Učinkovitost restrikcije kalorija ovisno o dobi na mitohondrijsku biogenezu i oštećenje MtDNA u jetri štakora 2

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

2.4. Učinak starosti i CR na sadržaj i oštećenje mtDNA

Budući da je mitohondrijska dinamika usko povezana s održavanjem mtDNA [16,18], odredili smo sadržaj mtDNA u svih štakora kvantitativnom lančanom reakcijom polimeraze (qPCR) (Slika 8).

Smanjenje sadržaja mtDNA povezano sa starošću pronađeno je u AL-28(-27 posto) i AL-32 štakora (-23 posto) u usporedbi s AL{{ 5}} životinja, dok nije bilo statističke razlike između AL-28 i AL-32 skupina. CR je bio vrlo učinkovit u sprječavanju smanjenja sadržaja mtDNA povezanog sa starošću tek nakon 28 mjeseci, što je dovelo do povećane (plus 19 posto) vrijednosti u skupini koja je primala CR-28 u usporedbi s dobno usklađenom populacijom hranjenom AL-om. Nadalje, nije bilo statističke razlike između vrijednosti AL-18 i one CR-28 skupine. Kao što se vidi za druge markere u ovom radu, CR nije bio toliko učinkovit nakon 32 mjeseca budući da nije bilo razlike između vrijednosti AL-32 i one CR-32 dvojnika. Kako bismo produbili analizu na razini oštećenja mtDNA, qPCR-om smo izmjerili relativni sadržaj "uobičajene delecije" od 4,8 Kb (Slika 9).

Nisu pronađene značajne promjene s dobi niti s CR u relativnom sadržaju delecije od 4,8 Kb u svim testiranim skupinama.

Konačno, pregledali smo tri specifične regije mtDNA na učestalost oksidiranih purina, uglavnom 8-okso-deoksigvanozina (8-oksida), koristeći enzim formamidopirimidin DNA glikozilazu (Fpg) osjetljiv na oksidirane purine. Tri regije obuhvaćale su, redom, petlju pomaka (D-petlja), ishodište replikacije svjetlosnog lanca (Ori-L) i dijelove obje podjedinice NADH dehidrogenaze (ND) 1 i 2 (ND1/ND2)( Slika 10).

Kliknite ovdje da saznate više

Kao što je prikazano na slici 10, postotak pojave 8-oksida bio je značajno različit između skupina štakora u svakoj analiziranoj regiji, iako sa sličnim uzorkom. Post-doc test otkrio je značaj smanjene prisutnosti 8-oksida u CR-28 štakora u usporedbi s obje skupine AL-18 i AL-28 ({{7} } posto CR-28 u odnosu na AL-18 i -43 posto CR-28 u odnosu na AL-28 na D-petlji;-48 posto CR -28 u odnosu na AL-18i-49 posto CR-28vs.Ekstrakt Cistanche protiv zračenjaAL-28 na Ori-L;-54 posto CR-28 u odnosu na AL-18 i -56 posto CR-28 u odnosu na AL{{ 7}} kod ND1/ND2).CR se pokazao učinkovitim u sprječavanju oksidativnog oštećenja mtDNA do 28 mjeseci, dok se učestalost istih oštećenja nije razlikovala između AL-32 i CR-32 štakori. Oksidirani purini otkriveni su već kod AL-18 štakora bez pokazivanja povećanja povezanog sa starošću kod AL-28 životinja. Usporedba između AL-32 grupe i CR-32 nije pokazala značajnu razliku. Uzimajući u obzir vrijednosti specifične regije, zanimljivo je istaknuti da je incidencija D-petlje bila najveća među vrijednostima iz testiranih regija u svakoj skupini, podupirući tako prethodne nalaze koji pokazuju da je ovo područje žarište oksidativnog oštećenja [17,{{ 20}}].

