Ciljanje katepsina B pomoću cikloastragenola pojačava antitumorski imunitet CD8 T stanica putem inhibicije MHC-I degradacije 1. dio

SAŽETAK

PozadinaGubitak tumorskih antigena i iscrpljivanje CD8 T stanica uzrokovano putem PD-1/PD-L1 važni su čimbenici za izbjegavanje imunološkog sustava tumora. Posljednjih godina sve je više istraživanja tradicionalne kineske medicine u liječenju tumora. Utvrđeno je da cikloastragenol (CAG), učinkovita aktivna molekula u Astragalus membranaceus, ima antivirusne, anti-aging, protuupalne i druge funkcije. Međutim, njegov antitumorski učinak i mehanizam nisu jasni.

Glikozid cistanhe također može povećati aktivnost SOD-a u tkivima srca i jetre, te značajno smanjiti sadržaj lipofuscina i MDA u svakom tkivu, učinkovito čisteći različite reaktivne kisikove radikale (OH-, H₂O₂, itd.) i štiteći od oštećenja DNA uzrokovanog pomoću OH-radikala. Cistanche feniletanoidni glikozidi imaju jaku sposobnost hvatanja slobodnih radikala, veću reducirajuću sposobnost od vitamina C, poboljšavaju aktivnost SOD u suspenziji spermija, smanjuju sadržaj MDA i imaju određeni zaštitni učinak na funkciju membrane spermija. Cistanche polisaharidi mogu pojačati aktivnost SOD i GSH-Px u eritrocitima i tkivu pluća eksperimentalno starih miševa uzrokovanih D-galaktozom, kao i smanjiti sadržaj MDA i kolagena u plućima i plazmi, te povećati sadržaj elastina, imaju dobar učinak čišćenja na DPPH, produžiti vrijeme hipoksije u starim miševima, poboljšati aktivnost SOD u serumu i odgoditi fiziološku degeneraciju pluća u eksperimentalno starim miševima Uz stančnu morfološke degeneraciju, pokusi su pokazali da Cistanche ima dobru antioksidacijsku sposobnost i ima potencijal da bude lijek za prevenciju i liječenje bolesti starenja kože. U isto vrijeme, ehinakozid u Cistancheu ima značajnu sposobnost hvatanja slobodnih radikala DPPH i ima sposobnost hvatanja reaktivnih vrsta kisika i sprječavanja degradacije kolagena izazvane slobodnim radikalima, a također ima dobar učinak popravka na oštećenje aniona slobodnih radikala timina.

Kliknite na Cistanche za i protiv

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

MetodeAntitumorski učinak CAG-a istraživan je na modelima tumora transplantiranim miševima MC38 i CT26. Antitumorski učinak CAG-a dalje je analiziran jednostaničnim multi-omičkim sekvenciranjem. Tehnologija profiliranja pristupačnosti koja reagira na cilj korištena je za pronalaženje ciljnog proteina CAG-a. Nakon toga je antitumorski mehanizam CAG-a istražen korištenjem konfokalne mikroskopije, imunoprecipitacije i transfekcije mutantnih plazmida. Konačno, istraživan je kombinirani antitumorski učinak CAG i PD-1 antitijela kod miševa ili organoida.

RezultatiOtkrili smo da CAG učinkovito inhibira rast tumora in vivo. Naš jednostanični multi-omički atlas pokazao je da CAG potiče prezentaciju antigena na površini tumorskih stanica i karakteriziran je pojačanom funkcijom ubijanja CD8 plus T stanica. Mehanički gledano, CAG se vezao za svoj ciljni protein katepsin B, koji je zatim inhibirao lizosomalnu degradaciju glavnog kompleksa histokompatibilnosti I (MHC-I) i promovirao agregat n MHC-I na staničnu membranu, pojačavajući pre-stanicu tumorskog antigena . U međuvremenu, kombinacija CAG s PD-1 antitijelom učinkovito je poboljšala ubijanje tumora CD8 plus T stanica koje ubijaju tumor u miševima ksenografta i organoidima raka debelog crijeva. Zaključak Naši podaci po prvi su put pokazali da smanjenje katepsina B daje antitumorski imunitet i eksplodira antitumorski mehanizam prirodnog proizvoda CAG.

