Ciljanje na uznapredovali rak prostate s STEAP1 kimernim antigenskim receptorom T-stanica i tumorski lokaliziranom IL{2}} imunoterapijom

Šest transmembranskih epitelnih antigena prostate 1 (STEAP1) je stanični površinski antigen za terapijsko ciljanje kod raka prostate. Ovdje izvješćujemo o širokoj ekspresiji STEAP1 u odnosu na membranski antigen specifičan za prostatu (PSMA) u smrtonosnim metastatskim karcinomima prostate i o razvoju terapije T-stanica usmjerene na STEAP1-kimerni antigenski receptor (CAR). STEAP1 CAR T stanice pokazuju reaktivnost u niskoj gustoći antigena, antitumorsku aktivnost na modelima metastatskog raka prostate i sigurnost u ljudskom STEAP1 modelu miša. Izbjegavanje antigena STEAP1 ponavljajući je mehanizam otpornosti na liječenje i povezano je sa smanjenom obradom i prezentacijom tumorskog antigena. Primjena tumorski lokalizirane terapije interleukinom-12 (IL-12) u obliku fuzijskog proteina domene vezanja kolagena (CBD)-IL-12 u kombinaciji sa STEAP1 CAR T staničnom terapijom poboljšava antitumorska učinkovitost remodeliranjem imunološki hladnog tumorskog mikrookruženja raka prostate i suzbijanjem bijega antigena STEAP1 kroz angažman imuniteta domaćina i širenje epitopa.

Kineska biljka cistanche - Antitumor

Metastatic prostate cancer represents an incurable disease responsible for over 33,000 deaths per year in the United States1. Prostate cancer is critically reliant on androgen receptor (AR) signaling and thus the suppression of gonadal androgen production through surgical or chemical castration (androgen deprivation therapy) has been a mainstay of treatment for advanced disease. However, metastatic prostate cancer inevitably develops resistance to androgen deprivation therapy and enters a stage called metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). mCRPC is currently incurable and is considered the end stage of the disease and is associated with a median overall survival of three years2. In the past decade, multiple therapies including an inhibitor of extragonadal androgen synthesis (abiraterone acetate)3, second-generation AR antagonists (enzalutamide)4, radioactive isotope (radium-223)5, and a prostate-specific membrane antigen (PSMA)-specific radioligand therapy (lutetium Lu 177 via votide tetraxetan)6 have been approved for mCRPC. Each of these agents extends survival on average by several months but long-term remissions are rare. Strategies to reprogram the immune system to combat prostate cancer first gained traction with the clinical approval of the dendritic cell vaccine sipuleucel-T for asymptomatic mCRPC7. More recently, several types of immunotherapies including immune checkpoint inhibitors, a DNA cancer vaccine, antibody-drug conjugates (ADC), T cell engaging bispecific antibodies (T-BsAb), and chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapies have been under active clinical investigation8,9. CARs are synthetic receptors that leverage the potency, expansion, and memory of T cells and can be engineered against virtually any tumor-associated cell surface antigen. The adoptive transfer of CAR T cells has rapidly become an established treatment for hematologic malignancies with exceptional response rates leading to six clinical approvals in the last five years10. In contrast, CAR T cell therapies targeting solid tumors have lagged due to additional challenges related to the lack of bona fide tumor-specific antigens, inhospitable tumor microenvironments, and poor trafficking, persistence, and expansion of CAR T cells11. Despite the challenges observed in driving effective immune responses toward solid tumors, recent early-phase clinical trials investigating CAR T cell therapies targeting PSMA in mCRPC have reported safety and evidence of significant biochemical and radiographic responses12,13. These preliminary results serve to embolden efforts to develop and optimize new CAR T cell therapies for prostate cancer. While PSMA is the preeminent target for therapeutic and diagnostic development in prostate cancer, recent work indicates that PSMA expression may be quite heterogeneous in mCRPC14. Tumor antigen heterogeneity, especially in the context of single antigen-targeted CAR T cell therapies for solid tumors like prostate cancer, is an important barrier to therapeutic efficacy15. Thus, identifying cell surface antigens with broad and relatively homogeneous expression in prostate cancer is imperative. In addition, very few if any tumor-associated antigens demonstrate tumor-restricted expression—most also exhibit low-level expression in normal tissues that could represent liabilities for CAR T cell therapies due to on-target off-tumor toxicities which can lead to devastating consequences including death16. We previously performed integrated transcriptomic and cell surface proteomic profiling of human prostate adenocarcinoma cell lines and identified six transmembrane epithelial antigens of the prostate 1 (STEAP1) as one of the most highly enriched cell surface antigens17. STEAP1 was first described over two decades ago18 and was recognized as being highly expressed in prostate cancer. STEAP1 is strongly expressed in >80% mCRPC-a sa zahvaćenošću kostiju ili limfnih čvorova19, 62% Ewingovog sarkoma20 i više drugih vrsta raka21. STEAP1 pripada obitelji STEAP Metallo reduktaza koje mogu tvoriti homotrimere ili heterotrimere s drugim STEAP proteinima22. STEAP1 ima utvrđenu funkcionalnu ulogu u promicanju proliferacije stanica raka, invazije i prijelaza iz epitela u mezenhim–26.

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

Nadalje, STEAP1 pokazuje ograničenu ekspresiju u normalnom tkivu27 što ga čini vrlo uvjerljivom metom za terapiju raka. Razvijeno je više imunoterapijskih sredstava za ciljanje STEAP1, no niti jedno nije klinički odobreno. Utvrđeno je da ADC vandor tuzumab ved otin (DSTP3086S) koji se sastoji od humaniziranog anti-STEAP1 IgG1 protutijela povezanog s monometil auristatinom E ima prihvatljiv sigurnosni profil u kliničkom ispitivanju faze I u mCRPC-u, ali je primijećeno nekoliko objektivnih tumorskih odgovora28. Trenutačno se procjenjuje T-BsAb koje uključuje dvije anti-STEAP1 domene vezanja fragmenta antigena (Fab), anti-CD3 jednolančani varijabilni fragment (scFv) i domenu kristalizirajućeg fragmenta (Fc) projektiranu tako da nema efektorsku funkciju nazvanu AMG 509 u kliničkom ispitivanju faze I (NCT04221542) u mCRPC29. Također je nedavno objavljeno da asimetrični dvostruki bivalentni T-BsAb nazvan BC261 pokazuje snažnu antitumorsku aktivnost u više pretkliničkih modela raka prostate i Ewingovog sarkoma30. Osim toga, pokazalo se da ljudski leukocitni antigen (HLA) klase I-restriktirani T-stanični receptor (TCR) specifičan za STEAP1 peptid inhibira lokalni i metastatski rast Ewingovog sarkoma u predkliničkom modelu ksenografta nakon adaptivnog prijenosa transgenih T stanica31. U ovoj studiji provodimo komparativnu analizu relativne ekspresije STEAP1 i PSMA u smrtonosnom mCRPC-u kako bismo istražili korisnost ciljanja STEAP1 u trenutnoj eri teranostike PSMA. Projektiramo i ispitujemo STEAP1 CAR druge generacije za aktivaciju T-stanica specifičnu za antigen i citolizu ciljnih stanica kako bismo dobili glavnog kandidata za daljnju karakterizaciju. Određujemo specifičnost funkcionalnog epitopa STEAP1 CAR T stanica i profiliramo ekspanziju i imunofenotip STEAP1 CAR T staničnih produkata višestrukih donora. Zatim utvrđujemo moć i preliminarnu sigurnost terapije STEAP1 CAR T stanicama u relevantnim pretkliničkim modelima raka prostate, ali promatramo ponavljajući gubitak ekspresije STEAP1 antigena kao mehanizam otpornosti na liječenje. Kako bismo prevladali ovaj problem, procjenjujemo istodobnu primjenu CBD-IL-12 koji preoblikuje imunosupresivno tumorsko mikrookruženje raka prostate i uključuje endogeni imunitet za širenje antitumorskih odgovora. Zajedno, ove studije daju snažno obrazloženje za kliničko prevođenje terapije STEAP1 CAR T stanicama na muškarce s mCRPC-om i usmjeravaju strategije za prevladavanje potencijalnih mehanizama terapeutske rezistencije.

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

Rezultati

STEAP1 je široko izražen u mCRPC tkivima otpornim na liječenje

We first set out to determine the pattern and extent of STEAP1 expression relative to PSMA in advanced metastatic prostate cancer. We performed immunohistochemical (IHC) staining on a duplicate set of tissue microarrays consisting of 121 metastatic tumors (each with up to three cores represented) collected from 44 men with lethal mCRPC patients collected by rapid autopsy between the years 2010 and 2017 through the University of Washington Tumor Acquisition Necropsy Program32 (Fig. 1a). Plasma membrane staining for STEAP1 and PSMA in each tissue was scored by a research pathologist and semiquantitative H-scores were determined based on the staining intensity (Supple mentary Fig. 1a) multiplied by the percentage of cancer cells staining at each intensity (Supplementary Fig. 1b). By implementing a minimal staining threshold with an H-score cut-off of 30, we found that 87.7% of evaluable matched mCRPC tissues (100 of 114) demonstrated staining for STEAP1 compared to only 60.5% (69 of 114) for PSMA (Fig. 1b). In addition, 28.1% of mCRPC tissues (32 of 114) showed STEAP1 but not PSMA staining (Fig. 1b, c) whereas only 0.9% (one of 114) exhibited PSMA but not STEAP1 staining. Based on these results, we used a linear mixed statistical model to determine that the odds of non-zero (H-score >{{0}}) bojenja bila su 22-puta (95% CI 6-173) veća za STEAP1 nego za PSMA, a izgledi za H-rezultat veći ili jednaki 3{{ 27}} su 84-puta (95% CI 30-317) viši za STEAP1 nego za PSMA. Srednji STEAP1 H-rezultat u kostima (193; 95% CI 171 do 215) bio je značajno viši nego u metastazama u limfnim čvorovima (razlika -48; 95% CI -21 do -76; p < 0.001) i značajno viši nego kod visceralnih metastaza (razlika -59; 95% CI -42 do -77; p < 0,001). Nije bilo značajne razlike između srednje vrijednosti STEAP1 H-rezultata u metastazama u limfnim čvorovima u usporedbi s visceralnim metastazama (razlika 11; 95% CI -16 do 39; p=0.4) (Dodatna slika 1c). Također smo uočili nekoliko slučajeva s heterogenom ekspresijom PSMA unutar jezgri (Slika 1d) što je u skladu s nedavnim izvješćem o intratumorskoj heterogenosti PSMA u biopsijama mCRPC-a14. Analiza na razini bolesnika korištenjem srednjeg praga H-rezultata većeg od ili jednakog 30 i McNemarovog testa otkrila je da je 95% pacijenata koji se mogu procijeniti (42 od 44) ​​imalo tumore s ekspresijom STEAP1 dok je 68% (30 od 44) ​​bilo pozitivno na PSMA (Dopunska slika 1d). Kako bismo proučili obrasce heterogenosti među pacijentima i unutar njih povezane s ekspresijom STEAP1 i PSMA, koristili smo H-rezultate STEAP1 i PSMA za procjenu hipergeometrijskih, Simpsonovih i Shannonovih rezultata raznolikosti. Promatrali smo dva obrasca ekspresije STEAP1 (Slika 1e) sa 68% (30/44) pacijenata koji pokazuju ekspresiju STEAP1 na svim metastatskim mjestima (visoki STEAP1) i 32% (14/44) pacijenata koji pokazuju metastatska mjesta sa i bez ekspresije STEAP1 (heterogeni STEAP1). Niti jedan pacijent nije identificiran kod kojih u svim metastatskim tkivima nedostaje ekspresija STEAP1. Slična analiza ekspresije PSMA u istoj kohorti otkrila je 45% (20/44) pacijenata s visokom ekspresijom PSMA, 32% (14/44) s heterogenom ekspresijom PSMA i 23% (10/44) bez ekspresije PSMA. Na temelju molekularne podklasifikacije mCRPC tkiva pomoću AR i ekspresije neuroendokrinog markera sinaptofizina (SYP) procijenjene IHC-om, većina pacijenata s visokom ili heterogenom ekspresijom STEAP1 i PSMA imala je AR-pozitivan rak prostate (AR+/SYP- ili AR+/SYP+), dok su oni bez ekspresije PSMA imali su AR-nulti rak prostate (AR-/SYP+ ili AR-/SYP-). Identificirali smo pozitivnu korelaciju između ekspresije STEAP1 i AR (p < 0,001) prilagođenim linearnim mješovitim modelom sa nasumičnim učinkom u slučajevima predstavljenim na mikronizu tkiva (dodatna slika 2a, b), što je bilo očekivano s obzirom da je STEAP1 androgen -regulirani gen33,34. Nasuprot tome, cijenjen je negativan trend između ekspresije STEAP1 i SYP (dodatna slika 2c). Ova otkrića sugeriraju da, poput PSMA35, ekspresija STEAP1 može biti izgubljena s neuroendokrinom transdiferencijacijom raka prostate.

