Potencijal neohesperidina protiv starenja i njegovi sinergistički učinci 2. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

2.4. In vitro antioksidacijska aktivnost neohesperidina bila je relativno slaba

Dostupne su mnoge metode za mjerenje in vitro antioksidativnog kapaciteta i većina istraživača primjenjuje jedan ili više testova budući da svaka metoda mjeri različite antioksidativne karakteristike spoja [32]. U ovoj studiji upotrijebili smo tri metode za određivanje antioksidativnog kapaciteta uključujući DPPH, ABTS i FRAP testove. Kompozitni indeks antioksidativne snage (APCI) definiran je za opisivanje i procjenu ukupnog in vitro antioksidativnog kapaciteta testiranih spojeva i njihovih kombinacija. Jednadžbe linearne regresije triju testova navedene su u tablici 1. A svi povezani podaci prikazani su u tablici 2. U međuvremenu, APCI je ucrtan na slici 4B. Iz ovih rezultata mogli smo vidjeti da neohesperidin ima relativno slab in vitro antioksidativni kapacitet; ovo je impliciralo da funkcija proširenja CLS neohesperidina nije ovisila o njegovoj in vitro antioksidativnoj aktivnosti. Međutim, s relativno visokom in vitro antioksidativnom aktivnošću, CD BCD je produžio CLS kvasca BY4742. Sve u svemu, ne možemo predvidjeti sposobnost produljenja CLS-a spoja samo na temelju njegove antioksidativne aktivnosti.

A: naringin, B: hesperidin, C: hesperetin, D: neohesperidin, the concentration of A, B, Cand Dis luM. APCI=>(svaka vrijednost uzorka/najveća vrijednost uzorka u toj metodi)/broj metoda. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM (n {{0}}) i uspoređeni korištenjem jednosmjerne ANOVA Sidakovog testa višestrukih usporedbi pri p < 0,05="" pomoću="" graphpad="" prism="" 7.00.="" različita="" slova="" (a,="" b,="" c,="" d,="" e,="" f,g,="" h,="" i,="" j,="" k)="" iza="" podataka="" označavaju="" vrijednosti="" u="" istom="" stupcu="" sa="" značajnim="">

Kliknite ovdje da saznate više

2.5. Neohesperidin nije mogao usporiti varijacije izvanstanične acidifikacije kvasca BY4742

Važni parametri uključuju sastav medija za rast kao i pH vrijednost. Pokazalo se da sastav medija za rast i pH vrijednost imaju veliki utjecaj na CLS S.cerevisiae[33]. Učinci pH na CLS pupajućeg kvasca istraživani su prethodnim studijama, a rezultati ukazuju na mehanizam toksičnosti octene kiseline povezan s indukcijom signalnih putova rasta i oksidativnog stresa u kvascu [34]. Kako bismo saznali učinak četiri flavonoidna spoja na varijacije izvanstaničnog zakiseljavanja kultura kvasca, detektirali smo pH vrijednosti svakih pet minuta pomoću pH metra.Ekstrakt Cistanche protiv zračenjaNa slici 5, 10 uM naringina očito je usporilo varijaciju izvanstanične acidifikacije kvasca BY4742 u različitim fazama starenja, dok ostala tri flavonoidna spoja nisu značajno utjecala na nju pri istoj koncentraciji u usporedbi s kontrolnim skupinama.

Slika 5. Varijacije medija kulture nakon pupajućeg kvasca BY4742 tretiranog s četiri flavonoidna spoja pri 10 µM. Pokus je izveden najmanje u tri primjerka. ∶ Naringin, B: hesperidin, C: hesperetin, D: neohesperidin.