UVOD

Rak debelog crijeva jedan je od najčešćih karcinoma u svijetu. Stopa incidencije i stopa smrtnosti spadaju među prva tri, ozbiljno prijeteći ljudskom životu i zdravlju.1 Uobičajene metode liječenja uključuju kiruršku kemoterapiju i radioterapiju, ciljane lijekove i imunoterapiju.2-4 Međutim, stanice raka obično pokazuju gubitak površinskih antigena i ekspresiju visoke razine inhibicijskih molekula kako bi izbjegle nadzor imunoloških stanica. Stoga, kako bi riješili problem imunološkog bježanja tumora, istraživači su razvili inhibitore imunoloških kontrolnih točaka i neoantigensku terapiju za blokiranje maskiranja stanica raka u imunološke stanice.5-8 Iako inhibitori imunoloških kontrolnih točaka mogu obnoviti iscrpljene imunološke stanice, površinski antigen raka stanica nije značajno poboljšan. Stoga je posebno važno pronaći lijekove koji mogu pospješiti prezentaciju površinskih antigena tumora. Prepoznavanje stanica raka citotoksičnim CD8 plus T stanicama ovisi o putu TCR/CD3/glavnog histokompatibilnog kompleksa (MHC-I). TCR prima antigen prisutan od strane proteina membrane dendritičnih stanica/stanica raka CI i prenosi signal za čvrsto povezivanje CD3, koji se zatim proteže dublje u citoplazmu.9 10 Istovremeno, uz aktivaciju signala CD28/B7 , CD8 plus T stanice mogu se koaktivirati da prepoznaju i ubiju stanice raka.11 Nedavne studije su otkrile da, u procesu progresije tumora, lizosomi rezultiraju smanjenjem agregacije MHC-I na površini stanica raka, što nije učinkovito prisutne antigene.12 13 Liu i suradnici izvijestili su da inhibicija PCSK9 može spriječiti razgradnju MHC-I u lizosomima i omogućiti MHC-I da se vrati na staničnu membranu kako bi predstavio antigene.12 Stoga, obnavljanje funkcije predstavljanja antigena MHC-I je posebno važan za blokiranje imunološkog izlaska tumora.

Sve veći broj studija otkrio je da primjena aktivnih molekula tradicionalne kineske medicine u protutumorskoj intervenciji ima velike izglede.14 15 Cikloastragenol (CAG) je učinkovita aktivna molekula u Astragalus membranaceus, koja djeluje antivirusno, antibakterijski, anti- upalne i druge farmakološke učinke, ali rijetko se prijavljuje njegov antitumorski učinak.16-19 U ovoj studiji otkrili smo da CAG inhibira rast transantiranih tumora tumora raka debelog crijeva. Mehanizam je uglavnom uključivao inhibiciju degradacije MHC-I, posredovane katepsin B (CTSB), promičući prezentaciju antigena stanica raka, a zatim povećavajući sposobnost ubijanja CD8 plus T stanica.

MATERIJALI I METODE

Antitijela i reagensi

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 posto). Antitijela CTSB (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB_1557426), aktin (Cat#{{ 5}}Ig, PRID: AB_2782959 ), Tubulin (Cat#10094-1-AP, PRID: AB_2210695) ​​i Anti-mouse/rabbit Immunohistochemistry Detection Kit (Cat#PK10006) su kupljeni od Proteintech-a. Antitijela H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853), i CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) kupljeni su od Santa Cruz Biotechnology. Antitijelo Ki-67 (Cat#12202, PRID: AB_2620142) kupljeno je od Cell Signaling Technology. Antitijelo Na/K ATP-aze (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) kupljeno je od Abcam-a. Antitijela protočne citometrije CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB_2833003 ) i CD{ {31}}PerCP (Cat#345774, RRID: AB_2868802) kupljeni su od BD Bioscience. Protutijelo Gzmb-FITC za protočnu citometriju (kataloški broj 515403, RRID: AB_2114575) kupljeno je od BioLegenda. Antitijela protočne citometrije NK1.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB_469664) i IFN- -PE (Cat#12-7311-81, RRID :AB_466192) su kupljeni od Thermo Fisher Scientific. DMEM medij (Cat#01-052-1ACS), penicilinstreptomicin (Cat#15140122) i fetalni goveđi serum (Cat#C04001-500) kupljeni su od Biological Industries. Kozji serum (Cat#88RNG001) i Pierce BCA komplet za analizu proteina (Cat#23225) kupljeni su od Thermo Fisher Scientific. Antitijela protiv humanog PD-1 (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) i antitijela protiv mišjeg PD-1 (Cat#BE0146, RRID: AB_1094905 3) su kupljeni od Bio X cell. MACS Tumor Tissue Dissociation Kit (Cat#130-095-929) kupljen je od Miltenyi Biotec.

Kultura stanica

Stanične linije mišjeg raka debelog crijeva MC38 i CT26 održavane su u našem laboratoriju.20 Linije ljudskog raka debelog crijeva HCT-116 dobivene su iz Zbirke tipskih kultura Kineske akademije znanosti (Šangaj, Kina). Stanice MC38, CT26 i HCT-116 uzgajane su u DMEM mediju koji je sadržavao 10 posto fetalnog goveđeg seruma i 1 posto penicilina/streptomicina na 37 stupnjeva u inkubatoru s 5 posto CO2.

