente -kB (nađeno je da se MG53 veže izravno na p65, iako slabo); i (v) fosforilacija p65, neophodan korak u aktivaciji NF-kB, smanjena je u začepljenim bubrezima UUO miševa tretiranih s rekombinantnim MG53 induciranim na prekomjernu ekspresiju MG53 u makrofazima. Nadalje, inhibitor aktivacije NF-kB, IkBa, povećan je u začepljenim bubrezima UUO miševa kojima je ubrizgan rekombinantni MG53.

Genetska delecija MG53 kod normalnih miševa bila je dopuštena za štetne učinke starenja na bubrege. Ovo sugerira da prisutnost endogenog MG53 osigurava osnovnu razinu zaštite tijekom starenja. Slično, gubitak endogenog MG53 pogoršao je AKI zbog opstrukcije. UUO bubreg akumulirao je MG53, vjerojatno odražavajući udaljenu aktivnost miokina iz skeletnih mišića. Ostaje nejasno kako se mišić MG53 može regrutirati u bubreg tijekom ozljede; međutim, oštećeni bubreg često razvija hipoksiju i podvrgava se oksidativnom stresu,^44,45signale koji bi mogli poslužiti za regrutiranje MG53. Ako je tako, ova osovina "mišić-bubreg-imunološka stanica" mogla bi se iskoristiti za ublažavanje oštećenja bubrega.46 Alternativno, bubrežne stanice izražavaju niske razine MG53 na početku,²⁶i, tijekom akutne ili kronične ozljede, proizvodnja MG53 mogla bi se regulirati prema gore.

NF-kB je istaknuti transkripcijski pokretač upale i fifibroze kod oštećenja bubrega i starenja.^14,17,47,48Bili smo ponukani da istražimo mogu li učinci MG53 biti posredovani preko NF-kB jer prisutnost MG53 u nuklearnom odjeljku bubrežnih homogenata ukazuje na potencijal transkripcijske interferencije. Nuklearna lokalizacija MG53 nije bez presedana. U transgenskom modelu prekomjerne ekspresije miokardijalnog MG53, nuklearni MG53 regulirao je ekspresiju receptora alfa aktiviranog proliferatorom peroksisoma na transkripcijskoj razini i utjecao na srčani metabolizam lipida.49 Štoviše, nedavno smo pokazali da rhMG53 potiskuje aktivaciju NF-kB kako bi ublažio zatajenje srca povezano sa starenjem smanjenjem proupalnih citokina, apoptoze i oksidativnog stresa u ostarjelim kardiomiocitima.³⁷

Molekularni mehanizam kako MG53 modulira nuklearnu/citoplazmatsku mobilizaciju p65 ostaje nejasan. MG53 ne sadrži nuklearni lokalizacijski signal, ali sadrži 3 navodna N-terminalna nuklearna izvozna signala bogata leucinom, motiv koji prepoznaje nuklearni izvozni proteinski exportin.⁵⁰Izravna interakcija između MG53 i p65 bila je prilično slaba kao jedini ili glavni razorni učinak MG53 na aktivaciju NF-kB. Iako se čini da MG53 utječe na dinamičko nukleocitoplazmatsko kretanje kritičnih komponenti NF-kB, točne mehanizme tek treba utvrditi.

Čini se da je kritični ishod renoprotekcije posredovane MG{0}}om smanjenje fibroznog preoblikovanja kroz slabljenje upale posredovane NF-kB. Fifibroza bubrega složen je proces koji uključuje patološko taloženje različitih ECM proteina.51 Čini se da MG53 ima jasne učinke na ECM protein fibronektin. Fibronektin se povećao u UUO bubrezima s manjkom MG53 i smanjio u UUO miševima tretiranim s MG53. Ekspresiju drugih ECM proteina u prisutnosti i odsutnosti MG53 teže je razumjeti. Prethodno smo pokazali da rhMG53 negativno regulira TGF-b1/Smad signalizaciju i potiskuje sintezu ECM proteina u in vitro studiji.31 In vivo, transkripti TGF b1, PAI-1 i Col1a1 nisu se povećali u UUO bubrezima od mg53 / životinje s nedostatkom. Ovi transkripti su se smanjili kod UUO životinja induciranih na prekomjernu ekspresiju MG53 primjenom virusno induciranog miša

makrofaga, ali kada je dat rekombinantni MG53, nije uočen nikakav učinak. Ovo jednostavno može biti slučaj dovoljnog doziranja jer su postignute intrarenalne razine MG53 bile daleko veće kod životinja kojima je dan vektor makrofaga za razliku od rekombinantnog MG53. Osim toga, razine proteina nisu izmjerene, a posttranskripcijski događaji mogli su modificirati ECM u UUO. Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se razjasnila nova uloga MG53 u modulaciji specifičnih ECM proteina. Zaključno, ova je studija pokazala da miokin može pomoći u reguliranju osnovne upale u udaljenom organu poput bubrega i, u slučaju ozljede bubrega, može pomoći u ublažavanju i kontroli upale. Slika 8 prikazuje radni model uloge MG53 u renoprotekciji. Tijekom stimulacije molekularnih uzoraka povezanih s oštećenjem (DAMP, poput TNF-a) i molekularnih uzoraka povezanih s patogenom (PAMP, poput LPS) i ishemijskog stresa, NF-kB signalosom se aktivira u bubregu. MG53 štiti bubreg inhibicijom fosforilacije i aktivacije NF-kB signalizacije, stabilizacijom IkBa i smanjenjem nuklearne mobilizacije p65, blokirajući aktivaciju proupalnih programa. Iako endogeni MG53 može posredovati u ovim učincima, predlažemo da se terapijskim korištenjem MG53 može pružiti snažnija zaštita, što je izvedivo na temelju sposobnosti egzogenog MG53 da smanji ozljede u UUO. Daljnja istraživanja su opravdana kako bi se razumjelo kako se ovaj miokin može klinički iskoristiti.