3. Rasprava

Prethodne studije su izvijestile da je neohesperidin pokazao različite funkcije povezane sa usporavanjem starenja, kao što su neuroprotektivni učinak [15], aktivnosti uklanjanja ROS-a i protuupalne aktivnosti [35], slabljenje smanjenja potencijala mitohondrijske membrane i povećanje kaspaze{ {5}} aktivnost izazvana H2O2 [16], i aktivnost koja inducira staničnu apoptozu [21]. Sve ove funkcije postavile su dobre temelje za rezultat da je neohesperidin povećao CLS pupajućeg kvasca BY4742 ovdje. Iznenađujuće je da je neohesperidin značajno produžio CLS samo pri najnižoj ispitanoj koncentraciji. Izvješće Craker, et al. također je pokazala nižu koncentraciju auksina (10-6 IAA) koji potiče ekstruziju protona. Ekstruziju protona pod visokom koncentracijom auksina (10-4 IAA) inhibira etilen induciran auksinom [36].cistanche herbaU našim je istraživanjima potvrđeno djelovanje neohesperidina na uklanjanje ROS-a. In vitro antioksidativni kapacitet neohesperidina bio je relativno slab, što objašnjava zašto CLSextension funkcija neohesperidina ne ovisi o njegovoj in vitro antioksidativnoj aktivnosti. Međutim, kombinacije CD i BCD imale su visoku antioksidacijsku aktivnost in vitro i povećale CLS kvasca (Slika 3B). Slaba korelacija ROS-a i antioksidativne aktivnosti može biti uzrokovana metodom koju smo koristili za analizu antioksidativne aktivnosti. Metoda antioksidativne aktivnosti pokušala je reagirati s dvostrukom vezom na C2-C3 i/ili hidroksilnom skupinom na C3 na C prstenu flajonoida. U Areias et al. rezultati snažno upućuju na to da veća antioksidacijska aktivnost flavonoida nije povezana s prisutnošću dvostruke veze na C 2-C3 i/ili hidroksilne skupine na C3 na C prstenu, već može ovisiti o sposobnost inhibicije proizvodnje reaktivnih kisikovih vrsta za hidrofobnu interakciju s membranama [37]. Istodobno, veliki broj studija pokazao je da neki antioksidansi doista imaju funkciju produljenja životnog vijeka, ali su njihovi specifični mehanizmi djelovanja složeni. Pokazalo se da samo neki antioksidansi pokazuju učinke protiv starenja koji su povezani s izravnim uklanjanjem slobodnih radikala i ROS-a. Ali učinci drugih antioksidansa na produljenje života na modelnim organizmima nisu bili ograničeni na izravnu antioksidacijsku funkciju, već također uključuju regulaciju ekspresije gena povezane sa stresom i indukciju toksičnih stimulacijskih učinaka [38]. Stoga je nemoguće predvidjeti sposobnost tvari da produži CLS kvasca na temelju njezine antioksidativne aktivnosti. Iako nismo testirali rezultat na drugim sojevima, ponudio je informacije drugim istraživačima i znanstvenicima za potvrdu rezultata na drugim sojevima i modelnim organizmima.

Cistanche može spriječiti starenje

Mnogi stanični procesi i vanjski čimbenici negativno utječu na kronološki životni vijek kvasca, uključujući srednje zakiseljavanje i oksidativni stres [39]. Jedna od ranih promjena koje se događaju u stanicama kvasca uzgojenim u mediju koji sadrži 2 posto glukoze (dekstroze) je proizvodnja octene kiseline i zakiseljavanje medija, za što se pokazalo da utječe na kronološko starenje [38]. Puferiranje medija na pH 6-7 sprječava zakiseljavanje i produljuje kronološki životni vijek [10,39-41]. Osim toga, Saccharomyces cerevisiae može iskoristiti octenu kiselinu za rast i metabolizam unatoč potencijalnoj toksičnosti [42]. 10 uM neohesperidina, hesperidina i hesperetina održalo je trend varijacije izvanstaničnih pH vrijednosti u usporedbi s kontrolom (Slika 5). Međutim, 10 uM naringina očito je usporilo varijacije izvanstanične acidifikacije (Slika 5). Pri ovoj koncentraciji, CLS kvasca BY4742 tretiran je neohesperidinom, hesperidin i hesperetin bili su gotovo isti kao i kontrolna skupina.

Povećano uklanjanje ROS-a ima izražene učinke na CLS u kvascima, ali razlog ostaje neriješen problem [33]. Starenje i povezane bolesti posljedica su oštećenja staničnih makromolekula uzrokovanog slobodnim radikalima i njihove nesposobnosti da uravnoteže endogene antioksidativne obrambene mehanizme [43]. Međutim, podaci su pokazali da ROS također može imati pozitivnu ulogu u induciranju gena odgovora na stres (hormeza) [43-46].

Štoviše, novija otkrića sugeriraju da su i vrsta ROS-a i vrijeme kada se pojavljuju važni za produljenje životnog vijeka S.cerevisiae [47-49], što ilustrira složenu ulogu ROS-a u starenju kvasca. Graziano i sur. [47] izvijestili su da neohesperidin smanjuje stvaranje ROS-a u ljudskim keratinocitima.cistanche rast penisaNohara, et al. nedavno je otkrio da nobiletin (jedan od flavonoida u citrusima) jača mitohondrijsko disanje u skeletnim mišićima za promicanje zdravog starenja protiv metaboličkih izazova. Proizvodnja ROS-a značajno je potisnuta primjenom nobiletina na način ovisan o dozi [50]. Slike 3B i 4A pokazuju da su D i CD povećali CLS kvasca BY4742 i smanjili unutarstanični sadržaj ROS. No, za ABD i BCD produžili su CLS dok su povećali unutarstanični ROS. Ovaj je rezultat bio u skladu s Wuovim 51]. Dakle, nije bilo određenog pozitivnog ili negativnog odnosa između aktivnosti uklanjanja ROS-a spojeva i njihovih učinaka na životni vijek, a to je također bilo u skladu sa zamršenom ulogom ROS-a u starenju kvasca.