Eksperiment s transplantacijskim tumorom

Šest-osam tjedana stare ženke C57BL/6JGpt miševa, BALB/c miševa i BALB/,c golih miševa kupljene su od GemPharmatech (Nanjing, Kina). Stanice raka MC38 ili CT26 (1×106) inokulirane su supkutano u svakog miša. Nakon što tumor naraste do 100 mm3, mikrofon je nasumično podijeljen u skupinu s fosfatnim puferom (PBS) (npr. jednom dnevno) i skupinu CAG (npr. 50 mg/kg jednom dnevno). Volumeni tumora određeni su mjerenjem kaliperom pomoću formule V=duljinaךirina2 /2. Kada je volumen tumora miševa PBS skupine dosegao 1000 mm3, tumor miševa je izvađen, fotografiran i izvagan.

Disocijacija jedne stanice iz miša za jednostaničnu RNA/ATACseq

Čvrsti tumori iz miševa su digestirani korištenjem Tumor Dissociation Kit-a da se dobiju jednostanične jednostanične stanice. Single cel Jednoćelijske stanice s koncentracijom od 1000 stanica/1000 stanica učitanih na 10×genomics krom kontroler jednoćelijske jednoćelijske ćelije slijedeći protokol proizvođača 10×genomics. Reagensi za obrnutu transkripciju, zrnca gela s barkodom i razdjelno ulje pomiješani su sa stanicama za stvaranje gel zrna u emulzijama (GEM) za obrnutu transkripciju. scRNA-seq pretprocesiranje podataka i qua y kontrola.

Na temelju referentnog genoma miša GRCm38 (mm10), cjevovod CellRanger V.4.0.0 (10×Genomics) za obradu jednostanične RNA podaci sekvence za svaki eksperiment (GSE197229). Digitalne matrice genske ekspresije su zedirane u R (V.4.0.4) korištenjem paketa Seurat (V.4.0.0).21 Prije analize dBeforem, stanice su filtrirane prema UMI broju (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

SeaTac-seq pretprocesiranje podataka i kontrola kvalitete

Podatke ATAC-seq jedne ćelije (GSE197229) prethodno je obradio cell ranger-at (V.2.0.0) s naredbenim redom brojanja. Za kasniju obradu i analizu podataka scATAC-seq upotrijebili smo paket ArchR (V.1.{0.1).24 Zatim smo upotrijebili funkciju addArchRGethe nome ('mm10') za oznaku genoma i stvorili arrow datoteka s funkcijom cre ArrowFiles sa zadanim parametrima. Zatim smo upotrijebili funkciju filterDoublets za brisanje potencijalnih dubleta i stvorili ArchR projekt pomoću funkcije ArchRProject sa zadanim parametrima. Zatim smo upotrijebili paket Harmony da uklonimo skupni učinak pomoću funkcije addHarmony.25 Za smanjenje dimenzionalnosti koristimo funkciju addIterativeLSI u ArchR-u za pokretanje s def t parametrima. Za ugradnju jedne ćelije odabrali smo smanjeni objekt Dims s harmonijom i upotrijebili funkciju addTSNE s parametrom 'perplexity=30' za vizualizaciju.

Integrirana analiza siRNA-seq i scATAC-seq podataka

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. Kako bismo poboljšali točnost predviđanja kako bismo bolje integrirali dva skupa podataka, ponovno smo integrirali podatke scATAC-seq i scRNA-seq koristeći način 'ograničene integracije'. Ukratko, označili smo scATAC-seq podatke tipovima stanica na temelju genskih rezultata scATAC-seq. Zatim smo stvorili ograničeni popis tako da je sličnost ekspresije gena izračunata samo u istom tipu stanice i za scATAC-seq i za scRNA-seq. Nenadzirano klasteriranje s t-SNE otkrilo je 13 podstaničnih klastera, koji su označeni poznatim ili navodnim markerima u online dodatnoj tablici 1.

Putanja loze pseudovremena

Putanja stanične loze stanica raka izvedena je korištenjem Monocle2 (V.2.18.0) R paketa.26 Monociti uče eksplicitni glavni graf iz genomičkih podataka jedne stanice pomoću Reversed Graph Embedding kako bi razvrstali stanice, rješavajući tako složene biološke procese robusno i točno.27 Koristili smo funkciju ''differentialGeneTest'' za izvođenje DEG iz svakog klastera, a nakon konstruiranja stanične putanje detektirali smo različito izražene gene u pseudovremenu. Svi pseudovremenski ovisni geni vizualizirani su pomoću funkcije plot_pseudotime_heatmap koja uzima CellDataSet objekt. Grafikoni putanje loze i krivulje glatke ekspresije temeljene na CellDataSet-u generirani su plot_cell_trajectory i plot_genima_u_pseudovremenu, respektivno.28

Poziv varijacije broja kopije jedne ćelije

Kako bismo identificirali maligne stanice s klonskim velikim kromosomskim varijacijama broja kopija (CNV), upotrijebili smo inferCNV R paket za zaključivanje genetskih profila svake stanice na temelju prosječne ekspresije velikih skupova gena u svakoj kromosomskoj regiji tumorskog genoma u usporedbi s normalne stanice.29 Na osnovi uzorka po uzorak, imunološke stanice korištene su kao referenca za procjenu CNV-ova u stanicama povezanim s rakom.

