Sustavna identifikacija i usporedba eksprimiranih profila egzosomalnih MiRNA u svinja zaraženih sojem NADC30-poput PRRSV-a

Jednostavan sažetak:Egzosomi igraju jedinstvenu ulogu u virusnoj infekciji, prezentaciji antigena i supresiji/promicanju tjelesnog imuniteta. Virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRSV) jedan je od najštetnijih patogena u svinjogojskoj industriji. Ovdje smo upotrijebili soj PRRSV NADC30-kao što je CHsx1401 da umjetno inficiramo 42-dnevne svinje, izoliramo serumske egzosome i identificiramo 33 značajno različito izražene (DE) egzosomske miRNA između zaražene i kontrolne skupine, i 18 DE miRNA povezanih s PRRSV infekcijom i imunitetom pregledano je kao potencijalne funkcionalne molekule uključene u regulaciju PRRSV virusne infekcije pomoću egzosoma.

Sažetak:Egzosomi su biološki vezikuli koje izlučuju i otpuštaju stanice koje djeluju kao posrednici međustanične komunikacije i igraju jedinstvenu ulogu u infekciji virusom, predstavljanju antigena i supresiji/promicanju tjelesnog imuniteta. Virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRSV) jedan je od najštetnijih patogena u svinjogojskoj industriji i može uzrokovati reproduktivne poremećaje kod krmača, respiratorne bolesti kod svinja, smanjeni učinak rasta i druge bolesti koje dovode do smrtnosti svinja. U ovoj smo studiji upotrijebili soj PRRSV NADC30-poput CHsx1401 za umjetnu infekciju 42-dnevnih svinja i izolaciju serumskih egzosoma. Na temelju tehnologije sekvenciranja visoke propusnosti, identificirano je 305 miRNA u serumskim egzosomima prije i nakon infekcije, među kojima su 33 miRNA bile značajno različito izražene između skupina (13 relativno pojačano i 20 relativno smanjeno). Analiza očuvanja sekvence genoma CHsx1401 identificirala je 8 očuvanih regija, od kojih je predviđeno da se ukupno 16 različito izraženih (DE) miRNA veže na očuvanu regiju najbližu 30 UTR genoma CHsx1401, uključujući 5 DE miRNA koje se mogu vezati na CHsx1401 30 UTR (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486, ssc-miR-6529). Daljnja analiza otkrila je da su ciljni geni različito izraženih miRNA uvelike uključeni u signalne putove povezane s egzosomskom funkcijom i urođenom imunošću, te 18 DE miRNA (ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 , ssc-miR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, itd.) povezani s PRRSV infekcijom i imunitetom su ispitani kao potencijalne funkcionalne molekule uključene u regulaciju infekcije virusom PRRSV putem egzosoma.