Fig. 1 | Comparative analysis of STEAP1 and PSMA in lethal, metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). a Characteristics of the mCRPC tissues represented on University of Washington Tissue Acquisition Necropsy Tissue Microarray 92 (UW TAN TMA92). b Contingency table showing the frequency of mCRPC tissues with STEAP1 or PSMA IHC staining above or below an H-score threshold of 30. Micrographs of select mCRPC tissues after STEAP1 and PSMA IHC staining to highlight the (c) absence of PSMA but the presence of STEAP1 expression and (d) intratumoral heterogeneity of PSMA expression but not STEAP1. Scale bars = 50 µm. For panels (c, d) n = 332 mCRPC cores were immunostained for STEAP1 and PSMA. e Dot and box plot showing the distribution of STEAP1 (top) and PSMA (bottom) H-scores in 44 patients from the UW TAN TMA92 cohort. Each dot represents a tumor specimen/core (n = 319 cores for PSMA and 333 cores for STEAP1) and the color indicates the molecular subtype: AR+/SYP+ (red), AR+/SYP− (green), AR−/SYP+ (yellow) and AR−/SYP− (purple). Gray rectangles show interquartile ranges spanning the 25th to the 75th percentiles of PSMA H-scores from each patient. Bar plots (on the right) summarize the frequencies of patients classified based on STEAP1 and PSMA expression as no expression (all cores with H-score ≤30, light grey), heterogeneous expression (at least one core with H-score ≤30 and H-score >30, mid grey) and high expression (all cores with H-scores >30, tamnosiva). Izvorni podaci navedeni su u datoteci Izvorni podaci.

Develelement snažnog, antigen-specifičnog STEAP1 CAR

S obzirom na raširenu ekspresiju STEAP1 u kasnom stadiju mCRPC-a i njegovu prijavljenu funkcionalnu ulogu u napredovanju raka27,36,37, zatim smo započeli projektirati CAR druge generacije specifičan za lentivirusni STEAP1-. Koristili smo pCCL-c-MNDU3-X lentivirusnu okosnicu38 koja se naširoko koristila za gensku terapiju hematopoetskih matičnih stanica39, a ekspresija CAR-a u T stanicama koju pokreće unutarnji promotor MNDU3 pokazala se višom od one postignute s EFS promotor40. Kostimulacijska domena 4-1BB bila je favorizirana zbog svoje povezanosti s formiranjem memorije T stanica i produljenom postojanošću41, a uvedena je transmembranska domena CD28 jer se pokazalo da smanjuje antigenski prag za drugu generaciju 4-1BB Aktivacija CAR T stanica42. Uključili smo potpuno humanizirani scFv izveden iz vandor tuzumab vedotina, ADC koji cilja na STEAP1 čiji je razvoj prekinut nakon faze I kliničkog ispitivanja28. Ovaj scFv je humanizirana varijanta mišjeg monoklonskog protutijela (mAb 120.545) koji je izvorno razvio Agensys, Inc. koji pokazuje afinitet od 1 nM u testovima vezanja na stanici43. Kako bismo potencijalno prilagodili aktivnost CAR-a, implementirali smo tri različite duljine šarke/odstojnika, uključujući kratku (IgG4 šarka), srednju (IgG4 šarka-CH3) i dugu (IgG4 šarka-CH2- CH3). Dugi razmaknica konstruirana je s prethodno opisanim 4/2- NQ mutacijama44 u CH2 domeni kako bi se spriječilo vezanje Fc-gama receptora i stanična smrt izazvana aktivacijom do koje dolazi usvajanjem prijenosa dugih razmaknica CAR T stanica u imunodeficijentne miševe. Tri kandidata CAR-a klonirana su u lentivirusni vektor (Slika 2a) koji također koeksprimira skraćeni receptor epidermalnog faktora rasta (EGFRt) kao transdukcijski marker. Lentivirusi su generirani i korišteni za transdukciju ljudskih CD4 i CD8 T stanica obogaćenih iz mononuklearnih stanica periferne krvi humanih donora (PBMC) prikupljenih ferezom. Ekspandirane CD4 i CD8 CAR T stanice imunofenotipizirane su (dopunska slika 3a) i rekonstituirane u stanične proizvode definiranog sastava s normalnim omjerom CD4/CD8 kako bi se procijenile njihove funkcionalne aktivnosti. Kako bismo kontrolirali ekspresiju STEAP1 na izogeni način, usredotočili smo se na staničnu liniju 22Rv1 ljudskog raka prostate koja pokazuje nativnu ekspresiju STEAP1 i izvršili nokaut STEAP1 (ko) uređivanjem genoma CRISPR/Cas9. Zatim smo generirali STEAP1 spasilačku liniju iz 22Rv1 STEAP1 ko transdukcijom sa STEAP1 ekspresijom lentivirusa (slika 2b). Ove su linije zatim korištene za probir tri kratke, srednje i duge razmaknice STEAP1 CAR T stanice u testovima kokulture s očitavanjem otpuštanja interferona-gama (IFN-) kao pokazatelja aktivacije T stanica. Samo duge razmaknice STEAP1 CAR T stanice (dalje u tekstu STEAP1-BBζ CAR T stanice) pokazale su očekivani antigen-specifični obrazac oslobađanja IFN-a, dok kratke i srednje razmaknice STEAP1 CAR T stanice nisu (slika 2c). , Dodatna slika 3b, c). Nadalje, STEAP1-BBζ CAR T stanice pokazale su značajnu citolizu 22Rv1 stanica ovisnu o dozi u usporedbi s netransduciranim T stanicama (Slika 2d) i pokazala relativnu uštedu 22Rv1 STEAP1 ko stanica (Slika 2e). Slične studije zatim su provedene na DU145 staničnoj liniji raka prostate kod ljudi koja nema nativnu ekspresiju STEAP1, ali je projektirana za ekspresiju STEAP1 (DU145 STEAP1) lentivirusnom transdukcijom (dopunska slika 4a). U ovoj postavci, aktivacija T stanica STEAP1-BBζ CAR primijećena je samo u kokulturama sa stanicama DU145 STEAP1, a ne roditeljskim stanicama DU145 (dopunska slika 4b). Citolitička aktivnost cijenjena je samo sa STEAP1-BBζ CAR T stanicama, a ne s netransduciranim T stanicama u ko-kulturama sa DU145 STEAP1 stanicama (dopunska slika 4c). Naknadno smo analizirali veći panel staničnih linija ljudskog raka prostate kako bismo okarakterizirali njihovu nativnu ekspresiju STEAP1 imunoblot analizom. Stanične linije s poznatom ekspresijom/aktivnošću AR (LNCaP, 22Rv1, VCaP i LNCaP95) pokazale su različite razine ekspresije STEAP1 dok se čini da stanične linije AR-nulte (PC3, DU145, MSKCC EF1 i NCI-H660) ne ekspresiraju detektabilne razine STEAP1 (slika 2f). Nastavili smo s kokulturiranjem STEAP1-BBζ CAR T s ovim linijama kako bismo dodatno potvrdili njihovu antigen-specifičnu aktivaciju na temelju otpuštanja IFN-a (Slika 2g). Međutim, primijetili smo neskladan nalaz u tome što linija PC3, koja nije pokazala očitu ekspresiju proteina STEAP1 (Slika 2f), inducira značajnu aktivaciju STEAP1-BBζ CAR T stanica. Prethodna literatura sugerirala je da se STEAP1 eksprimira u PC3 staničnoj liniji na niskim razinama45. Doista, produženo izlaganje imunoblotu otkrilo je vrpcu koja sugerira prisutnost vrlo niske ekspresije STEAP1 (slika 2h). Kako bismo potvrdili je li aktivacija STEAP1-BBζ CAR T stanica nastala zbog ove manje ekspresije STEAP1 u PC3 stanicama, generirali smo tri podlinije PC3 STEAP1 ko (Slika 2h) i ponovno izveli kokulture sa STEAP{{133} }BBζ CAR T stanice. STEAP1 ko u liniji PC3 doveo je do ukidanja aktivacije STEAP1-BBζ CAR T stanica (Slika 2i), dodatno potvrđujući specifičnost i pružajući dokaze o osjetljivosti STEAP1-BBζ CAR T stanica na niske uvjeti gustoće antigena.

Nedostatak unakrsne reaktivnosti STEAP1-BBζ CAR s mišjim Steap1 i ljudskim STEAP1B

koristi dodatka cistanche-povećavaju imunitet

U skladu s antiljudskom specifičnošću vandor tuzumab vedotina, STEAP1-BBζ CAR T stanice nisu pokazale unakrsnu reaktivnost s mišjim Steap1 (dodatna slika 4a, d, e). Međutim, ovo smo iskoristili kao priliku da pojedinačno rekonstituiramo tri ljudske STEAP1 izvanstanične domene (ECD) na mišjem Steap1 (dopunska slika 4f) kako bismo odredili koji su ECD kritični za prepoznavanje epitopa od strane STEAP1-BBζ CAR T stanica. Eksperimenti zajedničkog uzgoja provedeni su sa STEAP1-BBζ CAR T stanicama i DU145 stanicama projektiranim za ekspresiju mišjeg Steap1 uz pojedinačnu zamjenu mišjih ECD-ova ljudskim ECD-ovima. Otkrili smo da je ljudski STEAP1 ECD2, ali ne i ECD1 ili ECD3, bio povezan s aktivacijom STEAP1-BBζ CAR T stanica (dopunska slika 4g). Zanimljivo je da su ljudski STEAP1 i mišji Steap1 ECD2 pokazali 93,9% (31/33 aminokiseline) homologije (dodatna slika 4h), što ukazuje da su Q198 i/ili I209 ljudskog STEAP1 ključni za produktivno prepoznavanje pomoću STEAP1-BBζ CAR T stanice. Pokazalo se da Q198 stupa u interakciju s Fab od 120.545 kao dio interakcijske vruće točke na temelju nedavne strukture razlučene kriogenom elektronskom mikroskopijom22. Od ljudske STEAP obitelji proteina, STEAP1B ima najveću homologiju sa STEAP145. Identificirana su tri transkripta STEAP1B, od kojih svi pokazuju potpunu očuvanost sekvence aminokiselina ljudskog STEAP1 ECD2 (dodatna slika 5a). Algoritam za predviđanje konsenzusne membranske topologije TOPCONS46 predvidio je sekvence domene ECD2 kao izvanstanične u tri izoforme proteina STEAP1B (dodatna slika 5b), iako s rezultatima niske pouzdanosti za STEAP1B u usporedbi s hSTEAP1 zbog nedostatka konsenzusa između pet modela predviđanja topologije (HOBOTNICA, Philius, PolyPhobius, SCAMPI i SPOCTOPUS) koje koristi TOPCONS (dopunska slika 5c). Prethodna analiza korištenjem drugog in silico skrivenog alata za predviđanje topologije temeljenog na Markovljevom modelu TMHMM47 također je sugerirala da bi ovaj slijed mogao biti unutarstanični, a ne izvanstanični u izoformama 1 i 245 proteina STEAP1B. Međutim, kristalna struktura STEAP1B još nije utvrđena da izravno potkrijepi ova predviđanja. Kako bismo funkcionalno procijenili mogu li STEAP1- BBζ CAR T stanice također biti reaktivne na STEAP1B, izveli smo kokulture koristeći DU145 linije projektirane za ekspresiju svake od tri izoforme STEAP1B. Nismo identificirali dokaze o aktivaciji STEAP1-BBζ CAR T stanica (dodatna slika 5d), što sugerira da epitop STEAP1 prepoznat od strane STEAP1-BBζ CAR T stanica možda nije predstavljen kao dio ektodomene pomoću STEAP1B unatoč očitoj homologiji sekvence.