Analiza obogaćivanja

Analize KEGG puta i GO napomena provedene su korištenjem R paketa clusterProfiler (V.3.11.1) s parametrima PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10 i MaxGSSize=500.20Analiza obogaćivanja skupa gena (GSEA) primijenjena je korištenjem 50 setova gena obilježja (h.all.V.7.4.symbols. gmt) za identifikaciju značajno obogaćenih funkcionalni putovi putem softvera GSEA (V.4.1.0), s kriterijima probira nominalne P-vrijednosti<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Kvantitativna PCR analiza u stvarnom vremenu

Stanice MC38 i HCT-116 nasađene su u ploče sa šest jažica tijekom 6 sati, a zatim su tretirane s CAG-om još 24 sata. Stanice su isprane tri puta s hladnim PBS-om i centrifugirane na 180g 5 minuta na 4 stupnja. Istodobno, nakon mljevenja tumorskog tkiva. Ukupna RNA ekstrahirana je iz MC38, HCT-116 stanica i tumorskog tkiva korištenjem TRIzol reagensa, prema uputama proizvođača. Reakcijski volumen bio je 20 µL koji je sadržavao: 1 µg RNA, 5 µL 5×Hiscript III qRT SuperMix i dH2 O bez RNaze. cDNA je podvrgnuta kvantitativnom PCR-u, s reakcijskim volumenom od 10 µL s 1 µL cDNA, 5 µL qPCR mješavine, 0,75 µL 5 µM početnica (Naprijed i unazad), i 3,25 µL dH2 O bez RNaze. Primere je sintetizirala GenScript Biotech Corporation (Nanjing, Kina) prema sljedećim sekvencama (mrežna dopunska tablica 2).

Otkrivanje cilja putem pristupa profiliranju pristupačnosti koji reagira na cilj

Provjera proteina koji se vežu na CAG provedena je kao što je prethodno opisano.31 32 Ukratko, pristup profiliranja pristupačnosti koji reagira na cilj (TRAP) korišten je za otkrivanje proteina vezanja za CAG u staničnom miljeu praćenjem lizina induciranog uključivanjem liganda pristupačnost se mijenja na razini proteoma. Ukratko, dvije posude sa stanicama tretirane su s 10µM CAG odnosno dimetil sulfoksidom (DMSO). Nakon 1-satne inkubacije, stanice su permeabilizirane pomoću M-PER pufera (Thermo Scientific) i dobiveni lizati su kovalentno obilježeni dodatkom formaldehida i boran piridin kompleksa koji zajedno specifično označavaju proteinske ostatke lizina na sobnoj temperaturi za profiliranje pristupačnosti . Zatim su lizati istaloženi organskim otapalom, a sakupljene pelete ponovno su otopljene u 8 mol/L uree, reducirane ditiotreitolom (DTT) na 56 stupnjeva tijekom 30 minuta, nakon čega je uslijedila alkilacija upotrebom jodoacetamida (IAA) u mraku tijekom 30 minuta. Ponovno je dodana odgovarajuća količina DTT otopine da reagira s viškom IAA. Nakon toga, proteom je razrijeđen otopinom amonijevog bikarbonata dok konačna koncentracija uree ne dosegne 1 mol/L. Sakupljeni digesti proteina su odsoljeni na C18 HLB koloni (Waters, Milford, Massachusetts, SAD), a obogaćeni peptidi su osušeni i rekonstituirani u 0,1 posto vodenoj otopini mravlje kiseline (FA). Sustav AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF (Waters) korišten je za analizu uzoraka za kvantitativno profiliranje promjena dostupnosti lizina kao odgovor na vezanje CAG za otkrivanje cilja. Za prikupljanje podataka korištena je akvizicija ovisnosti o podacima u pozitivnom načinu rada. Analiza podataka provedena je pomoću PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Waterloo, Kanada). Točnije, cys alkilacija je odabrana kao fiksna modifikacija, a oksidacija metionina i dimetilacija lizina, postignute TRAP označavanjem, postavljene su kao varijabilne modifikacije. Ukratko, peptidi koji sadrže dimetilaciju izazvanu TRAP-om i pokazuju značajne promjene količine sa i bez CAG inkubacije dodijeljeni su kao peptidi koji reagiraju na cilj. Omjer količine svakog TRAP-obilježenog peptida ukazuje na opseg promjene dostupnosti i blisko je povezan s afinitetom vezanja liganda. Proveden je Studentov t-test kako bi se procijenilo jesu li otkrivene promjene dostupnosti obilježenih peptida statistički značajne. Međugrupna p-vrijednost (str<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Kultura organoida