Na slici 3A, stope preživljavanja kvasca BY4742 pod tretmanom različitim spojevima i njihovim kombinacijama od 2. do 20. dana nisu se postupno smanjivale. Predstavljaju dvostruke vrhove. To se također može naći u rezultatu Wu et al. (2014). Prvih nekoliko dana stope preživljavanja bile su relativno visoke. To se može objasniti dovoljnom količinom hranjivih tvari i niskim pritiskom preživljavanja tijekom tog vremena. Kako je vrijeme prolazilo, valley points su se pojavile na vrlo kratko vrijeme jer je hranjivost bila slabija. Zatim su se opet pojavili vrhovi. Ovaj bi fenomen mogao pripisati uspjeh metabolizmu druge hranjive tvari koja je ublažila pritisak na preživljavanje.

Tiho al. [36] izvijestili su da je antioksidativna aktivnost kombinacije antioksidansne smjese/spoja bila učinkovitija od pojedinačnog spoja. U našem eksperimentu, kombinacije AB, AC, CD, ABC i BCD imale su jači antioksidativni kapacitet od bilo koje pojedinačne tvari koja im odgovara.dobrobiti cistanche salseNa temelju naših opažanja moglo bi se zaključiti da flavonoidi prisutni u smjesi mogu međusobno djelovati, a njihove interakcije mogu utjecati na ukupni antioksidativni kapacitet otopine (Slika 4B). Iako smo pokazali da četiri interakcije flavonoida pokreću sinergističke ili antagonističke učinke za snagu antioksidansa, postoje druge kombinacije flavonoida koje zahtijevaju detaljniju studiju kako bi se bolje razumjeli mehanizmi uključeni u te interakcije. Lutchman i sur. [52] izvijestili su o biljnim ekstraktima koji povećavaju CLS kvasca. A autofagija potaknuta smanjenim TORC1 signaliziranjem kritično je važna za dugi CLS[10]. Pozivajući se na te studije, možemo istražiti način na koji spojevi ostvaruju svoj učinak u budućim studijama.

4. Materijali i metode

4.1.Materijali

Divlji tip soja S. cerevisiae BY4742(ATCC⑧,201389TM)(Mata his3A1 leu2△0 lys2A0 ura3A0) dobiven je iz American Type Culture Collection (Manassas, VA, SAD). Kultura referentnog soja kvasca podijeljena je u 10 uL i pohranjena na -80 stupnjeva. Sve L-aminokiseline, dušična baza kvasca bez aminokiselina (YNB), amonijev sulfat, pepton, agar i ekstrakt kvasca, H2DCFDA, 2,4,6-tripiridil-s-triazin (TPTZ),2, 2'-i-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina)(ABTS),1,1-difenil-2-pikrilhidrazil(DPPH), dimetil sulfoksid (DMSO), neohesperidin , naringin, hesperidin i hesperetin kupljeni su od Sigma-Aldrich (Šangaj, Kina). YPDBroth, YPD i druge kemikalije bile su od Solebo Biotech Co., Ltd. (Peking, Kina). Polistirenske mikroploče 96-jažica s ravnim dnom kupljene su od Corning Incorporated (Kennebunk, ME, SAD).