Slika 2|Probir druge generacije 4-1BB kimernih antigenskih receptora (CARs) za identifikaciju vode za STEAP1 CAR T staničnu terapiju. Shema lentivirusnog STEAP1 CAR konstrukta i varijacija na temelju kratkih, srednjih i dugih odstojnika. LTR dugo terminalno ponavljanje, MNDU3 Moloney U3 regija virusa mišje leukemije, scFv jednolančani varijabilni fragment, VL varijabilni laki lanac, VH varijabilni teški lanac, tm transmembrana, EGFRt skraćeni receptor epidermalnog faktora rasta, 4/2 NQ {{1{{28 }}}} Mutacije CH2 domene za sprječavanje vezanja na Fc-gama receptore. b Imunoblotovi STEAP1 u 22Rv1 roditeljskim stanicama, STEAP1 knockout (ko) stanicama i STEAP1 ko stanicama sa spašavanjem STEAP1. c IFN-enzimski imunosorbentni test (ELISA) rezultat je ko-kultura netransduciranih T stanica ili STEAP1-BBζ CAR T stanica sa svakom od 22Rv1 podlinija u omjeru 1:1 nakon 24 sata (p < 0.001). Relativna održivost stanica (d) 22Rv1 i (e) 22Rv1 STEAP1 ko ciljnih stanica tijekom vremena mjerena fluorescentnim prikazom živih stanica nakon sukulture s (lijevo) STEAP1-BBζ CAR T stanicama (p < 0,001) ili ( desno) netransducirane T-stanice u promjenjivim omjerima efektor-cilja (E:T). f Imunoblotovi koji pokazuju ekspresiju STEAP1 u staničnoj liniji raka prostate s pozitivnim androgenim receptorom (AR), ali ne i na AR-negativnoj staničnoj liniji raka prostate. g IFN-kvantifikacija pomoću ELISA iz kokultura bilo netransduciranih T stanica ili STEAP1- BBζ CAR T stanica sa svakom od staničnih linija ljudskog raka prostate u (f) u omjeru 1:1 nakon 24 sata. h Imunoblotovi za STEAP1 u 22Rv1, PC3 i PC3 STEAP1 ko podlinijama. I IFN-kvantifikacija pomoću ELISA-e iz kokultura bilo netransduciranih T stanica ili STEAP1- BBζ CAR T stanica sa svakom staničnom linijom u (h) u omjeru 1:1 nakon 24 sata (p < 0,001). Za ploče (c–e, g i i) korišteno je n=4 bioloških replika po uvjetu, a stupci pogrešaka predstavljaju srednju vrijednost sa SEM. Ploča (b, f, h) prikazuje rezultate reprezentativne za n=3 bioloških replika. GAPDH je korišten kao kontrola punjenja proteina. Za ploče (c) i (i) korištena je dvosmjerna ANOVA sa Sidakovim višestrukim usporednim testovima. Za ploče (d) i (e) korištena je dvosmjerna ANOVA s Tukeyjevim testom višestrukih usporedbi. Izvorni podaci navedeni su u datoteci Izvorni podaci.

Karakterizacija proizvoda STEAP1-BBζ CAR T stanica kod niza donatora

Zatim smo profilirali ekspanziju, učinkovitost transdukcije i imunofenotip STEAP1-BBζ CAR T-staničnih proizvoda koristeći tri neovisna skupa mononuklearnih stanica periferne krvi (PBMC) prikupljenih od zdravih donora. Općenito smo primijetili 20- do 40-struko širenje STEAP1-BBζ CAR T stanica unutar 11 dana kulture (dodatna slika 6a). Postotak EGFRt+ CD8 T stanica kretao se od 24,3 do 54,2%, dok je postotak EGFRt+ CD4 T stanica bio viši i kretao se od 60,1 do 74,9% u našim STEAP1-BBζ CAR T-staničnim proizvodima (dodatna slika 6b). Ispitali smo ekspresiju markera iscrpljenosti T stanica PD-1 i LAG-3 u netransduciranim i STEAP1- BBζ CAR podskupovima T stanica i nismo uočili značajan porast ekspresije (dodatna slika 6c ). Ovaj nalaz sugerirao je slabu ili odsutnu toničnu signalizaciju putem STEAP1-BBζ CAR, što je bilo ohrabrujuće jer konstitutivna CAR signalizacija može negativno utjecati na CAR T-staničnu efektorsku funkciju48. I fenotip T stanica pamćenja matičnih stanica (Tscm) i T stanica središnje pamćenja (TCM) povezani su s terapijskom učinkovitošću terapije CAR T stanicama jer potiču stalnu proliferaciju i postojanost in vivo49-51. Imunofenotipizacija netransduciranih i STEAP1-BBζ CAR podskupova T stanica pokazala je veće učestalosti Tscm stanica u usporedbi s podskupovima T stanica u donorskim PBMC iz kojih su stanični produkti izvedeni (dodatna slika 6d). Taj je učinak vjerojatno posljedica dodavanja IL-7 i/ili IL-15 mediju za ekspanziju T stanica jer se pokazalo da ti citokini čuvaju i pojačavaju diferencijaciju Tscm51,52. Naša analiza također je otkrila obogaćivanje Tcm populacija, posebno u CD8 STEAP1-BBζ CAR T stanicama (dodatna slika 6e).

STEAP1-BBζ CAR T stanice pokazuju značajne antitumorske učinke u modelima diseminiranog raka prostate s nativnom ekspresijom STEAP1 utvrđenom u imunodeficijentnim miševima

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Kao početni pregled za in vivo antitumorsku aktivnost, ustanovili smo 22Rv1 subkutane ksenograftske tumore u muških NOD scid gama (NSG) miševa. Kad su tumori narasli do približno 100 mm3, miševi su tretirani jednom intratumorskom injekcijom ili 5 × 106 netransduciranih T stanica ili STEAP1-BBζ CAR T stanica. Intratumorsko liječenje STEAP1- BBζ CAR T stanicama bilo je povezano sa značajnom inhibicijom rasta tumora koja je bila statistički značajna do 18. dana liječenja (slika 3a). Miševi su žrtvovani 25. dana, a rezidualni tumori miševa tretiranih STEAP1-BBζ CAR T stanicama pokazali su velika područja nekrotičnih ostataka, a regije održivog tumora infiltrirane su CD3+ STEAP1-BBζ CAR T stanice (dodatna slika 7a). Ekspresija STEAP1 bila je očuvana u tumorima u svim skupinama za liječenje (dodatna slika 7b). Transducirali smo 22Rv1 stanice s lentivirusom kako bismo pojačali ekspresiju luciferaze krijesnice (Luc), a 106 22Rv1-fLuc stanice ubrizgane su u repne vene muških NSG miševa. Metastatska kolonizacija vizualizirana je živom bioluminiscencijom (BLI) nakon dva tjedna, a tada su miševi tretirani jednom intravenskom injekcijom ili 5 × 106 netransduciranih T stanica ili STEAP1-BBζ CAR T stanica (Slika 3b) . Serijski BLI otkrio je brzu progresiju bolesti kod miševa liječenih netransduciranim T stanicama, dok su oni koji su primali STEAP1-BBζ CAR T stanice pokazali značajno kašnjenje u progresiji tumora (Slika 3c, d) i produženje preživljenja (97 dana u odnosu na 31 dan , p=0.0018 pomoću log-rank testa, slika 3e). Nije bilo značajne razlike u težinama miševa između krakova liječenja (dodatna slika 7c). IHC bojenje tumora na kraju studije pokazalo je značajno smanjenje ekspresije STEAP1 (dopunska slika 7d), što ukazuje da je bijeg antigena mehanizam otpornosti. Međutim, to je malo vjerojatno rezultat transdiferencijacije u varijantno stanje raka prostate jer nismo cijenili morfološke promjene, gubitak ekspresije AR i PSMA53 ili povećanje ekspresije SYP (dodatna slika 7d). Kako bismo istražili globalni utjecaj gubitka STEAP1 kod raka prostate, izvršili smo profiliranje transkriptoma izogenih 22Rv1 divljeg tipa (wt), 22Rv1 STEAP1 ko i 22Rv1 STEAP1 ko + spasilačkih staničnih linija koje smo prethodno pripremili (Slika 2b). Diferencijalna analiza ekspresije gena uspoređujući 22Rv1 STEAP1 ko stanice sa 22Rv1 wt stanicama identificirala je ~1700 gena značajno smanjeno reguliranih (FDR manji od ili jednak 0,05, promjena puta<2) with STEAP1 knockout. Rescue of STEAP1 expression in the 22Rv1 STEAP1 ko cells revealed that ~600 genes were significantly upregulated (FDR ≤ 0.05, fold-change>2) pomoću STEAP1 dodatka (dodatna slika 8a). Analiza obogaćivanja skupa gena (GSEA) nominirala je nekoliko bioloških putova koji bi mogli biti disregulirani modulacijom ekspresije STEAP1. Istaknuti među njima bili su progresija staničnog ciklusa i višestruki metabolički procesi, uključujući Krebov ciklus i glikolizu, koji su negativno obogaćeni nokautom STEAP1 i spašeni nakon povratnog dodavanja STEAP1 (dodatna slika 8b). Primijenili smo validirani 31-potpis progresije genskog staničnog ciklusa (CCP)54 na naše podatke koji su pokazali značajnu nižu regulaciju CCP potpisa povezanog sa STEAP1 nokautom s rezultatom −0.8 koji se značajno povećao na {{ 14}}.5 sa spašavanjem STEAP1 izraza (dopunska slika 8c). Ovi su podaci u skladu s prethodnom publikacijom koja ukazuje na to da obaranje STEAP1 u LNCaP staničnoj liniji raka prostate smanjuje vitalnost i proliferaciju stanica dok inducira apoptozu37. Također smo primijetili da je obrada i prezentacija antigena jedan od najznačajnijih de-obogaćenih KEGG puteva sa STEAP1 nokautom (dodatna slika 8b). Uočili smo značajnu nižu regulaciju gena uključujući PSME1 (podjedinica aktivatora proteasoma 1) koji je član imunoproteasomskog kompleksa, TAP1 (transporter 1, član potfamilije kazeta za vezanje ATP-a) koji je kritičan za glavni peptid klase I kompleksa histokompatibilnosti (MHC)- kompleks učitavanja i nekoliko MHC gena klase I i II kao što su MR1 (glavni kompleks histokompatibilnosti, povezan s klasom I), HLA-DQ-B1 i HLA-DQB2 (dodatna slika 8d). Dalje smo istražili tumore prikupljene iz 22Rv1 diseminiranih modela liječenih STEAP1- BBζ CAR T staničnom terapijom koja je pokazala gubitak antigena (Slika 3c, Dodatna slika 7d) analizom transkriptoma. Diferencijalna analiza genske ekspresije i naknadni GSEA usporedbom 22Rv1 metastatskih tumora iz miševa liječenih STEAP1-BBζ CAR T staničnom terapijom s onima liječenim netransduciranim T stanicama pokazali su negativno obogaćivanje putova uključenih u MHC, citotoksične limfocite i aktivaciju T stanica ( Dopunska slika 9a, b). Također smo posebno procijenili ekspresiju MHC gena klase I i II i uočili njihovu izraženu nižu regulaciju u 22Rv1 tumorima liječenim STEAP1-BBζ CAR T staničnom terapijom (dodatna slika 9c). Ovaj rezultat je dodatno potkrijepljen značajnim smanjenjem HLA-A, B, C bojenja IHC-om u tim tumorima (dodatna slika 9d). Potencijalna implikacija ovih podataka je da liječenje terapijom STEAP1-BBζ CAR T stanicama i rezultirajućim gubitkom ekspresije tumorskog antigena STEAP1 kod raka prostate može rezultirati daljnjom otpornošću na imunoterapiju kroz poremećenu obradu i prezentaciju antigena. Također smo inokulirali muške NSG miševe s C4-2B-fLuc stanicama injekcijom u repnu venu. C4-2B je podlinija LNCaP55 otporna na kastraciju s kinetikom rasta koja je više u skladu s tipičnim rakom prostate. Četiri tjedna nakon injekcije, BLI je potvrdio metastatsku kolonizaciju, a miševi su tretirani jednom intravenskom injekcijom ili 5 × 106 netransduciranih T stanica ili STEAP1-BBζ CAR T stanica (Slika 3b). Serijski BLI pokazao je potpuni odgovor kod svih miševa koji su primili STEAP1-BBζ CAR T stanice unutar pet tjedana liječenja (Slika 3f, g). Identificirali smo trend povećanog gubitka težine u skupini koja je primala netransducirane T-stanice (dodatna slika 10a), ali to nije bilo statistički značajno. Obdukcija miševa liječenih STEAP1-BBζ CAR T stanicama nije pokazala makroskopsku bolest, a ex vivo BLI organa nije otkrio nikakav signal (Dopunska slika 10b), što sugerira da su ti miševi vjerojatno izliječeni. Identificirali smo perifernu postojanost STEAP1-BBζ CAR T stanica na kraju eksperimenta na temelju prisutnosti detektabilnih CD3+ EGFRt+ splenocita (slika 3h).