Organoide ljudskog kolorektalnog raka konstruirao je i uzgojio Chongqing Kingbiotech.33 Uzorci tkiva pacijenata dobiveni kirurškom operacijom usitnjeni su sterilnim škarama u komadiće što je moguće manje. Komadići tkiva su temeljito pomiješani s Matrigelom (Corning, Cat#356231) u približnom omjeru 1:4 na ledu. Naknadna obrada odnosila se na objavljene protokole. Ukratko, suspenzije komadića-Matrigela su brzo zasijane u ploču s više jažica kako bi se formirale hemisferične kapljice i prebačene na 37 stupnjeva 15-20 minuta, dopuštajući da se kapljice skrutne. Dodana odgovarajuća količina medija kulture (KingcultureTM Organoid Growth Medium, Cat#KCW-2) ​​u svaku jažicu i mijenjanje medija svaka 2-4 dana.

Izolacija i kultura ljudskih CD8 T stanica

Dodajte isti volumen normalne fiziološke otopine u perifernu krv zdravih ljudi koja sadrži antikoagulanse za razrjeđivanje cijele krvi. Dodajte određeni volumen otopine za odvajanje u epruvetu za centrifugu od 15 mL, polako dodajte razrijeđenu punu krv duž stijenke epruvete do vrha otopine za odvajanje i centrifugirajte na 750 g 20 minuta. Nakon centrifugiranja, pomoću pipete pažljivo usišite monocite u srednjem bijelom sloju u epruvetu za centrifugiranje od 15 mL, dodajte određeni volumen PBS-a za resuspendiranje, centrifugirajte 250 g 5 minuta i bacite supernatant. Nakon dodavanja humanih CD8 magnetskih kuglica staničnom precipitatu, CD8 T stanice su sortirane pomoću LS kolone za sortiranje. CD8 T stanice dodane su na perforiranu ploču prethodno obloženu s 5 µg/mL CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB_2865578) antitijela, a zatim 10 ng/mL IL{{15} } (Peprotech Cat# 212-12) i 5µg/mL CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID: AB_468920) funkcionalna antitijela dodana su uzgojena 24 sata.

Kokultura

Nakon što su organoidi inkubirani s CAG-om 24 sata, svježi medij kulture je zamijenjen, a zatim su organoidi i aktivirane CD8 T stanice suspendirane u matriks gelu, zatim je suspenzija dodana na ploču sa šest jažica i stavljena u 37 stupnja inkubatora 15 minuta, a zatim je dodano 2 mL potpunog medija za kulturu bez seruma 24 sata.

Zapadnjački blot

Stanice MC38 i HCT-116 nasađene su u ploče sa šest jažica tijekom 6 sati, a zatim su tretirane s CAG-om još 24 sata. Stanice su isprane tri puta s hladnim PBS-om i centrifugirane na 180 g tijekom 5 minuta na 4 stupnja. Ukupni protein je liziran s WB-IP lizom koja je sadržavala 1 posto inhibitora proteaze tijekom 30 minuta na ledu. Ukupni protein je procijenjen korištenjem BCA kompleta za kvantitaciju proteina. Uzorci proteina su odvojeni elektroforezom na 10-12 posto SDS poliakrilamidnom gelu i prebačeni na PVDF (poliviniliden fluorid) membrane na 350 mA tijekom 90 minuta. PVDF membrane su blokirane s 5 posto BSA tijekom 1 sata, trake s naznačenim primarnim protutijelima preko noći, a sa sekundarnim protutijelima inkubirane su 90 minuta na sobnoj temperaturi. Konačno, trake su detektirane korištenjem LumiGLO kemiluminescentnog sustava supstrata (KPL, Gaithersburg, Maryland, SAD).

Protočna citometrija

Nakon digestije tumorskog tkiva i jednostanične suspenzije je pripremljena. Površinsko bojenje je izvedeno s antitijelima na površinski antigen u FCM (Flow Cytometry) puferu (PBS koji sadrži 1 posto FBS) i bojano na ledu s odgovarajućim antitijelima 30 minuta. Za uklanjanje mrtvih stanica korištene su reaktivne boje (eBioscience). Intracelularno bojenje citokina provedeno je s BD otopinom za fiksiranje stanica/otopinom izvanstanične membrane, a stanice su fiksirane i prožete, a zatim obojene antitijelima protiv citokina u puferu Perm/Wash (BD Biosciences).

CTSB mutirani plazmidi transficirani

HCT-116 stanice su nasađene u 6-pločice s jažicama tijekom 12 sati i zatim transficirane s CTSB-WT-EGFP ili CTSB mutantnim plazmidima (Y75A, A77V i G198A) tijekom 36 sati.