Slika 10. Učestalost oštećenja oksidiranih purina na D-petlji, Ori-L i ND1/ND2 mtDNA regijama u jetri iz AL-18, AL-28, CR-28, AL -32 i CR-32-mjesečni štakori. (A). Stupci su predstavljali podatke dobivene iz dva neovisna pokusa provedena u tri primjerka i analizirana pomoću jednosmjernog ANOVA testa i Tukeyjevog testa višestruke usporedbe. U grafičkom prikazu, podaci su normalizirani u odnosu na vrijednost AL-18 štakora, fiksiran kao 1, i prikazan kao srednja vrijednost i SD.*p<0.05 versus=""><0.05versus al-28="" rats.n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" (a)d-loop;(b)ori-l;(c)="" nd1/nd2.(b).representative="" gel="" of="" formamidopyrimidine="" dna="" glycosylase="" (fpg)-treated="" and="" untreated="" total="" dna="" from="" one="" cr-28="" and="" one="" al-28="" rat;="" 5="" ng="" total="" dna="" were="" amplified="" using="" the="" d-loop="" primers.="">cistanche herbaAlikvot svake PCR amplifikacije nanesen je na gel obojen agaroznim etidijevim bromidom i analiziran na intenzitete vrpci.

Svi prijavljeni nalazi o učinkovitosti CR-a u skupinama iste dobi sažeti su u tablici 1.

3. Rasprava

U dugotrajnoj potrazi za pristupima koji bi se mogli suprotstaviti progresivnom opadanju starenja, CR je stekao najveću važnost zbog svojih pozitivnih učinaka, prijavljenih u širokom nizu organizama u rasponu od kvasca do čovjeka [22]. Dokazano je da CR utječe na veliki broj molekularnih putova. Među njima, neki su posebno učinkoviti u modulaciji mitohondrijske biogeneze i aktivnosti, kao što su oni koji osjećaju hranjive tvari i/ili razine energije kao što su AMP-ovisna kinaza (AMPK) i sirtuini, u kojima svi surađuju s CR-induciranim reprogramiranjem mitohondrija metabolizam [23]. Poboljšanjem oksidativnog metabolizma, CR smanjuje mitohondrijsku proizvodnju ROS-a i molekularna oštećenja izazvana povećanjem ovih reaktivnih vrsta [8-10]. Iako je nekoliko studija istraživalo učinke CR-a na mitohondrijskoj razini [3,13-15,24], još uvijek nedostaje opsežan rad o učincima ove prehrambene intervencije na organele. Stoga je ova studija pokušala ispitati postojanje granica učinkovitosti CR u velikom skupu mitohondrijskih markera. Posebno smo se usredotočili na usporedbu između učinaka izazvanih ovim režimom prehrane kod starih (28-mjesečnih) i ekstremno starih (32-mjesečnih) štakora kako bismo provjerili postoji li međudjelovanje između CR i napredovanje starenja. Analiza rezultata otkrila je složenu sliku učinkovitosti CR na biogenezu mitohondrija i oštećenja mtDNA, koja je sažeta u tablici 1.