Slika 3|In vivo antitumorska aktivnost STEAP1-BBζ CAR T stanične terapije u modelima raka prostate s nativnom ekspresijom STEAP1. a Volumeni 22Rv1 potkožnih tumora u NSG miševa (n=4 za skupinu netransduciranih T stanica i n=5 za skupinu STEAP1-BBζ CAR T stanica) tijekom vremena nakon jedne intratumoralne injekcije od 5 × 106 netransduciranih T stanica ili STEAP{{10}}BBζ CAR T stanica pri normalnim omjerima CD4/CD8. p < 0.0001 dana 20 i 25. Stupci predstavljaju srednju vrijednost sa SEM. b Shema eksperimenata izazivanja tumora za 22Rv1 (gore) i C4-2B (dolje) diseminirane modele. Luc luciferaza krijesnice, BLI bioluminiscencijska slika. c Serijska živa bioluminiscencijska slika (BLI) NSG miševa kojima su usađene metastaze 22Rv1-fLuc i liječeni jednom intravenskom injekcijom 5 × 106 netransduciranih T stanica ili STEAP1-BBζ CAR T stanica na normalnim CD4/ CD8 omjeri na dan 0. Crveni X označava uginule miševe. Prikazana je ljestvica zračenja. d Grafik koji prikazuje kvantifikaciju ukupnog protoka tijekom vremena iz živog BLI svakog miša u (c). e Kaplan–Meierove krivulje preživljavanja miševa u (c) sa statističkom značajnošću određenom logaritamskim (Mantel-Cox) testom. Za ploče (c–e) korišteno je n=5 miševa po uvjetima. f Serijski živi BLI NSG miševa kojima su usađene C4-2B metastaze i tretirani jednom intravenskom injekcijom 5 × 106 netransduciranih T stanica ili STEAP1-BBζ CAR T stanica pri normalnim omjerima CD4/CD8 na dan 0. Crveni X označava uginule miševe. Prikazana je ljestvica zračenja. g Grafik koji prikazuje kvantifikaciju ukupnog protoka tijekom vremena iz živog BLI svakog miša u (f). Za ploče (f, g) korišteno je n=4 miševa u skupini netransduciranih T stanica i n=5 miševa u skupini STEAP1-BBζ CAR T stanica. h Kvantifikacija CD3+ EGFRt+ STEAP1-BBζ CAR T stanica protočnom citometrijom iz splenocita miševa tretiranih STEAP1-BBζ CAR T stanicama (n=4) na kraju eksperimenta na dan 49. Stupci predstavljaju srednju vrijednost. Za panel (a) korištena je dvosmjerna ANOVA sa Sidakovim testom višestruke usporedbe. Izvorni podaci navedeni su u datoteci Izvorni podaci.

Studije STEAP1 CAR T stanica na mišu u mišu pokazuju antitumorsku terapijsku učinkovitost

Aktivacija i citolitička aktivnost STEAP1-BBζ CAR T stanica promatrana u kontekstu vrlo niske gustoće antigena STEAP1 (~1500 molekula/stanici) stanične linije PC3 (Slika 2g–i, Dodatna slika 11a, b ) i dokaz in vivo antitumorske aktivnosti u modelu diseminiranog tumora PC3-fLuc (dodatna slika 11c–e) iznijeli su zabrinutost u vezi s mogućnošću toksičnosti izvan tumora na meti. Kako bismo procijenili potencijalnu toksičnost u organizmu koji se može prilagoditi modelu, generirali smo ljudskog STEAP1 knock-in (hSTEAP1-KI) miša u kojem je ljudski STEAP1 gen ubačen u mišji genski lokus Steap1 na pozadini C57Bl/6 ( Slika 4a). Uspostavljena je mišja kolonija s genotipizacijom provedenom lančanom reakcijom polimeraze (PCR) repne DNA (slika 4b). I homozigotni i heterozigotni hSTEAP1-KI miševi nisu pokazali vidljive fenotipske ili reproduktivne abnormalnosti u usporedbi s divljim tipovima legla. Istraživanje tkiva za ekspresiju ljudskog STEAP1 temeljeno na kvantitativnoj reverznoj transkripciji PCR (qRT-PCR) provedeno je na muškim i ženskim heterozigotnim hSTEAP1-KI (hSTEAP1-KI/ + ) miševima i otkrilo je najveću relativnu ekspresiju u prostati, a zatim u maternici i nadbubrežnoj žlijezdi (slika 4c). Daljnja in situ analiza STEAP1 IHC muške hSTEAP1-KI/ + prostate i nadbubrežne žlijezde otkrila je ekspresiju ljudskog STEAP1 ograničenu na luminalne epitelne stanice prostate (Slika 4d) i ekspresiju u korteksu nadbubrežne žlijezde (Slika 4e) . Murinizirana verzija STEAP1 CAR, nazvana STEAP1-mBBζ CAR, u kojoj su scFv i IgG4 zglob-CH2-CH3 razmaknica zadržani, ali transmembranska domena CD28, 4-1BB kostimulacijska domena , a CD3ζ aktivacijska domena zamijenjena je njihovim mišjim ortolozima klonirana u gamaretrovirusni konstrukt (Slika 4f). Dodatno, ljudski EGFRt transdukcijski marker zamijenjen je s skraćenim mišjim CD19 (mCD19t) kako bi se smanjila potencijalna imunogenost. Potvrdili smo učinkovitu retrovirusnu transdukciju T stanica obogaćenih iz mišjih splenocita (Slika 4g) i pokazali sposobnost mišjih STEAP1-mBBζ CAR T stanica da induciraju citolizu RM9 stanične linije mišjeg raka prostate56 projektirane za ekspresiju ljudskog STEAP1 (RM9- hSTEAP1) lentivirusnom transdukcijom (slika 4h). In vivo učinkovitost mišjih STEAP1-mBBζ CAR T stanica potvrđena je u diseminiranom modelu tumora RM9-STEAP1-fLuc u NSG miševa (dopunska slika 12a). Tjedan dana nakon injekcije RM9-STEAP1-fLuc stanica u repnu venu, miševi su tretirani ili s 5 × 106 netransduciranih mišjih T stanica ili mišjim STEAP1-mBBζ CAR T stanicama injekcijom u repnu venu . Miševi koji su primili netransducirane mišje T stanice pokazali su neprovjereno napredovanje bolesti, dok su oni liječeni STEAP1-mBBζ CAR T stanicama ravnomjerno pokazali brzu regresiju bolesti nakon koje je uslijedio kasniji recidiv deset dana kasnije (dodatna slika 12b, c). STEAP1-mBBζ CAR T-stanična terapija bila je povezana sa statistički značajnim boljitkom u preživljavanju (22 dana naspram 12 dana, p=0.0039 pomoću log-rank testa, Dodatna slika 12d). Gubitak tjelesne težine bio je evidentan u obje terapijske skupine kako se opterećenje tumorom povećavalo prije smrti (dodatna slika 12e, f). Analiza mišjih splenocita prikupljenih pri nekropsiji pokazala je perifernu postojanost STEAP1-mBBζ CAR T stanica uz detekciju mCD3+ mCD19t+ stanica do 24 dana nakon adaptivnog prijenosa (dodatna slika 12g). Pluća su sakupljena od miševa u obje tretirane skupine i STEAP1 IHC pokazao je gubitak ekspresije STEAP1 u plućnim metastazama kod miševa tretiranih sa STEAP1-mBBζ CAR T stanicama (dodatna slika 12h). Naknadno smo proširili klonalne RM9-STEAP1-fLuc linije kako bismo utvrdili može li promatrano bježanje tumorskog antigena biti rezultat već postojeće heterogenosti u ekspresiji STEAP1. Eksperiment je ponovljen s klonskim, diseminiranim modelom tumora RM9-STEAP1- fLuc u NSG miševa (dodatna slika 13a). U tom kontekstu, miševi tretirani STEAP1-mBBζ CAR T stanicama pokazali su brz i trajan potpuni odgovor (dodatna slika 13b–d). Ovi nalazi naglašavaju moć STEAP1-mBBζ CAR T stanica u iskorjenjivanju STEAP1+ raka prostate i dalje sugeriraju da bi dodatne terapijske strategije mogle biti potrebne za prevladavanje rezistencije u podskupinama bolesnika s uznapredovalim rakom prostate gdje je heterogenost STEAP1 prisutna je ekspresija (slika 1e).

dobrobiti cistanche za muškarce-jačanje imunološkog sustava

Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda za jačanje imuniteta

【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Terapija STEAP1 CAR T stanicama sigurna je u humaniziranom mišjem modelu STEAP1

Kako bismo istražili predkliničku sigurnost i učinkovitost terapije STEAP1-mBBζ CAR T stanicama, cijepili smo mužjake heterozigotnih hSTEAP1-KI miševa singenim, neklonskim RM9-STEAP{{4} }fLuc stanica injekcijom u repnu venu (slika 5a). Nakon potvrde metastatske kolonizacije pomoću BLI otprilike tjedan dana kasnije, miševi su primili predkondicionirani ciklofosfamid 100 mg/kg intraperitonealnom injekcijom57. Dan kasnije, miševi su randomizirani za liječenje ili s 5 × 106 netransduciranih mišjih T stanica ili mišjim STEAP1-mBBζ CAR T stanicama injekcijom u repnu venu. Svi miševi koji su primili mišje STEAP1-mBBζ CAR T stanice pokazali su smanjenje opterećenja tumorom unutar prvog tjedna od početka liječenja na temelju BLI (Slika 5b, c). Opaženi odgovor bio je kratkog vijeka, ali je doveo do skromnog produženja preživljenja (21 dan naspram 12 dana, p=0.0138 po log-rank testu, slika 5d)—slično nalazima iz neklonalnog RM 9-STEAP1-fLuc eksperimenti na NSG miševima (dodatna slika 12d). Nije bilo velikih toksičnosti ili preuranjenih smrti koje su specifično povezane s mišjom terapijom STEAP1-mBBζ CAR T stanicama pri ovoj razini doze gdje su uočeni jasni dokazi antitumorske učinkovitosti. Gubitak tjelesne težine bio je povezan s povećanim opterećenjem tumorom, ali zajednički za obje skupine liječenja (Slika 5e, f). Kako bi se dodatno procijenila potencijalna toksičnost terapije STEAP1-mBBζ CAR T stanicama, paralelno je izveden sličan eksperiment na heterozigotnim hSTEAP1-KI miševima koji su nosili RM9-hSTEAP1 tumore, ali bez tumora. Miševi bez tumora tretirani netransduciranim T stanicama ili STEAP1- mBBζ CAR T stanicama nisu pokazali nikakve razlike u preživljavanju (Dopunska slika 14a) ili velike toksičnosti uključujući gubitak tjelesne težine (Dopunska slika 14b). Budući da se STEAP1-BBζ CAR sastoji od modificiranog IgG4 razmaknice koja bi potencijalno mogla biti imunogena, procijenili smo odgovor mišjih anti-humanih antitijela (MAHA) prikupljanjem retroorbitalnih krvarenja iz miševa u ovom eksperimentu. U serumima miševa 8. dana nakon tretmana STEAP1-BBζ CAR T stanicama (dodatna slika 14c) nisu otkrivena anti-humana IgG i IgM antitijela.