Interferencija transfekcije ili prekomjerna ekspresija plazmida CTSB u MC38 stanice ili HCT-116 stanice

MC38 stanice (1×106 /jažici) su inokulirane u 6-pločice s jažicama tijekom 6 sati, zatim transficirane s CTSB interferirajućom RNA (sekvenca: naprijed-GGACAUAGAUCUACCUGAATT i obrnuto-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) tijekom 48 sati, a razine ekspresije mRNA ili proteina Ctsb i H2-k1 su otkriveni. HCT-116 stanice (1×106 /jažici) inokulirane su u 6-pločice s jažicama tijekom 6 sati, zatim transficirane CTSB interferencijom (sekvenca: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) ili prekomjerno ekspresijskim plazmidom tijekom 48 sati, a mRNA ili su otkrivene razine ekspresije proteina CTSB i HLA-A.

Docking tehnologija

3D struktura CTSB-a preuzeta je iz Protein Database (PDB ID: 2iPP), a strukture CAG-a preuzete su s PubChem-a. Proces spajanja izveden je u Autodocku 2 s grubim spajanjem pomoću simuliranog algoritma žarenja i naknadnim usavršavanjem korištenjem genetskog algoritma.

Test stanične toplinske promjene

MC38 stanice su zasađene u ploče od 10cm preko noći i zatim tretirane s CAG ili 0,1 posto DMSO još 2 sata. Stanice su sakupljene, isprane hladnim PBS-om i centrifugirane na 180 g tijekom 5 minuta. Stanice su zatim ravnomjerno podijeljene u epruvete za centrifugiranje (70 µL svaka epruveta) i zagrijavane 3 minute na sljedećoj temperaturi: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 i 67 stupnjeva, uzorci su ohlađeni 3 minute na temperaturama i zatim držao na ledu. Zatim su uzorci preko noći stavljeni u hladnjak na -80 stupnjeva. Uzorci su odmrznuti na sobnoj temperaturi 30 minuta, a zatim ohlađeni na -80 stupnjeva 4 sata. Konačno, uzorci su centrifugirani na 12, 000g tijekom 25 minuta, supernatant je dodan puferu za punjenje i analiziran Western blotom.

Imunohistokemijsko bojenje

Parafinske sekcije tumorskog tkiva uronjene su u ksilen na 20 minuta radi deparafinacije, a zatim u 100 postotni, 75 postotni i 50 postotni etanol na 10 minuta. Nakon što su kriške podvrgnute popravku antigena otopinom za popravak antigena natrijevim citratom, endogeni vodikov peroksid je inaktiviran s 3 postotnim vodikovim peroksidom. Nakon blokiranja s 5 posto kozjeg seruma tijekom 1 sata, dodano je anti-Ki67 antitijelo (1:200) i inkubirano preko noći na 4 stupnja. Dodan je anti-mišji/zečji HRP obilježeni polimer (100 µL) i uzorci su inkubirani na 37 stupnjeva 30 minuta, nakon čega je dodano 100 µL DAB radne otopine i inkubacija na sobnoj temperaturi 5 minuta. Nakon 1 minute bojenja hematoksilinom, uzorci su isprani u 50 postotnom, 75 postotnom i 100 postotnom etanolu i ksilenu tijekom 5 minuta, a neutralna guma korištena je za zatvaranje filma. Film je promatran i fotografiran pod mikroskopom.

Statističkianaliza

Statistička analiza provedena je pomoću softvera GraphPad Prism (V.8.0). Svi rezultati izraženi su kao srednja vrijednost±SEM tri neovisna eksperimenta. Jednosmjerna analiza varijance praćena Dunnettovim post hoc testom korištena je za procjenu razlika kada je bilo više od dvije skupine. Za procjenu značajne razlike između dvije skupine korišten je Studentov t-test. Statistička značajnost postavljena je na str<0.05.

REZULTATI

Jednostanična multi-omika analiza CAG-a koji inhibira rast transplantiranog raka debelog crijeva u miševa

Kako bismo istražili ima li CAG antitumorski učinak, prvo smo transplantirali MC38 stanice raka u C57BL/6 miševe. Primijetili smo da je CAG značajno inhibirao rast tumora (mrežna dodatna slika S1A, B). Nakon toga smo transplantirali CT26 stanice u BALB/c miševe i otkrili da CAG također inhibira rast tumora (online dodatna slika S1C, D).