Cistanche može spriječiti starenje

3.1.Mitohondrijski markeri u 28-mjesečnih štakora

CR je pozitivno utjecao na veliki broj mitohondrijskih markera kod štakora starih 28- mjeseci. Naime, zabilježeno je smanjenje aktivnosti citrat sintaze povezano sa starenjem, u količini proteina TFAM, MFN2 i DRP1, te u sadržaju mtDNA uspoređujući AL-18 kontrolnu skupinu s AL-28 . Sve takve promjene spriječio je CR kod 28-mjesečnih štakora (CR-28). Ovi rezultati podupiru učinak CR-a protiv starenja do ove dobi u jetri štakora. Slično tome, smanjenje učestalosti oksidiranih purina u sve tri analizirane regije mtDNA, izazvano CR-om, dodatno pojačava ovo stajalište. Treba napomenuti da je ovo oksidativno oštećenje već bilo prisutno kod AL-18 životinja bez povećanja povezanog sa starošću kod AL-28 štakora, što sugerira da se njegovo pojavljivanje može identificirati kao rani marker starenja. Posebnu pozornost treba obratiti na pet mitohondrijskih markera na koje nije utjecao CR kod 28-mjesečnih štakora, naime količine proteina LonP1. Cvt c, OGGl i APE1 i sadržaj brisanja od 4,8 Kb. Zapravo, kao i za LonP1 i Cyt c, CR nije spriječio smanjenje povezano sa starošću koje je pronađeno kod AL-28 životinja, dok količine proteina OGG1 i APE1, kao i sadržaj delecija od 4,8 Kb, nisu bile na koje utječe dob niti CR. LonP1 je odgovoran za razgradnju iscrpljenog TFAM-a [25-27] i objavljeno je da se smanjuje sa starenjem [28] u jetri štakora [29] do 27 mjeseci starosti. Prethodno smo sugerirali da bi takva ekspresija LonP1 [16] smanjena starenjem mogla biti povezana s njegovom aktivnošću u uklanjanju TFAM-a nevezanog za mtDNA [26]. Kao moguće objašnjenje za neučinkovitost CR-a u sprječavanju smanjenja ekspresije LonP1 povezanog sa starenjem, unatoč obnovljenoj ekspresiji TFAM-a i vezanju TFAM-a na regije specifične za mtDNA (sadašnji podaci i Picca et al. [15]), CR je -posredovana aktivacija Sirt3 [30] koja je također mogla utjecati na količinu proteina LonP1 putem inducirane deacetilacije. Može se predložiti drugačija hipoteza za objašnjenje neučinkovitosti CR-a u sprječavanju smanjenja količine Cyt c. Ovaj je protein glavni okidač mitohondrijskog apoptotskog puta kroz njegovo otpuštanje u citosol, stoga njegova smanjena intramitohondrijska količina u AL-28 štakora u odnosu na vrijednost AL-18 ukazuje na povećanje intrinzični apoptotski proces sa starenjem [16,31]. Nadalje, kao i za LonP1, količina Cyt c u CR-28 štakorima još uvijek je bila znatno niža od vrijednosti u AL-18 životinjama, što ukazuje da CR nije bitno utjecao na konačnu regulaciju ekspresije Cyt c /oslobađanje u citosol i, vjerojatno, ni povećanje mitohondrijskog apoptotskog puta povezano sa starenjem. Ovo je u skladu s prethodno prijavljenim promicanjem apoptoze posredovane CR [23].cistanche rast penisaBudući da apoptotski put može biti potaknut i akumulacijom oštećenja DNA [32,33], odredili smo ekspresiju proteina dva glavna mitohondrijska BER enzima, naime OGG1 i APE1. Na količine proteina oba nisu utjecala starenje i CR koji su prešli s 18 na 28 mjeseci starosti. Moguće objašnjenje je da je ekspresija dva BER enzima već bila povećana i dovoljna u AL-18 štakora da se suprotstavi povećanom oštećenju mtDNA povezanom sa starenjem. Doista, povećanje aktivnosti mitohondrijskog OGG1 [34,35] i mitohondrijskog APE1[36] povezano sa starenjem zabilježeno je u jetri glodavaca koji prelaze sa 3-6-mjesečnih životinja na 20-23-mjesec -stari, vjerojatno inducirani kako bi se učinkovito suprotstavili povećanju oštećenja mtDNA povezanom sa starenjem. Sve ovo dalje podupire našu hipotezu da su se oštećenja mtDNA, popravljena pomoću OGG1 i APE1, pojavila vrlo rano u životnom vijeku glodavaca (već su bila prisutna u štakora AL-18) i inducirala, kroz retrogradnu komunikaciju mitohondrija i jezgre, rano povećanje ekspresije BER enzima. Što se tiče odsutnosti CR učinka na OGG1 i APE1, predlažemo da je CR-smanjena prisutnost ROS-a i povezanih oksidativnih oštećenja učinkovito suprotstavljena ekspresijom oba enzima koja se ne razlikuju od one kod AL-životinja iste dobi. Što se tiče sadržaja brisanja od 4,8 Kb, nije bilo porasta povezanog sa starošću koji je prešao sa AL-18 životinja na AL-28 kao da se također ovo oštećenje mtDNA pojavilo prilično rano u životnom vijeku štakora i njegovoj dobi -povezano povećanje moglo se potvrditi samo u usporedbi s mladim životinjama, kao što je navedeno u drugim studijama [19,37-39]. Neučinkovitost CR-a da značajno smanji