Važno je da heterozigotni hSTEAP1-KI miševi tretirani sa STEAP1-mBBζ CAR T stanicama nisu pokazali očigledne poremećaje tkiva ili povećanu infiltraciju CD3+ T stanica u prostati (Dodatna slika 15a, b ) ili nadbubrežnu žlijezdu (dodatna slika 15c, d) u odnosu na njihove parnjake liječene netransduciranim T stanicama, što ukazuje na odsutnost toksičnosti izvan tumora na meti. Pluća prikupljena na kraju eksperimenta pokazala su ekspresiju ljudskog STEAP1 u RM9-hSTEAP1 plućnim metastazama s regionalnom heterogenošću kod miševa tretiranih netransduciranim mišjim T stanicama (Slika 5g). S druge strane, tumori miševa tretiranih mišjim STEAP1-mBBζ CAR T stanicama ponovno su pokazali odsutnost ljudske ekspresije STEAP1 (Slika 5h). Kako bismo procijenili mogu li mišja STEAP1- mBBζ CAR T-stanična terapija i gubitak ljudskog STEAP1 antigena također utjecati na prezentaciju antigena u RM9-hSTEAP1 tumorima, proveli smo IHC za mišji beta-2-mikroglobulin (B2m ) koji je ključna komponenta molekula MHC klase I. Uočili smo značajno smanjenje ekspresije B2m u progresivnim tumorima nakon tretmana mišjim STEAP1-mBBζ CAR T stanicama u usporedbi s netransduciranim T stanicama (dodatna slika 15e, f), u skladu s našim nalazima u modelu 22Rv1.

Slika 4|Uspostavljanje sustava miš-u-mišu s ljudskim STEAP1 knock-in (hSTEAP1-KI) modelom miša i muriniziranim STEAP1 CAR. Shema koja prikazuje strategiju homologne rekombinacije korištenjem ciljanog vektora za ubacivanje ljudskih STEAP1 egzona 2-5 u mišji Steap1 lokus na pozadini C57Bl/6. FRT Flippase cilj za prepoznavanje. b Vizualizacija PCR proizvoda iz genotipizacije vrha repa divljeg tipa (+/+), heterozigotnih (KI/+) ili homozigotnih (KI/KI) miševa upotrebom parova početnica namijenjenih amplifikaciji dijelova divljeg tipa ili hSTEAP1-KI alela . Kontrola NTC nultog predloška. Reprezentativna slika gela iz n=3 biološki neovisnih eksperimenata. c qPCR za humanu ekspresiju STEAP1 normaliziranu na ekspresiju 18 S u ispitivanju tkiva hSTEAP1-KI/+ miševa. n=3 za organe specifične za spol i n=6 za uobičajene organe. Stupci predstavljaju srednju vrijednost sa SEM. Mikrografske fotografije STEAP1 IHC bojenja (d) tkiva prostate (lijevo) +/+ i (desno) KI/+ miševa i (e) nadbubrežne žlijezde KI/+ miša. Mjerne trake=50 µm. Za ploču (d, e) STEAP1 imunološko bojenje provedeno je na n=3 biološki neovisnih uzoraka. f Shema retrovirusno muriniziranog STEAP1 CAR konstrukta. MuLV virus mišje leukemije, mCD19t mišji skraćeni CD19. g Kvantifikacija učinkovitosti retrovirusne transdukcije aktiviranih mišjih T stanica iz tri neovisna eksperimenta na temelju učestalosti mišjih CD3+ CD19t+ stanica protočnom citometrijom (p {{40}}.0003). h Relativna stanična održivost ciljnih stanica RM9 ili RM9-hSTEAP1 tijekom vremena mjerena fluorescentnim prikazom živih stanica nakon sukulture u omjeru 1:1 s mišjim STEAP1-mBBζ CAR T stanicama ili netransduciranim T stanicama (p < 0,0001). n=4 bioloških replika po stanju. Trake pogrešaka predstavljaju srednju vrijednost sa SEM. Za panel (g) korišten je nespareni dvostrani Studentov t-test s Welchovom korekcijom. U panelu (h) korištena je dvosmjerna ANOVA sa Sidakovim testom višestruke usporedbe. Izvorni podaci navedeni su u datoteci Izvorni podaci.

Slika 5|Određivanje učinkovitosti i sigurnosti mišjih STEAP1-mBBζ CAR T stanica u hSTEAP1-KI miševa koji nose singeni, diseminirani rak prostate.

Fuzijski citokin domene vezanja kolagena-IL-12 izaziva antitumorske odgovore putem pojačanog signaliziranja receptora T stanica i prezentacije antigena

IL{{0}} je heterodimerni citokin koji se sastoji od podjedinica p40 i p35 koji regulira odgovore T stanica i dovodi do proizvodnje IFN-a. Upečatljivi antitumorski odgovori povezani sa sustavnom primjenom IL-12 prikazani su u nekoliko pretkliničkih modela58,59, ali prijevod ovog terapijskog pristupa na kliniku je zastao zbog toksičnosti i neučinkovitosti koja ograničava dozu60–63. Alternativne strategije za zaobilaženje ovih problema bile su usmjerene na lokalizaciju IL{{10}} na tumore, bilo putem intratumorske isporuke ili inženjeringom IL-12 fuzijskih proteina kako bi se iskoristila jedinstvena svojstva mikrookruženja tumora. Jedan nedavno opisani pristup je spajanje s domenom von Willebrand faktora A3 koja služi kao domena za vezanje kolagena (CBD, slika 6a) i omogućuje vezanje fuzijskih proteina na izloženi kolagen u poremećenoj tumorskoj vaskulaturi64. Pokazalo se da sustavna terapija CBD-IL-12 remodelira tumorsko mikrookruženje imunološki "hladnog" mišjeg raka dojke i modela melanoma putem pojačanog IFN-signaliziranja i da surađuje s anti-PD{{20}} inhibicija imunološke kontrolne točke za induciranje eradikacije tumora65. Pitali smo može li CBD-IL-12 biti učinkovit u pretvaranju raka prostate iz "hladnog" u "vrući" i induciranju antitumorskih odgovora. Subkutani, singeni RM9 i Myc-CaP tumori utvrđeni su u muških miševa C57Bl/6, odnosno FVB, a miševi su randomizirani za liječenje nosačem, anti-PD-1 ili CBD-IL-12 . Sustavna primjena CBD-IL-12 izazvala je značajnu inhibiciju rasta tumora i u singenim modelima tumora RM9 i Myc-CaP koji su inače slabo reagirali na terapiju anti-PD{37}} (Slika 6b, Dodatna slika 16a) . Kako bismo stekli daljnji uvid u mehanizme djelovanja CBD-IL-12, proveli smo jednostaničnu RNA-seq (scRNA-seq) analizu RM9 tumora iz miševa tretiranih bilo nosačem ili CBDIL-12. Jednoobrazna aproksimacija razvodnika i dijagrami projekcije otkrili su znatno smanjenje odjeljaka epitela tumora, fibroblasta i endotelnih stanica (dodatna slika 16b) u skladu s antitumorskim djelovanjem. Profiliranje temeljeno na markerima urođenih i adaptivnih podskupova imunoloških stanica (Slika 6c,d) u podacima scRNA-seq identificiralo je značajan porast CD8+ T stanica (7,55 u odnosu na 0,76%) , stanice s unakrsnom prezentacijom antigena uključujući XCR1+ IRF8+ konvencionalne dendritične stanice tipa 1 (cDC1, 1,33 naspram 0%), CD86+ INOS2+ M1 polarizirane makrofage ( 2,26 naspram 0%), i CD64+ F4/ 80+ monociti/makrofagi (29,2 naspram 4,43%) u tumorima iz liječene CBDIL-12 skupine u usporedbi s kontrolnom grupom nosačem. Smanjenje imunosupresivnih CD163+ CD206+ M2 polariziranih makrofaga (0 naspram 0,25%) i Ly6G+ neutrofila (0,52 naspram 1,08%) također je bilo povezano s terapijom CBD-IL-12. IHC analiza potvrdila je da tumori RM9 tretirani nosačem općenito nemaju CD8+ T stanice, dok su oni tretirani CBD-IL-12 pokazali vidljivo značajnu infiltraciju CD8+ T stanica (dodatna slika 16c) . Tumorske stanice pokazale su obogaćenu ekspresiju podjedinica proteasoma i imunoproteasoma Psmb8 i Psmb9 i gena H2-K1, H{{102}D1 i B2m glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase I (MHC I), u skladu s regulacijom obrade antigena i prezentacijski strojevi (Slika 6e, Dodatna slika 16d). Paralelno, T-stanice su pokazale pojačanu ekspresiju gena povezanu s signalizacijom T-staničnog receptora i imunoregulacijskim interakcijama između limfoidne i ne-limfoidne stanice (Slika 6f, Dodatna slika 16e). Stanice mononuklearnog fagocitnog sustava (MPS) pokazale su obogaćenu ekspresiju gena povezanu s obradom antigena i unakrsnom prezentacijom, kao i signalizacijom citokina (dodatna slika 16f, g). Ove studije su utvrdile antitumorsku aktivnost CBD-IL- 12 u modelima raka prostate reprogramiranjem mikrookruženja tumora i uključivanjem urođenog i adaptivnog imunološkog sustava.

Poboljšana kontrola tumora s istodobnom terapijom STEAP1-mBBζ CAR T stanica i CBD-IL-12