4.2. Životni vijek i Grozoth analiza stanica kvasca

Određivanje kronološkog životnog vijeka (CLS) kvasca provedeno je prema metodi Wu i sur. [25] uz umjerenu preinaku kako slijedi. Ukratko, stanice kvasca pripremljene su prijenosom šaranog soja iz smrznutih temeljaca na ploče YPD agara (0.5 posto ekstrakta kvasca/1 posto peptona/2 posto dekstroze/1,4 posto agara). Nakon inkubacije stanica na 30 stupnjeva tijekom 2 dana, jedna kolonija je odabrana i inokulirana u 1.{{10}}mL YPD tekućeg medija (1 posto ekstrakta kvasca/2 posto peptona /2 posto dekstroze) u 10-mL steriliziranu epruvetu za centrifugiranje (okruglo dno) i uzgojeno na 30 stupnja 2 dana u ravnom inkubatoru na 200 pm. 2--dnevna YPD kultura razrijeđena je autoklaviranom 18 Qm Milli-Q vodom (1:10) i pohranjena u hladnjaku na 4 stupnja 2 dana. Nakon 2-dnevne inkubacije na 4 stupnja, 5 μL （≈1×10* stanica） razrijeđene kulture preneseno je u 993 mikrolitra sintetski definiranog (SD) medija (dodatna tablica S1, [51]) i održavano na 30 stupnjeva, 200 okretaja u minuti za cijeli eksperiment. Spojevi u DMSO s nekoliko koncentracija （2,0 μL） dodani su pri početnoj inokulaciji （0 h）. Svaki eksperiment je izveden najmanje u tri primjerka. Stanične kulture su inkubirane na 30 stupnjeva bez zamjene medija za starenje tijekom eksperimenta. Nakon 2 dana kulture u mediju za starenje, stanice su dosegle stacionarnu fazu i tada je uzeta prva točka starosti. Sljedeće dobne točke uzimane su svakih 2-4 dana. Za svaku dobnu točku, 5,0 μL miješane kulture pipetirano je u svaku jažicu 96-jažice mikropločice s ravnim dnom. Devedeset pet mikrolitara YPD medija je zatim dodano u svaku jažicu. Populacija stanica praćena je čitačem mikropločica (Varioskan Flash; Thermo Scientific, Waltham MA, SAD) bilježenjem OD660 svakih 10 minuta tijekom 24 sata.

Stopa preživljavanja izračunata je na sljedeći način[25]. Gdje je tOD=0.3,2dan vrijeme kada OD vrijednost dobne točke 2. dana dosegne 0.3 u krivuljama rasta. Početna dobna točka (2. dan) definirana je kao 100-postotna sposobnost preživljavanja, a postotak relativnog preživljavanja svake sljedeće dobne točke može se izračunati na sljedeći način:

Integral preživljavanja (Sl) za svaku jažicu definiran je kao površina ispod krivulje preživljavanja (AUC) i može se procijeniti formulom:

gdje je dan dobna točka, kao što su dani2,4,6,8,10,12,14,16,18i20.

4.3. Intracelularni testovi sposobnosti čišćenja ROS-a

Za kvantificiranje razine intracelularnih reaktivnih vrsta kisika (ROS) stanica kvasca uzgojenih u standardnom SD mediju sa/bez četiri spoja, metoda opisana u Wu et al. [51] je spomenuto. Naime, 2 μL ROS sonde H2DCFDA iz svježe 5-mM osnovne otopine u DMSO dodano je u 1.0 mL kulture kvasca za starenje (2. dan) na 3{{10 }} stupnja za 1 h. Kultura je zatim dva puta isprana u sterilnoj destiliranoj vodi i suspendirana u 1,0 mL 50 mM Tris/Cl pufera (pH 7,5). Dodano je 20 mikrolitara kloroforma i 10 μL 0,1 posto （w/o）natrijevog dodecil sulfata （SDS）, a stanice su inkubirane na 200 okretaja u minuti 30 minuta kako bi se omogućilo difundiranje boje. Kultura je centrifugirana na 5000 okretaja u minuti tijekom 5 minuta, a fluorescencija supernatanta je izmjerena upotrebom čitača mikropločica uz ekscitaciju na 480 nm i emisiju na 520 nm.

4.4. Ispitivanje antioksidativne aktivnosti

U ovoj studiji, DPPH, FRAP i ABTS testovi korišteni su za in vitro procjenu antioksidativnog kapaciteta. DPPH test je proveden u skladu s metodom koju su opisali Barreca i sur. [53]. Alikvot svakog uzorka (0.5 mL) je pomiješan sa 75 uM (3.5 mL) DPPH u metanolu do konačnog volumena od 4.0 mL nakon reakcije 30 min bez svjetla, detektirana je apsorpcija smjese na valnoj duljini od 517 nm. Postotak inhibicije aktivnosti uklanjanja radikala bio je DPPH vrijednost. FRAP test je proveden prema Hunger et al. [54] s nekim izmjenama. Alikvot uzorka od 0.2 mL pomiješan je s 3,8 mL FRAP reagensa (0.3 mol/L acetatni pufer (pH3.6), 10 mmol/L TPTZ otopina, i 20 mmol/L željezovog klorida (FeCl3) pomiješano je (10:1:1, omjer volumena)). Nakon 30 minuta, detektirana je apsorbancija na valnoj duljini od 593 nm. A ABTS test slijedio je metodu Mnb et al. [55] s nekoliko izmjena. Kation radikala ABTS (ABTS· plus) nastao je reakcijom 176 μL otopine kalijevog persulfata （140 mM） i 10 mL vodene otopine ABTS （7 mM） pod uvjetima bez svjetla 12-16 h. Zatim je razrijeđen metanolom do vrijednosti apsorpcije od 0,7±0,02 jedinica na 734 nm. 0,1 mL uzorka dodano je u 4,9 mL ABTS reagensa.cistanche tubulosa doziranje redditApsorpcija je izmjerena na valnoj duljini od 734 nm nakon 10 min reakcije. Sve vrijednosti apsorbancije određene su korištenjem UV-VIS spektrofotometra (PerkinElmer Lambda 25 UV/VIS, Waltham, MA, SAD). Vrijednosti antioksidansa izračunate su metodom standardne krivulje i izražene kao Trolox ekvivalenti (TE mg/g DW).