sadržaj delecija od 4,8 Kb u CR-28 štakora u usporedbi s AL-28 i AL-18 životinjama dalje ukazuje da je dugotrajni CR inducirao značajno smanjenje prisutnosti ROS u jetri. To je moglo dovesti do neke vrste postojane razine brisanja od 4,8 Kb, koja se ne razlikuje od one za AL-18 pandan i kompatibilna je s odgovarajućim sadržajem mtDNA. Iako popravak mtDNA nije smanjen starenjem, smanjenje sadržaja mtDNA povezano sa starenjem još uvijek je bilo prisutno pri prelasku s AL-18 štakora na AL-28 štakore, kao što je prethodno opisano u različitim tkivima stari glodavci [3,15,19,39-42]. To se može objasniti povećanim vezanjem TFAM-a povezanim sa starenjem na specifične regije mtDNA koje su također bile oštećene žarišne točke [19]. Ova hipoteza bi stoga pomirila gubitak mtDNA povezan sa starenjem s nepromijenjenom ekspresijom i aktivnošću enzima za popravak. Dodatna potpora ovoj hipotezi je nepostojanje gubitka mtDNA u CR-28 štakora. Doista, prethodno smo pokazali da CR sprječava povećanje vezivanja TFAM vezano uz dob na specifične regije mtDNA [15]. Stoga, prema sadašnjim i našim prethodnim podacima, modulacija vezanja TFAM-a može biti jedan od molekularnih mehanizama uključenih u regulaciju mitohondrijske biogeneze posredovanu starenjem i CR-om. Također se pokazalo da se ova regulacija starenjem i CR provodi kroz ravnotežu mitohondrijske dinamike na koju utječe starenje [43] i dovodi do prevalencije fuzije nad fisijom [44,45]. Stoga smo izračunali fuzijski indeks (FI) kod svih testiranih životinja (Slika 6) i pronašli vrijednosti koje su potvrdile i proširile naše prethodne rezultate [16].dobrobiti cistanche salseNeke nove indikacije mogu se prikupiti ovom studijom, naime, u AL-18štakora vrijednosti FI pokrivale su mali raspon, dok je u AL-28 raspon FI bio puno veći, s izraženim porast pojedinačnih vrijednosti vezan uz dob, kod štakora CR-28 mali raspon vrijednosti ukazuje na pozitivan učinak CR u indukciji fisije, s generaliziranim povećanjem pojedinačnih količina DRP1 u usporedbi s onima iz AL-28 grupa. Dok bi učinkovita fisija mogla ukloniti oštećene organele, slična fuzija entiteta mogla bi osigurati difuziju oštećenih makromolekula u mitohondrijskoj mreži, čime bi se razrijedili njihovi negativni učinci [46]. Stoga, CR-posredovana obnova fino podešene ravnoteže mitohondrijske dinamike može izazvati pozitivne posljedice na modulaciju mitohondrijske biogeneze, djelujući sinergistički s retrogradnom komunikacijom oštećenja mtDNA. To je u skladu s postojećom literaturom koja izvještava da status hranjivih tvari i metaboličke promjene mogu modulirati ravnotežu mitohondrijske dinamike [47] i, stoga, utjecati i na biogenezu organela. Konkretno, regulacija mitohondrijske biogeneze osjetljiva na ROS može se suočiti samo s ograničenim povećanjem ROS-a kroz povećanje broja organela [48], a prisutnost ROS-a smanjena CR [15] može spriječiti prevladavanje razine slične pragu koja bi mogla dovesti do gubitka mitohondrija. Učinkovitost CR-a u smanjenju prisutnosti ROS-a dokazana je u ovoj studiji smanjenom akumulacijom oksidiranih purina u analiziranim regijama mtDNA u CR-28 štakora koji podupiru sveukupno poboljšanje metabolizma mitohondrija, sposobno spriječiti starost -povezani pad. Doista, CR-smanjena prisutnost ROS-a naširoko je dokazana i na razini mitohondrijskih proteina i lipida. Posebno se pokazalo da CR smanjuje oksidativne modifikacije mitohondrijskih proteina u srcima štakora |49] i modificira indeks zasićenosti/nezasićenosti u mitohondrijskim membranama sprječavajući oksidativno oštećenje i održavajući fluidnost membrane [8]. Nadalje, pokazalo se da CR smanjuje proizvodnju ROS mitohondrijskih respiratornih kompleksa u mišjim skeletnim mišićima i jetri [8]. Korisni učinci CR-a na razini ROS-a također uključuju poboljšanu neutralizaciju ROS-a i povećani popravak molekula oštećenih ROS-om [10]. Uz ovaj učinak, promjene u funkcionalnosti mitohondrija modulirane su aktivacijom CR-osjetljivih AMPK i sirtuina koji reguliraju aktivnost transkripcijskih faktora peroksisomskog proliferatora aktiviranog receptora gama koaktivatora 1-alfa (PGC-1 ), i forkhead box (FoxO), pri čemu je potonji uključen u biogenezu, oksidativni metabolizam i promet mitohondrija [23]. Prema tome, pozitivan utjecaj posredovan CR-om na metabolizam mitohondrija trebao bi komunicirati s drugim putovima kako bi se modulirao konačni okidač mitohondrijske biogeneze, prema modelu retrogradne komunikacije s jezgrom [50].