Kako bismo dodatno otkrili specifični mehanizam kojim CAG inhibira rast tumora, analizirali smo ga pomoću tehnika scRNA-seq i scATAC-seq (slika 1A). Staničnu populaciju podijelili smo u četiri skupine: stanice raka, fibroblasti, mijeloične stanice i limfociti (slika 1B, dopunska online slika S2A, B). Otkrili smo da su stanice raka (52 posto) i fibroblasti (41 posto) uglavnom infiltrirane u tumorska tkiva, dok su imunološke stanice činile samo 7 posto. Zatim smo podijelili stanice raka u osam podskupa, a fibroblaste u tri podskupa (slika 1C–E). Naknadno je analiza obogaćivanja visoko izraženih gena u svakoj staničnoj populaciji pokazala da su molekularni putovi MHC-I u stanicama raka obogaćeni, kao i antitumorski signali T stanica i NK stanica (online dodatna slika S2C). Zatim su također pronađene četiri skupine stanica pomoću analize integracije scATAC-seq i scRNA-seq (slika 2D–G). Nakon usporedbe, otkrili smo da su se stanice raka (C01, C03 stanice), CD8 plus T stanice, Spp1 plus TAM stanice i fibroblasti (F01 i F02 stanice) pojavile u ATAC sekvenciranju (slika 1F, G), i nadalje, visoko izražene transkripcijski faktori su obogaćeni u tim stanicama (slika 1H). Ovim analizama nagađamo da je inhibicija rasta tumora CAG-om usko povezana s promjenama u tim stanicama.

Cag potiče prezentaciju antigena tumorskih stanica

Kako bismo analizirali antitumorski mehanizam CAG-a, prvo smo analizirali populaciju tumorskih stanica i podijelili stanice raka u osam podskupina (slika 2A, B, dopunska online slika S3A). Rezultati su pokazali da su se, u usporedbi sa skupinom PBS, stanice skupine C05 značajno smanjile dok su se stanice skupine C07 povećale (slika 2C). U međuvremenu, kako bismo provjerili točnost našeg grupiranja tumorskih stanica, usporedili smo CNV limfocita i mijeloidnih stanica kao referentnih stanica. Rezultati su pokazali da je CNV stanica raka bio znatno viši od onog imunoloških stanica (dodatna online slika S3B). Pri analizi podskupa stanica raka, otkrili smo da su geni odgovora na interferon Isg15, Irf7, Ifit3 i Ifi47 bili visoko eksprimirani u populacijama stanica C07 i C08 CAG skupine u usporedbi s PBS skupinom (mrežna dodatna slika S3C). Analizom populacije tumorskih stanica utvrđeno je da su putevi povezani s prezentacijom antigena značajno obogaćeni u više staničnih populacija. Stoga nagađamo da CAG može pospješiti prezentaciju antigena stanica raka kako bi igrao antitumorsku ulogu (slika 2D). Zatim smo odabrali gene povezane s prezentacijom antigena i otkrili da je razina ekspresije u CAG skupini bila znatno viša od one u PBS skupini (slika 2E, dodatna online slika S3D). Također smo otkrili da CAG promovira prezentaciju antigena u tumorskim tkivima (slika 2F, G).

Zatim smo upotrijebili scATAC-seq za analizu specifičnih razloga koji stoje iza prezentacije antigena tumorskih stanica koja promiče CAG. Otkrili smo da populacija tumorskih stanica visoko izražava faktore transkripcije Fos, Junb, Jund, Fosb i Fosl1 (slika 2H, I). Naknadno smo konstruirali kartu interakcije između faktora transkripcije i odgovarajućih gena kako bismo objasnili da CAG potiče ekspresiju gena povezanih s predstavljanjem antigena tumorskih stanica (slika 2J). U tkivima tumora također smo otkrili da su faktori transkripcije Junb, Fos, Jund i Fosb bili značajno prekomjerno izraženi u PBS skupini pod CAG tretmanom (slika 2K–N, dodatna online slika S3E-I). Do sada smo otkrili da CAG može pospješiti ekspresiju faktora transkripcije gena povezanih s predstavljanjem antigena, čime se pojačava funkcija predstavljanja antigena stanica raka. Međutim, kako te stanice raka reagiraju na reakcije imunoloških stanica ostaje nejasno.

Kako bismo otkrili fenomen kojim CAG potiče prezentaciju antigena stanica raka, proveli smo analizu putanje kako bismo istražili kako stanice raka mijenjaju jedna drugu kao odgovor na odgovor imunoloških stanica. Otkrili smo da su se s vremenom stanice raka C07 transformirale u stanice C05, C06 i C08, a obogaćivanje gena također je pokazalo da se stanice raka transformiraju u prezentaciju antigena (slika 3A–E).