4.5. Detekcija izvanstaničnog pH

Proces uzgoja kvasca u ranoj fazi bio je gotovo isti kao metoda opisana u dijelu "Životni vijek i analiza rasta stanica kvasca". Konkretna operacija bila je sljedeća. Stanice kvasca pripremljene su prijenosom soja kvasca iz smrznutih temeljnih materijala na YPD agar ploče. Nakon inkubacije stanica na 30 stupnja tijekom 2 dana, jedna kolonija je odabrana i inokulirana u 1.0-mL YPD tekućeg medija u 10-mL steriliziranoj epruveti centrifuge i uzgojena na 30 stupnja 2 dana u ravnom inkubatoru na 200 pm. 2--dnevna YPD kultura razrijeđena je autoklaviranom vodom od 18 mΩ Milli-Qgrade（1∶10）i pohranjena u hladnjaku na 4 stupnja 2 dana. Nakon 2-dnevne inkubacije na 4 stupnja, 10 μL（~2×104 stanica） razrijeđene kulture preneseno je u 1986 μL SD medija i održavano na 30 stupnjeva, 200 okretaja u minuti 2/10/20 dana. Razni spojevi u DMSO（4,0 μL） dodani su u medij do konačne koncentracije od 10 μM pri početnoj inokulaciji (0 h）). Zatim je 1 mL 2/10/20-dan SD kulture dodan u 19 mL svježeg YPD tekućeg medija. pH je testiran svakih pet minuta pomoću pH metra, dok je kvasac uzgajan na 30 stupnjeva C u mućkalici pri 200 okretaja u minuti tijekom cijele detekcije. Svaki eksperiment je izveden najmanje u tri primjerka.

4.6. Analiza podataka

Neobrađeni podaci iz čitača mikropločica izvezeni su u Microsoft Excel 2007 (Redmond, WA, SAD). Iz krivulja rasta može se dobiti održivost kvasca prema prethodnom izvješću [25]. Integral preživljavanja [56] svake stare kulture definiran je kao površina ispod krivulja preživljavanja [25,57]. Podaci su analizirani jednosmjernom analizom varijance (jednosmjerna ANOVA) i izraženi su kao srednje vrijednosti ± standardna pogreška srednje vrijednosti (SEM). Značaj razlike (* str<><0.01;***><0.001;*><0.0001) was="" determined="" using="" sidak's="" multiple="" comparisons="" test.="" graphpad="" prism="" 7(graphpad="" software,="" inc.,="" la="" jolla,="" ca,="" usa)was="" used="" for="" the="">

5. Zaključci

Zaključno, neohesperidin, s relativno visokim kapacitetom za uklanjanje unutarstaničnog ROS-a, pokazao je veliki potencijal u produljenju CLS-a pupajućih kvasaca BY4742 pojedinačno ili sinergistički s hesperetinom. To bi moglo dovesti do novih izbora za liječenje problema starenja budući da je postojao ograničen odnos između CLS-ekstenzije kvasca i testiranih indeksa (npr. sposobnost uklanjanja ROS-a, in vitro antioksidativna aktivnost i izvanstanični pH). Daljnje studije za otkrivanje molekularnih mehanizama ovog fenomena bit će iznimno korisne za sprječavanje starenja. Zbog toga treba imati na umu važnost odabira najbolje kombinacije flavonoida pri osmišljavanju novih dodataka prehrani ili funkcionalne hrane.

Ovaj je članak izvađen iz Molecules 2019, 24, 4093; doi:10.3390/molecules24224093 www.mdpi.com/journal/molecules