3.2.Mitohondrijski markeri u 32-mjesečnih štakora

Što se tiče usporedbe između AL-32 i CR-32 štakora, naši podaci pokazuju općenito odsustvo značajnih razlika. Ovo može upućivati ​​na dobno ograničenje učinkovitosti CR-a u suzbijanju opadanja povezanog sa starenjem kada se prijeđe s 28 na 32 mjeseca. Međutim, što se tiče učinka dobi, mogu se donijeti različiti zaključci ovisno o analiziranom markeru. Zapravo, u obje 32-mjesečne skupine, smanjenje aktivnosti citrat sintaze, količine TFAM, LonP1, OGG1, APE1, sadržaja mtDNA i delecije od 4,8 Kb održano je na razini to je bilo slično onom uočenom kod AL-28 štakora ili je djelomično/potpuno spriječeno kao u količinama Cyt c, MFN2, DRP1 i incidenciji oksidiranih purina u određenim regijama mtDNA. Ova različita ponašanja mogu biti vjerojatna zbog međusobnog djelovanja različitih putova koji uključuju analizirane markere. Još jedan zaključak može se istaknuti usporedbom 32-mjesečnih skupina s AL-18 i AL-28 za iznose MFN2 i DRP1. Zapravo, smanjenje povezano sa starošću nije bilo prisutno prelaskom iz skupine AL-18 u obje skupine AL-32 i CR-32 za dva dinamička proteina. Uzimajući u obzir da je u usporedbi između skupine AL-18 i obje 32-mjesečne skupine, kao i za druge markere, došlo do smanjenja povezanog s dobi sličnog ili manjeg u veličini od onog između AL{{ 30}} i AL-28 grupe, možemo dovesti do nekih posljedica. To može značiti da su promjene markera povezane sa starošću možda počele ili već bile prisutne u 18 mjeseci, a zatim su dosegle svoju najnižu/najvišu vrijednost u starih 28-mjesečnih životinja s "tempom" koji je tipično za proces starenja. Nasuprot tome, u ekstremno starih životinja (starih 32- mjesec dana), čini se da je "tempo" procesa usporen jer su vrijednosti niže ili jednake onima kod AL-18 parnjaka, ali ne niže /viši od onih iz AL-28, unatoč duljem proteklom vremenskom rasponu. Hipoteza o dva različita tempa u procesu starenja [16] implicira da oštećenja, zbog različitih uzroka, počinju utjecati na fizičke i metaboličke aktivnosti tijekom odrasle dobi kod svakog štakora. Takva se oštećenja učinkovito suprotstavljaju kompenzacijskim mehanizmima, a oštećenja se ne pojavljuju otvoreno, što koincidira sa stabilnom "srednjom" dobi koju karakterizira uspješna homeostaza. U ovoj smo studiji kao štakore koji "brzo" stare identificirali one kod kojih ravnoteža između interventnih oštećenja i kompenzacijskih mehanizama počinje nestajati kasnije u životu.cistanche tubulosa doziranje redditKod ovih životinja, koje čine veći dio skupine AL-28, oštećenja prelaze prag kompatibilan s normalnim aktivnostima i pojavljuje se izmijenjeno stanje. Suprotno tome, preostali, manji dio ispitivane populacije koja stari dulje vrijeme održava homeostatsku ravnotežu između oštećenja i popravka i čini skupinu životinja koje "sporo stare", uključujući i AL-32 i CR{{2} } štakori. Slična hipoteza o različitim brzinama starenja nedavno je predložena i za ljude [51]. Uzeti u cjelini, ovi rezultati pokazuju da su ekstremno stare životinje možda dosegle dugovječnost bez značajnog utjecaja CR i vjerojatno zbog genetske predispozicije da se bolje nose s mitohondrijskom disfunkcijom povezanom sa starenjem, ali takva hipoteza zahtijeva buduća istraživanja. Ova nova otkrića mogu dati odgovor na izvorno i ključno pitanje o postojanju ograničenja učinkovitosti CR-a, koje su postavili Ingram i de Cabo u svojoj vrlo dubokoj studiji o ovom pitanju l52l, dopuštajući identifikaciju takvih ograničenja s godinama života. 28 mjeseci za jetru štakora. Unatoč tome, zaključak da CR ili bilo koja dijeta nije izazvala korisne posljedice kod onih štakora koji su prirodno predisponirani za dugovječnost ne bi trebao utjecati na ukupno povjerenje u učinkovitost ove prehrambene intervencije. Zapravo, CR je još uvijek mogao prenijeti korisne učinke jer je mogao spriječiti većinu starosnih promjena mitohondrijske biogeneze i oštećenja mtDNA u jetri 28-mjesečnih štakora. Ovo dodatno potvrđuje CR kao dobro utemeljenu strategiju za učinkovito suprotstavljanje opadanju starenja opće populacije.