korist od cistanche: štiti jetru i protiv fibroze

RAZOTKRIVANJE

JM ima vlasnički udio u TRIM-edicine, Inc., koja razvija rhMG53 za liječenje ljudskih bolesti. Patente o upotrebi MG53 drže Sveučilište Rutgers i Državno sveučilište Ohio. Svi ostali autori izjavili su da nemaju suprotstavljenih interesa.

ZAHVALA

Ovaj rad podržali su Nacionalni instituti za zdravlje (NIH) R01-DK106394 (JM, BHR i P-HL) i NIH R01-AG062896 (P-HL i BHR). Ovaj projekt također je djelomično podržan od strane intramural Lockwood fonda sa Državnog sveučilišta Ohio (P-HL) i nagrade Nacionalnog centra za napredne translacijske znanosti (NCATS; P-HL, broj nagrade UL1TR002733). Sadržaj je isključivo odgovornost autora i ne predstavlja nužno službena stajališta NCATS-a ili NIH-a.

DOPRINOSI AUTORASHL,

PD, P-HL, JM i BHR su osmislili i/ili dizajnirali studije; HL, PD, P-HL, ZL i XZ proveli su eksperimente, prikupili podatke i izvršili analizu podataka; PD, P-HL i BHR interpretirali su rezultate; a P-HL i BHR izradili su, revidirali i odobrili rukopis. Svi su autori pročitali i odobrili konačnu verziju.

DOPUNSKI MATERIJAL

Dopunska datoteka (PDF) Dopunske metode.

Tablica S1.Primer sekvence. Slika S1. mg53-/- miševi pokazuju pojačano taloženje ECM proteina. Bubrežna tkiva odgovarajuće dobi (10 mjeseci) divljeg tipa (WT) i mg53- /- obojena su 40 6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI; plavo, lijeve ploče), a- aktin glatkih mišića (SMA; zelene, druge ploče), fibronektin (crvene, treće ploče) i spojene (desne ploče). Šipka ¼ 25 mm. Kvantifikacija područja bubrežne fibroze (n=3 po skupini). Podaci su prikazani kao srednje vrijednosti -SD. Studentov t-test. ***P <>

Slika S2.Raspodjela skeletnog mišića MG53 između jezgre i citoplazme. Skeletni mišići dobiveni iz miševa divljeg tipa (WT) ormg53-/- frakcionirani su i imunoblotirani s prilagođenim anti-MG53 antitijelima (3 mg lizata) i markerima staničnih odjeljaka (20 mg lizata). Natrij-kalij adenozin trifosfataze koriste se kao marker stanične membrane, histon H3 kao nuklearni marker, a tubulin kao marker citosola.

Slika S3.HKC-8 stanice proksimalnih tubula bubrega specifično preuzimaju AlexaFluor 647-označen rhMG53. rhMG53 (Trimedicine) i goveđi serumski albumin (BSA; ThermoFisher Scientific) obilježeni su Alexa Fluor(AF) priborom za označavanje antitijela (Life Technologies) u skladu s protokolom proizvođača. HKC-8 stanice uzgajane su na Delta TPG posudi sa staklenim dnom (Bioptechs Inc.) u Dulbecco modificiranom Eagleovom mediju (DMEM) s 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS) u prisutnosti obilježenih proteina, BSA-AF647 (lijevo ) i rhMG53-AF647 (desno), tijekom 24 sata. Z-stack slike su uzete iz konfokalnog mikroskopa LSM780 (Zeiss). Slike prikazuju ćelije na dnu posuda. Šipka ¼ 25 mm.

Slika S4.Inženjering RAW stanica za posredovanje inducibilnog lučenja MG53. (A) RAW stanice su zaražene s Ad-tPA-MG53 tijekom 24 sata i tretirane bez (doksiciklina [Dox]) ili s Doxom (þDox, 1 mg/ml) tijekom dodatnih 24 sata kako bi se inducirala ekspresija tPA-MG53. Konfokalne slike pokazale su indukciju ekspresije MG53 (antitijela anti-MG53 po narudžbi, crvene, donje ploče) iz RAW stanica sličnih makrofagu (bojenje F4/80, zeleno, gornje ploče). Šipke ¼ 25 mm. (B, C) Western blot analiza staničnih lizata (u količini od 0.6, 3 i 6 mg) za induciranu ekspresiju tPA-MG53 i MG53 iz zaraženih RAW stanica (B) i odgovarajuće kulture koncentrati medija (u volumenima od 2, 5 i 10ml) (C). Različite količine rhMG53 (u količini od 0.2, 1, 0.05 i 0.025 ng) su napunjene kao standardi. Mw, markeri molekularne težine.