Zatim smo pretpostavili da bi proširenje antitumorskog imunološkog odgovora terapijom CBD-IL-12 moglo poboljšati terapijsku učinkovitost terapije STEAP1-mBBζ CAR T stanicama kod raka prostate borbom protiv heterogenosti tumorskog antigena i spašavanjem obrade antigena i prezentacija. Stoga smo ustanovili singenske, neklonalne RM9-STEAP1-fLuc metastaze u muških heterozigotnih hSTEAP1-KI miševa i randomizirani na liječenje bilo s 5 × 106 netransducirane mišje T stanice ili mišje STEAP1-mBBζ CAR T stanice injekcijom u repnu venu sa ili bez tjedne terapije CBD-IL-12 injekcijom u retroorbitalni sinus. Skupine koje su primale CBD-IL-12 terapiju samu ili u kombinaciji sa STEAP1-mBBζ CAR T terapijom nisu primile ciklofosfamid koji smanjuje limfu (slika 7a). Serijski BLI otkrio je brzu progresiju bolesti u miševa liječenih netransduciranim T stanicama i CBD-IL-12, dok su oni koji su primali STEAP1-BBζ CAR T stanice u kombinaciji s CBD-IL-12 terapijom pokazali značajno odgoda u progresiji tumora (slika 7b, c). Važno je da je kombinirano liječenje s mišjim STEAP1- mBBζ CAR T stanicama i tjednim CBD-IL-12 povezano sa statistički značajnim produljenjem ukupnog preživljenja u usporedbi sa svim drugim skupinama liječenja (Slika 7d). Analiza citokina u plazmi retroorbitalnih krvarenja prikupljenih 0. i 8. dana liječenja pokazala je značajno povećanje razina proupalnih citokina IFN-, TNF-, IL-6 i IL-4 (Slika 7e, Dodatna slika 17) kod miševa tretiranih STEAP1-mBBζ CAR T stanicama i CBD-IL-12. Zaostali tumori prikupljeni su pri nekropsiji i STEAP1 IHC pokazao je gubitak antigena u tumorima miševa koji su tretirani i STEAP1- mBBζ CAR T stanicama samim i u kombinaciji s CBD-IL-12 (Slika 8a). Osim toga, primijetili smo povećanje ekspresije tumora B2m (Slika 8a) povezano s terapijom CBD-IL-12. CD3+ T stanice su također povećane (Slika 8b) u tumorskim stanjima podvrgnutim IL-12 terapiji, ali, iako je trend cijenjen, nismo pronašli statistički značajan porast intratumoralnih T stanica između STEAP1-mBBζ CAR T stanica i kombinirane STEAP1-mBBζ CAR T stanice i CBD-IL-12 grupe za liječenje. Rezidualni tumori uključujući one iz miševa liječenih kombiniranim STEAP1-mBBζ CAR T stanicama i CBD-IL-12 prikupljeni pri maksimalnom odgovoru na liječenje (nadir) 10. dana i na suosjećajnim krajnjim točkama za progresiju tumora (relaps) bili su disocirane na pojedinačne stanice i podskupine imunoloških stanica karakterizirane su multiparametrijskom protočnom citometrijom (dodatna slika 18). U skladu s našim rezultatima scRNA-seq, liječenje CBD-IL-12 bilo samim ili u kombinaciji sa STEAP1-mBBζ CAR T stanicama dovelo je do značajnog povećanja CD11b+ Ly6C-/+F4/{{68 }} MHC-II+ makrofagi (Slika 8c, d, Dodatna slika 19a). CD11b+ Ly6CF4/80+ MHC-II+ stanice predstavljaju zrele makrofage koji prezentiraju antigen66 i ta je populacija preferencijalno obogaćena i pokazala je povećanu induciranu ekspresiju sintaze dušikovog oksida (iNOS) kao markera proupalne M1 polarizacije s CBD-IL{{84} } terapija. Također smo primijetili ekspanziju populacije cDC1 i smanjenje konvencionalne populacije dendritičnih stanica tipa 2 (cDC2) (Slika 8e, Dodatna slika 19b). cDC1 je uključen u aktivaciju antitumorskih citotoksičnih CD8+ T stanica i potencijalne mehanizme terapeutske rezistencije. Nismo pronašli znakove migracije stanica u tumor dok su cDC2 važni za aktivaciju značajne razlike u omjerima KLRG1+ i KLRG1- prirodnih ubojica CD4+ T stanica uključujući Tregs67 . U skladu s nalazima cDC2, stanice u svim skupinama za liječenje (dodatna slika 19d). Profiliranje učestalosti CD4+ FOXP3+ Tregs otkrilo je smanjenje Tregs asso- od F40/80+ SiglecF+ eozinofila su bili povećani dok je Ly6G+ neuciran s CBD-IL-12 terapijom (dodatna Slika 19c). Zanimljivo je da su trofili smanjeni s dodatkom CBD-IL-12 STEAP-u1- primijetili smo da u tumorima koji su se vratili nakon kombinirane terapije STEAP1-mBBζ mBBζ CAR T stanicama (Slika 8f, g). Značajno je da je učestalost ovih CAR T stanica i CBD-IL-12 terapije bila smanjena u cDC1, a neutrofili povezani s tumorom bili su povišeni s liječenjem s povećanjem Tregs-a, što implicira smanjeno primanje citotoksičnog CD8 STEAP-a{{120 }}mBBζ CAR T stanice u usporedbi s netransduciranim T stanicama (54 naspram T stanica i obogaćivanje imunosupresivne Treg signalizacije kao 34%), smanjene u uvjetima s CBD-IL-12 terapijom, ali povećane nakon relapsa tumora nakon kombiniranog STEAP-a 1-mBBζ CAR T stanica i CBD-IL-12 terapija (19 do 42%). Ova otkrića sugeriraju da imunosupresivna svojstva neutrofila povezanih s tumorom mogu igrati istaknutu ulogu u posredovanju rezistencije na liječenje i progresije tumora. Sve u svemu, ove analize pokazuju da liječenje CBD-IL-12 vraća neprijateljski imunosupresivni tumorski milje u proupalno stanje i proširuje antitumorsku aktivnost u kombinaciji s usvojeno prenesenom terapijom STEAP1-mBBζ CAR T stanicama. Nadalje smo proveli analizu repertoara TCR koristeći sekvenciranje beta lanca TCR zasnovano na multipleksnoj PCR68 na tumorima koji nose pluća prikupljenim iz svake tretirane skupine pri nekropsiji. Uočili smo značajno smanjenje Simpsonove klonalnosti u uzorcima miševa liječenih samim CBD-IL-12 i u kombinaciji sa STEAP1-mBBζ CAR T staničnom terapijom, što je indikativno za povećanu intratumorsku raznolikost T stanica (Sl. 8h). Ova otkrića pokazuju da bi dodavanje CBD-IL-12 kao dodatka STEAP1 CAR T staničnoj terapiji moglo biti korisno kroz remodeliranje mikrookruženja tumora raka prostate, poboljšanje obrade i prezentacije antigena i angažiranje imuniteta domaćina za promicanje širenja epitopa.

Slika 6|Terapija fuzijom citokina sistemske domene vezanja kolagena IL-12 (CBD-IL-12) inhibira rast tumora raka prostate i reprogramira tumorsko imunološko mikrookruženje. Shema CBD-IL-12, sastavljena od podjedinica p35 i p40 spojenih na CBD iz domene von Willebrand faktora A3. b Volumeni RM9 potkožnih tumora u singenim C57Bl/6 miševima tijekom vremena uz tretman nosačem, anti-PD-1 (klon 29 F.1A12) 200 Μg intraperitonealnom injekcijom svakih 5 dana, ili CBD-IL-12 25 Μg intravenskom injekcijom svakih 5 dana počevši od 0. dana. n=7 miševa u skupini tretiranoj nosačem i CBD-IL-12 i n=8 miševa u anti -PD1 liječena skupina. p < 0,0001 dana 9 i 12. Stupci predstavljaju srednju vrijednost sa SEM. P-vrijednosti su izvedene iz dvosmjerne ANOVA-e s Dunnettovim testom višestrukih usporedbi, ns nije značajno. c Dijagrami Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) različitih podskupova imunoloških stanica (gore) iz jednostanične RNA-seq (scRNA-seq) analize pet RM9 tumora od kojih je svaki agregiran iz miševa tretiranih nosačem ili CBD-IL{{41} }. UMAP dijagrami obojeni genskom ekspresijom markera specifičnih za podskup imunoloških stanica za pan-monocite/makrofage, M1 i M2 polarizirane makrofage, konvencionalne dendritične stanice tipa 1 (cDC1), stanice prirodne ubojice (NK) i T pomoćnike tipa 1 (Th1) Stanice. d Grafikoni koji pokazuju učestalost specifičnih populacija imunoloških stanica (u odnosu na CD45 + imunološke stanice) identificiranih scRNA-seq analizom uključujući CD4+ i CD8+ T stanice, Th1 (Infg+ Tbx{ {56}} ) i Th2 (cMAF+ Gata3+ ) stanice, Ly6C+/− monociti/makrofagi (Ly6C+/− Adgre1+ ), M1 makrofagi (CD80+ CD{{67} } INOS2+ ), M2 makrofagi (CD163+ Mrc1+ cMAF+ ), cDC1 (XCR1+ IRF8+ ), konvencionalne dendritične stanice tipa 2 (cDC2 , CD1+ IRF4+ ), migratorne CD103+ dendritične stanice (Itgae+ ), eozinofili (SiglecF+), neutrofili (Ly6G+) i NK stanice (Klrb1c+ Ncr1+ ) kod tumora liječenih nosačem ili CBDIL-12. Grafički prikaz vulkana koji pokazuju različitu ekspresiju gena u (e) tumorskim stanicama i (f) T stanicama iz RM9 tumora miševa liječenih CBD-IL-12 u odnosu na one liječene nosačem. FC fold promjena, FDR stopa lažnog otkrivanja. Izvorni podaci navedeni su u datoteci Izvorni podaci.

Rasprava

Učinkovitost CAR T stanične terapije i drugih ciljanih terapeutika koji se temelje na imunološkom sustavu uvelike ovisi o dosljednoj ekspresiji antigena na svim ili većini stanica koje čine populaciju tumora unutar pojedinog pacijenta. Međutim, heterogenost antigena je izražena u čvrstim tumorima uključujući rak prostate, gdje su progresija u mCRPC i otpornost na liječenje povezani s pojavom divergentnih podtipova bolesti obilježenih različitim transkripcijskim programima–71 i ekspresijom antigena na površini stanice. Iako se PSMA smatra jednim od najvažnijih biomarkera u raku prostate sa značajnom prekomjernom ekspresijom koja se nalazi u cijelom spektru progresije bolesti, naš rad potvrđuje nalaze iz nedavne publikacije14 koja ukazuje da je ekspresija PSMA heterogena u smrtonosnom mCRPC-u. Pokazujemo da je STEAP1 šire izražen od PSMA u ovoj postavci, ali nipošto nije jednoliko izražen na visokim razinama u svim mCRPC tkivima. Nijedna pojedinačna terapija usmjerena na antigene, uključujući terapiju CAR T stanicama, možda neće moći prevladati već postojeću heterogenost tumorskog antigena u mCRPC-u. Stoga je od ključne važnosti temeljito provjeriti vjerodostojnost dodatnih terapijskih ciljeva kao što je STEAP1 u mCRPC-u koji mogu omogućiti kombinatorne terapije koje vrše nepremostiv terapijski pritisak. To uključuje dvostruke terapije usmjerene na antigene (npr. PSMA i STEAP1) CAR T stanične terapije ili multimodalne strategije koje kombiniraju CAR T stanične terapije s ADC-ovima, T-BsAbs ili drugim tretmanima koji snažno potiču ubijanje tumora neovisno o antigenu i ovisno o njemu. Napravili smo STEAP1-ciljanu CAR T staničnu terapiju koja je visoko specifična za antigene i funkcionalno lokalizirala epitop koji prepoznaje CAR na drugi ECD STEAP1. Naše STEAP1-BBζ CAR T stanice pokazuju značajnu antitumorsku aktivnost protiv višestrukih diseminiranih modela raka prostate u studijama na miševima i na miševima. Važno je da je naš STEAP1-BBζ CAR sposoban inducirati aktivaciju T stanica i citolizu ciljnih stanica čak i u uvjetima niske gustoće antigena, što je dokazano reaktivnošću protiv PC3 modela raka prostate. Međutim, ova osjetljivost STEAP1-BBζ CAR T stanica na niske razine ekspresije STEAP1 može biti korisna iz perspektive poboljšanja antitumorske učinkovitosti, ali bi također mogla naglasiti smetnje od ciljane toksičnosti izvan tumora. Prethodno je prijavljeno da sistemska ekspresija STEAP1 gotovo nije prisutna u normalnim ljudskim tkivima18,72 osim u prostati gdje je opisana membranska ekspresija u epitelnim stanicama prostate27. Kako bismo istražili sigurnost STEAP1-BBζCAR T-stanične terapije u pretkliničkim uvjetima, generirali smo humanizirani model miša STEAP1. Model miša hSTEAP1-KI rekapitulirao je ekspresiju ljudskog STEAP1 u prostati i pokazao ekspresiju u kori nadbubrežne žlijezde. Ohrabrujuće, terapija STEAP1-BBζ CAR T stanicama u dozi dovoljnoj da inducira antitumorsku aktivnost nije dovela do evidentne sistemske toksičnosti kod hSTEAP1-KI miševa, uključujući ciljanu toksičnost izvan tumora na mjestima ljudskog STEAP1 izraz. Ponavljajući mehanizam recidiva i progresije raka prostate nakon terapije STEAP1-BBζ CAR T stanicama u našim studijama bio je bijeg tumorskog antigena. S jedne strane, ovo otkriće naglašava ukupnu moć terapije STEAP1-BBζ CAR T stanicama. Međutim, nije jasno je li gubitak ekspresije tumorskog STEAP1 isključivo posljedica inherentne heterogenosti tumorskog antigena ili postoji i adaptivna regulacija ekspresije STEAP1. Nedavna publikacija pokazala je da metilacija promotora STEAP1 modulira ekspresiju STEAP1 i da je epigenetska deregulacija inhibicijom DNA metiltransferaze i histon deacetilaze bila dovoljna za značajno povećanje ekspresije STEAP173. Liječenje epigenetskim inhibitorima u kombinaciji s terapijom STEAP1 CAR T stanicama moglo bi istovremeno pojačati tumorsku STEAP1 ekspresiju i reprogramirati CAR T stanice u povoljna stanja diferencijacije otporna na iscrpljenost74,75, čime bi se ublažio gubitak tumorskog antigena i povećala antitumorska učinkovitost kod raka prostate. Naša studija također implicira da STEAP1 igra funkcionalnu ulogu u regulaciji napredovanja staničnog ciklusa i staničnog metabolizma kod raka prostate. STEAP1 je jedinstven od ostalih članova obitelji STEAP (STEAP2, 3 i 4) po tome što mu nedostaje unutarstanična domena oksidoreduktaze22 koja je neophodna za aktivnost metalo reduktaze. Kao rezultat toga, STEAP1 homotrimeri, ali ne i heterotrimeri s drugim STEAP proteinima, nemaju enzimsku funkciju redukcije Fe3+ u Fe2+ i Cu2+ u Cu1+. Pospješuje li i kako uključenost STEAP1 u metalne ione i stanični metabolizam napredovanje raka tek treba utvrditi i zaslužuje daljnje istraživanje. Imunološki 'hladno' tumorsko mikrookruženje raka prostate glavna je prepreka učinkovitosti imunoterapije raka. Na primjer, eksplorativne studije povezane s kliničkim ispitivanjem faze I terapije PSMA CAR T stanicama oklopljenim za ekspresiju receptora dominantno-negativnog transformirajućeg faktora rasta (TGF R-DN) u mCRPC-u pokazale su da se ekspresija imunosupresivnih signalnih molekula u tumorskom mikrookruženju povećava nakon CAR T infuzije13. U našim je studijama ključno otkriće bila povezanost između gubitka ekspresije STEAP1 i smanjene regulacije obrade i prezentacije antigena, kako u nokautiranim stanicama STEAP1 tako i u tumorima gubitka antigena STEAP1 nakon terapije STEAP1-BBζ CAR T stanicama. Prema tome, gubitak STEAP1 antigena kod raka prostate potiče ne samo izravnu otpornost na terapiju STEAP1-BBζ CAR T stanicama, već također može ograničiti adaptivni antitumorski imunitet domaćina. Gubitak ekspresije ciljnog antigena tumora i konverzija u imunosupresivnije stanje s povećanom infiltracijom Tregs i većom ekspresijom imunosupresivnih molekula također je primijećeno u fazi I studije EGFR-vIII CAR T stanica kod sudionika s rekurentnim glioblastomom76. Bit će potreban dodatni rad kako bi se razumjeli funkcionalni mehanizmi koji leže u podlozi gubitka antigena STEAP1 i općenito kako dinamički učinci adaptivne terapije CAR T stanicama mogu doprinijeti gubitku antigena i imunouređivanju moduliranjem interakcija tumor-imuno-stroma u solidnim tumorima.