4. Materijali i metode

4.1.Životinje

Studiju je odobrio Institucionalni odbor za skrb i korištenje životinja na Sveučilištu Florida. Svi postupci provedeni su u skladu sa smjernicama Nacionalnog instituta za zdravlje (NIH) za njegu i korištenje laboratorijskih životinja. Uzorci jetre uzeti su od Fischer 344× Brown Norway (F344BNF1) muških štakora dobivenih iz kolonije Nacionalnog instituta za starenje (Indianapolis, IN, SAD) i držanih pojedinačno na temperaturi (20 plus /-2 stupnjeva) i svjetlu- kontrolirano okruženje (12-h ciklus svjetlo/tama) s redovitom hranom za štakore i vodom dostupnom ad libitum na Odjelu za starenje i gerijatrijska istraživanja, Odjel za biologiju starenja, Medicinski fakultet, Sveučilište Florida, Gainesville, FL( SAD). Ograničenje kalorija započeto je u dobi od 3,5 mjeseca (ograničenje od 10 posto), podignuto na ograničenje od 25 posto nakon 3,75 mjeseci i zadržano na ograničenju od 40 posto od 4 mjeseca do kraja života svake životinje, što je 28 mjeseci (CR{ {17}}) ili 32 mjeseca (CR-32) starosti. Životinje s ograničenim unosom kalorija hranjene su NIH31-NIA obogaćenom prehranom kako bi se osiguralo da nisu pothranjene, dok su životinje hranjene ad libitum dobivale NIH31 dijetu za štakore. Životinje su se sastojale od sljedećih skupina: 18-mjesečne ad libitum hranjene (AL-18, n=6),28-mjesečne ad libitum hranjene (AL -28, n=6),28-mjesečno ograničenje kalorija (CR-28, n=6), 32-mjesečni oglas libitum-fed (AL-32, n=6), i 32-mjesečni štakori s ograničenim unosom kalorija (CR-32, n =6) štakori. Životinje su bile anestezirane prije žrtvovanja, a uzorci jetre su odmah uklonjeni, brzo zamrznuti u izopentanu ohlađenom tekućim dušikom i pohranjeni u tekućem dušiku do daljnje analize.

4.2. Određivanje aktivnosti citrat sintaze

Određivanje aktivnosti citrat sintaze provedeno je kao u [17]. Ukratko, 80 ug ukupnih proteina pročišćenih iz uzoraka jetre inkubirano je u reakcijskom puferu (0.31 mM acetil-CoA, 100 mM Tris pufer ( pH 8,1), 0,25 posto Tritona X-100, 0,1 mM 550-ditiol-bis-2-nitrobenzojeve kiseline i 0,5 mM oksaloacetata (1 mL) na 30 stupnjeva.

Aktivnost citrat sintaze (umol × min-I × g tkiva-) određena je spektrofotometrijski mjerenjem brzine proizvodnje tionitrobenzojeve kiseline (TNB) na 412 nm.