CAG pojačava funkciju ubijanja imunoloških stanica

Ovi rezultati pokazuju da CAG može predstaviti antigene tumorskih stanica, pa hoće li povećanje prezentacije antigena tumorskih stanica dovesti do poboljšanja funkcije imunoloških stanica? Da bismo to shvatili, analizirali smo limfocite, odnosno mijeloične stanice. Rezultati su pokazali da CAG pospješuje infiltraciju CD8 plus T stanica u tumorska tkiva, a infiltracija CD8 plus T stanica i NK stanica također je povećana, otkriveno protočnom citometrijom (mrežna dodatna slika S4A-F). Također smo primijetili da CAG pojačava ekspresiju Ifitm2, Cxcr6 i S100a6 gena u CD8 plus T stanicama,

Geni Fcer1g, Gzmb, AW112010 i Zfp36i2 u NK stanicama, te geni Nfkbia i Junb u CD4 plus T stanicama (mrežna dodatna slika S4G). Ekspresija Ifng i Gzmb u CD8 plus T stanicama također je značajno pojačana, što je otkriveno protočnom citometrijom (mrežna dodatna slika S4H, I). Nadalje, otkrili smo da se nakon tretmana CAG-om smanjila ekspresija inhibitornih receptora Lag3, Tigit i Havcr2 na površini CD8 plus T stanica, a ekspresija gena Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5 i Pdcd1 karakterizira aktivacija CD8 plus T stanica, značajno povećana (mrežna dodatna slika S4J). Kako bismo dodatno potvrdili da CAG pojačava funkciju ubijanja CD8 plus T stanica promičući poboljšanu prezentaciju tumorskog antigena, transplantirali smo CT26 stanice u transplantirane tumore golih miševa i uočili da CAG ne može učinkovito inhibirati rast tumora (dodatna internetska slika S4K-M ).

Nakon toga, analizirali smo mijeloične stanice i otkrili da su Spp1 plus TAM stanice porasle nakon tretmana CAG-om, dok se broj C1qc plus TAM stanica smanjio, a broj Il1b plus monocita povećao (mrežna dodatna slika S5A-D). Nakon tretmana CAG-om, stanice Spp1 plus TAM i C1qc plus TAM bile su osjetljivije na proupalnu TAM transformaciju. Analiza obogaćivanja otkrila je da se uglavnom usredotočuje na Tnf-, Ifn-g i signalni put upalnog odgovora (mrežna dodatna slika S5E-H). Na temelju gore navedenih rezultata, zaključujemo da CAG pojačava funkciju prepoznavanja i ubijanja imunoloških stanica promicanjem prezentacije antigena u stanicama raka. Međutim, nije jasno kako je CAG reguliran.

Otkriće ciljnog proteina CAG CTSB pomoću zamke

Zatim ćemo istražiti specifični ciljni protein CAG koji ima antitumorsku ulogu. Odabrali smo stanice raka kao predmet istraživanja jer smo otkrili da CAG može poboljšati prezentaciju antigena stanica raka, čime se pojačava funkcija ubijanja imunoloških stanica. Prvo smo sintetizirali biotinski derivat CAG-a i otkrili da samo 3-OH može reagirati (mrežna dodatna slika S6A). Zatim smo istražili potiče li CAG-biotin i ekspresiju gena povezanih s prezentacijom antigena u staničnoj liniji tumora miša MC38. Rezultati pokazuju da CAG-biotin nije utjecao na ekspresiju gena H2-K1, Cd74 i Anxa1 (mrežna dodatna slika S6B-D).

Stoga smo u laboratoriju koristili prethodnu metodu traženja cilja TRAP.32 CAG i DMSO su inkubirani sa staničnom linijom MC38 (slika 4A). Izabrali smo protein s FC većim od ili jednakim 2 i ap manjim od ili jednakim 0.05 kao ciljni protein kandidata za CAG. Slijedeći načelo da će vezanje malih molekula na proteine ​​dovesti do niske učinkovitosti označavanja lizina, odabrali smo CTSB za studiju (slika 4B). Zatim smo upotrijebili test staničnog toplinskog pomaka (slika 4C) i mikroforezu (MST) (slika 4D) kako bismo potvrdili vezanje između CAG i CTSB i otkrili da je afinitet između CAG i CTSB bio 26,6 nM (slika 4D). Nakon toga smo predvidjeli mjesta vezivanja između CAG i CTSB prema proteinskoj kristalnoj strukturi CTSB u PDB biblioteci. Otkrili smo da su hidroksilne skupine na oba kraja CAG i ALA77 i GLY198 mjesta CTSB-a vezane vodikovom vezom, dok su TYR75, PRO76 i ALA173 mjesta CAG-a i CTSB-a vezane van der Waalsovom silom (slika 4E) . Kako bismo potvrdili vezno mjesto između CAG i CTSB, transficirali smo mutirani plazmid CTSB u HCT-116 stanice. Rezultati pokazuju da je afinitet između mutantnog plazmida na A77V i G198A i CAG bio stotinama puta veći od afiniteta WT plazmida (slika 4F, G). U sljedećem odjeljku istražujemo specifični mehanizam pomoću kojeg CAG ima antitumorsku ulogu kroz CTSB.

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】