Slika 7|Kombinacija CBD-IL-12 sa STEAP1-mBBζ CAR T staničnom terapijom povećava ukupno preživljavanje i razine upalnih citokina. Shema eksperimenta izazivanja tumora za RM9-hSTEAP1 diseminirani model u hSTEAP1-KI/+ miševa koji istražuje kombinaciju CBD-IL-12 sa STEAP{{1{{18} }}}mBBζ CAR T stanična terapija. Cy ciklofosfamid (za predkondicioniranje). Izrađeno s BioRender.com. b Serijski živi BLI hSTEAP1-KI/ + miševa kojima su usađene RM9-hSTEAP1- fLuc metastaze i liječeni jednom intravenskom injekcijom 5 × 106 netransduciranih miševa T stanice ili STEAP1-mBBζ CAR T stanice na dan 0 sa ili bez CBD-IL- 12 tretmana jednom tjedno. Crveni X označava uginule miševe. Prikazana je ljestvica zračenja. (c) Grafik koji prikazuje kvantifikaciju ukupnog toka tijekom vremena iz živog BLI svakog miša u (b). d Kaplan–Meierove krivulje preživljavanja miševa u (b) sa statističkom značajnošću određenom logaritamskim (Mantel-Cox) testom (p=0,002). e Grafikoni koji pokazuju razine IFN-a (lijevo, p=0.002) i TNF- (desno, p < 0,0001) u serumu citokina na temelju imunotestova ProcartaPlex iz retroorbitalnog krvarenja hSTEAP1-KI/+ miševa ( n=4 miševa po skupini) koji nose RM9-hSTEAP1-fLuc metastaze prije (dan 0) i nakon tretmana (dan 8) s netransduciranim mišjim T stanicama ili mišjim STEAP{{38} }mBBζ CAR T stanice sa ili bez CBD-IL-12 terapije. Traka pogrešaka predstavlja srednju vrijednost sa SEM. Za panel (e), p-vrijednosti su izvedene iz dvosmjerne ANOVA-e sa Sidakovim testom višestrukih usporedbi. Izvorni podaci navedeni su u datoteci Izvorni podaci.

Slika 8|Kombinacija CBD-IL-12 sa STEAP1-mBBζ CAR T staničnom terapijom reprogramira tumorsko imunološko mikrookruženje i potiče prezentaciju antigena i širenje epitopa. a Mikrografske fotografije STEAP1 (gore), B2m (sredina) i CD3 (dolje) IHC bojenja RM9-hSTEAP1 tumora pluća nakon tretmana mišjim netransduciranim T stanicama ili STEAP1-mBBζ CAR T stanicama s ili bez tretmana CBD-IL-12. Mjerne trake=50 µm. b Stupčasti dijagram koji prikazuje IHC kvantifikaciju CD3 pozitivnih stanica koje se infiltriraju u metastatske tumore pluća (n=4 tumora po skupini). Jednosmjerna ANOVA p=0.{{80}}021. Traka pogrešaka predstavlja srednju vrijednost s SD. Grafikoni koji pokazuju frekvencije (c) Ly6C− F4/{{20}} MHC-II+ (lijevo, jednosmjerna ANOVA p=0.00{ {98}}5) i Ly6C − F4/80+ iNOS2+ (desno, jednosmjerna ANOVA p=0.0017) makrofagi, (d) Ly6C+ F4/ {{36} } MHC-II+ (lijevo, jednosmjerna ANOVA p=0.0038) i Ly6C+ F4/80+ iNOS2+ (desno, jednosmjerna ANOVA p=ns) makrofagi, (e) CD11b+ XCR1+ cDC1 (jednosmjerna ANOVA p=0.0003), (f) F4/80+ SiglecF+ eozinofili (jednosmjerna ANOVA p=0. 0008) i (g) Ly6G+ neutrofili (jednosmjerna ANOVA p=0.0035) normalizirani na ukupne CD45+ stanice kako je određeno multiparametrijskom protočnom citometrijom nakon tretmana s netransduciranim T stanicama, STEAP{{67 }}mBBζ CAR T stanice, netransducirane T stanice i CBD-IL-12 i STEAP1- mBBζ CAR T stanice i CBD-IL-12 pri maksimalnom odgovoru na liječenje (nadir) i relapsu tumora (relaps). h Stupčasti dijagrami koji predstavljaju Simpsonovu klonalnost kao mjeru 'ujednačenosti' repertoara TCR analiziranog TCRB sekvenciranjem na stanicama koje infiltriraju tumore prikupljenim od miševa u (a). n=4 tumora po skupini. P-vrijednosti za netransducirane T stanice + CBD-IL-12 u usporedbi s netransduciranim T stanicama i STEAP1-mBBζ CAR T stanicama su 0,008 odnosno 0,02; i STEAP1-mBBζ CAR T stanice + CBD-IL-12 u usporedbi s netransduciranim i STEAP1-mBBζ CAR T stanicama iznose 0,004 odnosno 0,01. Traka pogrešaka predstavlja srednju vrijednost s SD. Za ploče (c–g) n=3 tumora po skupini, *p < 0,05; **p < 0,01, ***p < 0,001, p-vrijednosti u pločama (b–h) su iz jednosmjerne ANOVA-e s Dunnovim testom višestrukih usporedbi. Izvorni podaci navedeni su u datoteci Izvorni podaci.

Kako bismo proširili antitumorski odgovor, istražili smo sustavnu primjenu CBD-IL-12 u kombinaciji sa STEAP1-BBζ CAR T staničnom terapijom u diseminiranom, singeničnom modelu tumora RM9-hSTEAP1 u hSTEAP 1-KI miševi za aproksimaciju imunosupresivne prirode mCRPC-a na temelju prethodne karakterizacije RM9 kao slabo imunogenog modela57,77. Zajedničko liječenje s CBD-IL12 dovelo je do poboljšanja u ukupnom preživljenju, proizvodnji citokina, prezentaciji tumorskog antigena i intratumorskoj raznolikosti T stanica u skladu sa širenjem epitopa. Pomno istraživanje tumorskog imunološkog mikrookruženja otkrilo je da dodavanje CBD-IL-12 STEAP1-BBζ CAR T staničnoj terapiji izaziva reverziju strome tumora i pojačava aktivirane makrofage i cDC1 dok smanjuje neutrofile povezane s tumorom. Međutim, izlječenje nije postignuto u našim studijama, a mi ističemo potencijalne kompenzacijske, adaptivne mehanizme otpornosti i progresije tumora uključujući povećanu učestalost imunosupresivnih neutrofila i cDC2 koji mogu pospješiti indukciju Treg-a. Važno je napomenuti da može biti potrebna daljnja optimizacija doze i rasporeda primjene CBD-IL-12 kako bi se maksimizirali antitumorski odgovori. Međutim, ovi rezultati podržavaju istraživanje kombinatornih imunoterapijskih pristupa kao što je armiranje CAR T stanica za ekspresiju rekombinantnih citokina78 (npr. IL-2, IL-12, IL-15 ili IL{{24 }}), istodobno liječenje imunomodulatorima (npr. anti-PD-1/PD-L1 ili anti-CTLA4) ili radioterapija usmjerena na tumor za remodeliranje mikrookruženja tumora raka prostate i poboljšanje funkcije efektora CAR T stanica. Dok je ovaj rukopis bio u pripremi, studija grupe u Norveškoj izvijestila je o pretkliničkom razvoju STEAP1 CAR T stanične terapije s antitumorskom aktivnošću u potkožnom 22Rv1 modelu kod imunokompromitiranih miševa79. Prijavljeni STEAP1 CAR razlikuje se od STEAP1-BBζ CAR jer uključuje sintetski scFv nazvan Oslo1 i CD8 zglob i transmembransku domenu. Još jedna značajka razlikovanja je da su STEAP1-BBζ CAR T stanice pripremljene kao definirani proizvod s normalnim omjerom CD4/CD8 T stanica dok Oslo1 STEAP1 CAR T stanice nisu. Mehanizmi rezistencije i sigurnosne studije povezane s terapijom T stanicama Oslo1 STEAP1 CAR nisu prijavljeni. Međutim, bit će zanimljivo vidjeti kako ove razlike u CAR inženjeringu i sastavu staničnih proizvoda mogu utjecati na antitumorsku učinkovitost, postojanost i sigurnost i Oslo1 STEAP1 CAR T stanične terapije i naše STEAP1-BBζ CAR T stanične terapije programi se prevode na kliniku. Nalazi naših studija doveli su do partnerstva s Programom eksperimentalne terapije Nacionalnog instituta za rak (NCI) (NExT) kako bi se STEAP1-BBζ CAR T-stanična terapija prevela u prvo ispitivanje na ljudima za muškarce s mCRPC-om. Signali o sigurnosti i učinkovitosti iz ovog kliničkog ispitivanja u ranoj fazi pomoći će odrediti ima li također vrijednosti u istraživanju ovog terapijskog pristupa za druge tipove raka koji imaju visoku ekspresiju STEAP1.

Reference

1. Siegel, RL, Miller, KD, Fuchs, HE & Jemal, A. Statistika raka, 2022. CA: Cancer J. Clinicians 72, 7–33 (2022).

2. Armstrong, AJ et al. Predviđanje petogodišnjeg preživljavanja i sigurnosni ishodi s enzalutamidom u muškaraca s metastatskim rakom prostate otpornim na kemoterapiju otpornim na kastraciju iz ispitivanja PREVAIL. Eur. Urol. 78, 347–357 (2020).

3. Fizazi, K. i sur. Abirateron plus prednizon kod metastatskog raka prostate osjetljivog na kastraciju. N. engl. J. Med. 377, 352–360 (2017).

4. Scher, HI i sur. Povećano preživljenje s enzalutamidom kod raka prostate nakon kemoterapije. N. engl. J. Med. 367, 1187-1197 (2012).

5. Parker, C. i sur. Alfa emiter radij-223 i preživljavanje kod metastatskog raka prostate. N. engl. J. Med. 369, 213–223 (2013).