4.3. Western Immunoblotting

Mitohondriji jetre izolirani su u mediju koji je sadržavao 220 mM manitola, 70 mM saharoze, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA i 5 mM EGTA, pH 7,4, na 4 stupnja prema 【16】. Uz to, 10 ug mitohondrijskih proteina korišteno je za Western imunobloting analizu. Anti-TFAM(1:50,000), anti-VDAC(1:50,000, Abcam, Cambridge, UK), anti-OGG1(1:2500, Abcam, Cambridge, UK) , anti-APE1(1:5000, Abcam, Cambridge, UK), anti-MFN2(1:5000, Abnova, Taipei, Tajvan), anti-DRP1(1:2500, Abnova, Taipei, Tajvan) , anti-Cyt c (1:500, Pharmingen, San Diego, CA, SAD) i anti-Lon proteaza (1:10,000) korištena su kao primarna antitijela. Antitijela protiv TFAM i Lon izradili su po narudžbi i ljubazno donirali dr. H. Hinagaki (Odjel za kemiju, Nacionalni institut za industrijska istraživanja u Nagoyi, Nagoya-shi, Aichi, Japan) i dr. C. Suzuki (Odjel biokemije i molekularne biologije, Medicinski fakultet New Jersey, Sveučilište medicine i stomatologije New Jersey, Newark, NJ, SAD). Proteini su detektirani kemiluminiscencijom, a imunoreaktivne trake su kvantificirane korištenjem softvera Image Lab (BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, SAD) i normalizirane u odnosu na VDAC ekspresiju.

4.4. Određivanje mtDNA i mtDNA 4.8 Kb"Common Deletion"Content

Kvantitativna lančana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu (qPCR) korištena je za određivanje relativnog sadržaja mtDNA i mtDNA 4,8 Kb "uobičajene delecije". Reakcije su izvedene pomoću SYBR Green kemije korištenjem 3 ng ukupne DNA kao uzorka i sljedećih početnica: MtDNA za 5-GGTTCTTACTTCAGGGCCATCA-3'(nt 15.785-15.806), mtDNA rev. 5'-TGATTAGACCCGTTACCATCGA-3'(nt 15,868-15,847); -aktin za 5'-CCCAGCCATGTACGTAGCCA-3'(nt 2181-2200), -aktinrev5'-CGTCTCCGGAGTCCATC AC-3'(nt 2266-2248);4,8 del za {{26} }AAGGACGAACCTGAGCCCTAATA-3'(nt8109-8131), 4.8 del rev 5'-CGAAGTAGATGATGCGTATACTGTA-3'(nt 13,020-12,996). Sadržaj mtDNA u odnosu na jezgri Određen je DNA i sadržaj "uobičajene delecije" od 4,8 Kb u odnosu na mtDNA, kao što je objavljeno u [19].

4.5. Analiza oksidiranih purina

Formamidopirimidin DNA glikozilaza (Fpg) (New England Biolabs, Beverly, MA, SAD) digestija ukupne DNA korištena je za otkrivanje oksidiranih purina [53].

PCR amplifikacija D-petlje, Ori-L i ND1/ND2 regija mtDNA provedena je pomoću odgovarajućeg para početnica:

D-petlja For5'-TCTGGTCTTGTAACCAAAAAATGA-3'(nt 15,302-15,325),D-petlja Rev 5'-TGGAATTTTCTGAGGGTAGGC-3'(nt 16,302-16, 282); Ori-L za 5'-AACCAGACCCAA ACACGAAA-3' (nt 4414-4433),Ori-L Rev 5'-CTATTCCTGCTCAGGCTCCA-3'(nt 5407-5388);ND1 za 5 '-AGGACCATTCGCCCTATTCT-3'(nt3390-3409),ND1 Rey 5'-CGCCAAC AAAGACTGATGAA3'(nt 4399-4380) na 5 ng Fpg-tretirane i netretirane ukupne DNA. Uvjeti ciklusa bili su: predinkubacija od 10 minuta na 95 stupnjeva, nakon čega slijedi 18 ciklusa od 15-95 stupnjeva, 15-58 stupnjeva C i 1 minuta 72 stupnja. Alikvot svake PCR amplifikacije napunjen je na 1,3 postotni agarozni gel. Intenziteti vrpci vrpci obojenih etidijevim bromidom analizirani su pomoću softvera Image Lab (BioRad Laboratories Inc., CA, SAD). Kako bi se poboljšala grafička vizualizacija, omjer između intenziteta trake tretiranih Fpg-om i netretiranih izražen je kao postotak komplementa na 100.

4.6. statistika

Podaci su izraženi kao srednja vrijednost i standardna devijacija (SD). Korištena je jednosmjerna ANOVA s Tukeyjevim testom višestruke usporedbe. Za sve testove, statistička značajnost postavljena je na razinu od 5 posto. Analize su provedene korištenjem specifičnog statističkog paketa (Stata Corp. 2005. Stata Statistical Software: Release. College Station, TX, USA).

Ovaj je članak izvađen iz Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 1665. https://doi.org/10.3390/ijms22041665 https://www.mdpi.com/journal/ijms