6. Sartor, O. i sur. Lutecij-177–PSMA-617 za metastatski rak prostate otporan na kastraciju. N. engl. J. Med. 385, 1091-1103 (2021).

7. Kantoff, PW i sur. Sipuleucel-T imunoterapija za rak prostate otporan na kastraciju. N. engl. J. Med. 363, 411–422 (2010).

8. Jackson, HJ, Rafiq, S. & Brentjens, RJ Vožnja CAR T-stanica naprijed. Nat. Rev. Clin. Oncol. 13, 370–383 (2016).

9. Weiner, GJ Izgradnja boljih terapeutika na bazi monoklonskih antitijela. Nat. Rev. Cancer 15, 361–370 (2015).

10. Chavez, JC, Bachmeier, C. & Kharfan-Dabaja, MA CAR T-stanična terapija za B-stanične limfome: rezultati kliničkih ispitivanja dostupnih proizvoda. Therapeutic Adv. Hematol. 10, 2040620719841581 (2019).

11. Sterner, RC & Sterner, RM Terapija CAR-T stanicama: trenutna ograničenja i potencijalne strategije. Rak krvi J. 11, 69 (2021).

12. Slovin, SF i sur. Studija faze 1 P-PSMA-101 CAR-T stanica u pacijenata s metastatskim rakom prostate otpornim na kastraciju (mCRPC). J. Clin. Oncol. 40, 98–98 (2022).

13. Narayan, V. et al. PSMA-ciljane TGF-neosjetljive oklopne CAR T stanice u metastatskom raku prostate otpornom na kastraciju: ispitivanje faze 1. Nat. Med. 28, 724–734 (2022).

14. Paschalis, A. i sur. Heterogenost membranskog antigena specifične za prostatu i defekti popravka DNK kod raka prostate. Euro. Urol. 76, 469–478 (2019).

15. Chen, N., Li, X., Chintala, NK, Tano, ZE & Adusumilli, PS Vožnja CAR-ova na neravnom putu heterogenosti antigena u solidnim tumorima. Curr. Opin. Immunol. 51, 103–110 (2018).

16. Morgan, RA i sur. Prikaz slučaja ozbiljnog neželjenog događaja nakon primjene T stanica transduciranih himernim antigenskim receptorom koji prepoznaje ERBB2. Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther. 18, 843–851 (2010).

17. Lee, JK i sur. Sistemsko površinsko profiliranje identificira ciljne antigene za imunološku terapiju u podtipovima uznapredovalog raka prostate. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 115, E4473-e4482 (2018).

18. Hubert, RS i sur. STEAP: antigen stanične površine specifičan za prostatu koji je visoko izražen u ljudskim tumorima prostate. Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 14523-14528 (1999).

19. Nolan-Stevaux, O. Sažetak DDT02-03: AMG 509: Novo, humanizirano, produljeno vrijeme poluživota, bispecifično XmAb® 2+1 antitijelo za regrutiranje T stanica STEAP1 × CD3. Cancer Res. 80, DDT02-03-DDT02-03 (2020).

20. Grunewald, TG i sur. Visoka ekspresija STEAP1 povezana je s poboljšanim ishodima kod pacijenata s Ewingovim sarkomom. Ann. Oncol. Isključeno. J. Eur. Soc. Med. Oncol. 23, 2185-2190 (2012).

21. Moreaux, J., Kassambara, A., Hose, D. & Klein, B. STEAP1 je prekomjerno izražen u karcinomima: obećavajući terapeutski cilj. Biochem. Biophys. Res. Komun. 429, 148–155 (2012).

22. Oosterheert, W. & Gros, P. Struktura krioelektronske mikroskopije i potencijalna enzimska funkcija ljudskog šest-transmembranskog epitelnog antigena prostate 1 (STEAP1). J. Biol. Chem. 295, 9502-9512 (2020).

23. Jiao, Z. i sur. Šest-transmembranski epitelni antigen ekspresije prostate 1 potiče metastaze raka jajnika pomažući napredovanje prijelaza epitela u mezenhim. Histochem. Cell Biol. 154, 215–230 (2020).

24. Gomes, IM, Arinto, P., Lopes, C., Santos, CR & Maia, CJ STEAP1 je prekomjerno izražen u raku prostate i lezijama intraepitelne neoplazije prostate i pozitivno je povezan s Gleasonovim rezultatom. U urološkoj onkologiji: seminari i izvorna istraživanja. vol. 32, 53.e23–53.e29 (Elsevier, 2014.).

25. Huo, S.-f. et al. STEAP1 olakšava metastaziranje i epitelno-mezenhimsku tranziciju adenokarcinoma pluća preko JAK2/STAT3 signalnog puta. Biosci. Rep. 40, BSR20193169 (2020).

26. Gomes, IM i sur. Rušenje STEAP1 inhibira rast stanica i inducira apoptozu u LNCaP stanicama raka prostate suprotstavljajući se učinku androgena. Med. Oncol. 35, 1–10 (2018).

27. Gomes, IM, Maia, CJ & Santos, CR STEAP proteini: od strukture do primjene u terapiji raka. Mol. Cancer Res. MCR 10, 573–587 (2012).

28. Danila, DC i sur. Studija I. faze DSTP3086S, konjugata protutijelo-lijek koji cilja šest transmembranski epitelni antigen prostate 1, kod metastatskog raka prostate otpornog na kastraciju. J. Clin. Oncol. Isključeno. J. Am. Soc. Clin. Oncol. 37, 3518-3527 (2019).

29. Kelly, WK i sur. Studija I. faze AMG 509, imunoterapije STEAP1 x CD3 T stanica koja regrutira XmAb 2+1, u pacijenata s metastatskim rakom prostate otpornim na kastraciju (mCRPC). J. Clin. Oncol. 38, TPS5589-TPS5589 (2020).

30. Lin, T.-Y., Park, JA, Long, A., Guo, H.-F. & Cheung, N.-KV Novo snažno anti-STEAP1 bispecifično antitijelo za preusmjeravanje T stanica za imunoterapiju raka. J. Immunother. Rak 9, e003114 (2021).

31. Schober, SJ i sur. MHC klasa I-ograničene TCR-transgene CD4(+) T stanice protiv STEAP1 posreduju u lokalnoj kontroli tumora Ewingovog sarkoma in vivo. Ćelije 9, 1581 (2020).

32. Roudier, MP i sur. Fenotipska heterogenost završnog stadija karcinoma prostate metastatskog u kosti. Pjevušiti. Pathol. 34, 646-653 (2003).

33. Gomes, IM, Santos, CR, Socorro, S. & Maia, CJ Šest transmembranski epitelni antigen prostate 1 reguliran je naniže spolnim hormonima u stanicama prostate. Prostata 73, 605–613 (2013).

34. Sharp, A. i sur. Ekspresija spojene varijante androgenog receptora-7 pojavljuje se s otpornošću na kastraciju kod raka prostate. J. Clin. Investirati. 129, 192–208 (2019).

35. Bakht, MK i sur. Neuroendokrina diferencijacija raka prostate dovodi do supresije PSMA. Endocr.-Relat. Rak 26, 131–146 (2018).

36. Ihlaseh-Catalano, SM i sur. Prekomjerna ekspresija proteina STEAP1 neovisni je marker za biokemijski recidiv karcinoma prostate. Histopathology 63, 678–685 (2013).

37. Gomes, IM i sur. Rušenje STEAP1 inhibira rast stanica i inducira apoptozu u LNCaP stanicama raka prostate suprotstavljajući se učinku androgena. Med. Oncol. 35, 40 (2018).

38. Logan, AC i sur. Čimbenici koji utječu na titar i infektivnost lentivirusnih vektora. Pjevušiti. Gene Ther. 15, 976–988 (2004).

39. Morgan, RA, Gray, D., Lomova, A. & Kohn, DB Genska terapija hematopoetskim matičnim stanicama: napredak i naučene lekcije. Matične stanice stanica 21, 574–590 (2017).

40. Larson, SM i sur. Pretklinički razvoj modifikacije gena hematopoetskih matičnih stanica s kimernim antigenskim receptorima za imunoterapiju raka. Pjevušiti. Vaccin Immunother. 13, 1094–1104 (2017).

41. Salter, AI i sur. Fosfoproteomska analiza signalizacije kimernog antigenskog receptora otkriva kinetičke i kvantitativne razlike koje utječu na funkciju stanice. Sci. Signal. 11, eaat6753 (2018).

42. Majzner, RG i sur. Podešavanje zahtjeva gustoće antigena za CAR T-staničnu aktivnost. Cancer Discov. 10, 702–723 (2020).

43. Challita-Eid, PM i sur. Monoklonska protutijela na šest transmembranskih epitelnih antigena prostate-1 inhibiraju međustaničnu komunikaciju in vitro i rast ksenografta ljudskog tumora in vivo. Cancer Res. 67, 5798-5805 (2007).

44. Hudecek, M. et al. Nesignalna izvanstanična razmaknička domena kimernih antigenskih receptora je odlučujuća za in vivo antitumorsku aktivnost. Cancer Immunol. Res. 3, 125–135 (2015).

45. Gomes, IM, Santos, CR & Maia, CJ Ekspresija STEAP1 i STEAP1B u staničnim linijama prostate i pretpostavljena regulacija STEAP1 posttranskripcijskim i posttranslacijskim mehanizmima. Genes Cancer 5, 142–151 (2014).

46. ​​Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A. & Elofsson, A. TOPCONS: konsenzusno predviđanje topologije membranskog proteina. Nucleic Acids Res. 37, W465-W468 (2009).

47. Krogh, A., Larsson, B., Von Heijne, G. & Sonnhammer, EL Predviđanje transmembranske topologije proteina sa skrivenim Markovljevim modelom: primjena na kompletne genome. J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).

48. Long, AH i sur. 4-1BB kostimulacija ublažava iscrpljenost T stanica izazvanu toničnim signaliziranjem kimernih antigenskih receptora. Nat. Med. 21, 581–590 (2015).

49. Berger, C. et al. Adoptivni prijenos efektorskih CD8+ T-stanica izvedenih iz središnjih memorijskih stanica uspostavlja trajnu memoriju T-stanica u primata. J. Clin. Istražite. 118, 294–305 (2008).

50. Gattinoni, L. i sur. Podskup T-stanica ljudske memorije sa svojstvima sličnim matičnim stanicama. Nat. Med. 17, 1290-1297 (2011).

51. Xu, Y. i sur. Blisko povezane matične stanice T-memorije u korelaciji su s in vivo ekspanzijom CAR. CD19-T stanice čuvaju IL-7 i IL-15. Blood 123, 3750-3759 (2014).

52. Cieri, N. i sur. IL-7 i IL-15 daju upute za stvaranje ljudskih memorijskih matičnih T stanica iz naivnih prekursora. Blood 121, 573–584 (2013).

53. Hansel, DE i sur. Zajednička mutacija gena TP53 u morfološki i fenotipski različitom istodobnom primarnom neuroendokrinom karcinomu malih stanica i adenokarcinomu prostate. Prostata 69, 603–609 (2009).

54. Cuzick, J. et al. Prognostička vrijednost potpisa ekspresije RNA izvedenog iz gena proliferacije staničnog ciklusa u bolesnika s rakom prostate: retrospektivna studija. Lancet Oncol. 12, 245–255 (2011).

55. Chen, ME, Lin, SH, Chung, LW & Sikes, RA Izolacija i karakterizacija PAGE-1 i GAGE-7. Novi geni izraženi u LNCaP modelu progresije raka prostate koji dijele homologiju s antigenima povezanim s melanomom. J. Biol. Chem. 273, 17618-17625 (1998).

56. Baley, PA, Yoshida, K., Qian, W., Sehgal, I. & Thompson, TC Progresija do neosjetljivosti na androgene u novom in vitro mišjem modelu raka prostate. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 52, 403–413 (1995).

57. Murad, JP et al. Prekondicioniranje modificira TME kako bi se poboljšala učinkovitost CAR T stanica solidnog tumora i endogeni zaštitni imunitet. Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther. 29, 2335-2349 (2021).

58. Brunda, MJ i sur. Antitumorsko i antimetastatsko djelovanje interleukina 12 protiv mišjih tumora. J. Exp. Med. 178, 1223-1230 (1993).