biljka cistanche koja jača imunološki sustav

Ključne riječi:PRRSV; serumski egzosom; miRNA

1. Uvod

Virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRSV) je jednolančani virus RNA pozitivnog lanca sa strukturom ovojnice koji pripada redu Nidovirales, obitelji Arteriviridae, rodu Betaarterivirus [1,2]. On je sferičan ili elipsoidan s promjerom od 50-65 nm pod elektronskim mikroskopom za zamrzavanje [3,4]. Genom PRRSV dugačak je oko 15 kb s kapom od 50 i poliA repom od 30 i sadrži najmanje 10 otvorenih okvira čitanja (ORF) okruženih neprevedenim regijama (UTR) na 50 i 30 kraju [5,6] i omotan je nukleokapsidnim proteinom, s dvoslojnom lipidnom prevlakom koja tvori virusne čestice. Egzosomi pripadaju vezikulama s jednoslojnom strukturom membrane i imaju istu topološku strukturu kao i stanice [7]. Pod elektronskim mikroskopom ima oblik "čaše" ili "u obliku diska" [8,9]. Egzosomi mogu postojati u krvožilnom sustavu dugo vremena, a tvari u egzosomima mogu apsorbirati susjedne stanice ili udaljene receptorske stanice i zatim regulirati receptorske stanice da sudjeluju u razmjeni genetskog materijala između stanica [10,11]. Uglavnom se sastoje od membranskih površinskih tvari i sadržaja koji se prenosi, uključujući receptore na površini stanice, membranske proteine, topive proteine, lipide, RNA (mRNA, miRNA, lncRNA i virusna RNA, itd.), genomsku DNA, mitohondrijsku DNA [12-14]. ]. MikroRNA (miRNA) su klasa od 18-25 nukleotida (nt) evolucijski očuvanih endogenih nekodirajućih jednolančanih malih RNA, koje inhibiraju proces translacije induciranjem degradacije ciljne mRNA ili vezanjem s 30 UTR ciljne mRNA, što dovodi do do posttranskripcijskog utišavanja gena, zatim reguliranja ekspresije gena na posttranskripcijskoj razini [15-17]. Procjenjuje se da miRNA reguliraju više od 60% gena sisavaca nakon transkripcije [18,19]. MiRNA igraju važnu ulogu u međustaničnoj komunikaciji i također se mogu koristiti kao potencijalna funkcionalna molekula za bolesti i virusne infekcije, prijenos i obranu [20]. Sve veći broj studija pokazuje da miRNA mogu biti prisutne u tjelesnim tekućinama, kao što su slina, urin, majčino mlijeko i krv, te djelovati kroz cirkulacijski sustav tekućine u tijelu [21,22]. Egzosomalne miRNA se smatraju endogenim regulatorima ekspresije gena i metabolizma i mogu ukazivati ​​na različita patološka stanja [23,24].

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Tijekom posljednja dva desetljeća pokazalo se da miRNA imaju ključnu ulogu u regulaciji razvoja imunoloških stanica, urođenih imunoloških odgovora i stečenih imunoloških odgovora. Prijavljeno je da neke druge miRNA oštećuju infekciju PRRSV-om na sljedeće načine, izravno ciljaju genom PRRSV-a ili receptor PRRSV-a ili igraju ulogu regulirajući urođeni imunološki odgovor domaćina. Obitelj miR-26 može značajno oštetiti replikaciju virusa, a miR-26a može inhibirati replikaciju sojeva PRRSV tipa 1 i tipa 2 u svinjskim alveolarnim makrofagima (PAM) reguliranjem interferona tipa I (IFN) put, koji je učinkovitiji od miR-26b [25,26]. Identificirano je da miR-30c i miR-125b moduliraju urođeni imunološki odgovor domaćina ciljanjem na put IFN tipa I i put NF-κB [27-29]. MiR-23, miR-378 i miR-505 antivirusni su čimbenici domaćini koji ciljaju na PRRSV i imaju konzervativna ciljna mjesta u tipu 2 sojeva PRRSV-a [30]. Istovremeno je utvrđeno da miR-506 domaćina inhibira replikaciju PRRSV-a izravnim ciljanjem PRRSV receptora CD151 u MARC-145 stanicama [31]. miR-181 također može neizravno inhibirati replikaciju PRRSV-a regulacijom naniže PRRSV receptora CD163 u monocitima krvi i PAM-ovima [32]. Osim toga, miRNA mogu pospješiti replikaciju PRRSV-a ometanjem osnovne fiziologije stanice. MiR-24-3p i miR-22 izravno ciljaju 30 UTR HO-1 tijekom infekcije PRRSV-om kako bi izbjegli inhibiciju hem oksigenaze-1 (HO-1), a protein toplinskog šoka (također poznat kao HSP32) na PRRSV [33,34]. Poznato je da su svinje osjetljivije na PRRSV i slabije se mogu obraniti od ulaska ovog uzročnika u organizam [35]. U ovoj studiji, urođeni imunitet i stečeni imunitet svinja zaraženih ovim virusom proučavani su na molekularnoj razini korištenjem soja koji prevladava na terenu. Komplet za izolaciju egzosoma u serumu, transmisijska elektronska mikroskopija (TEM), analiza praćenja nanočestica (NTA) i Western blot (WB) korišteni su za izolaciju i identifikaciju egzosoma u serumu prije i nakon infekcije PRRSV-om, nakon čega je uslijedila analiza sekvenciranja male RNA, identifikacija, i analiza rezultata diferencijalne ekspresije korištenjem bioinformatičkih metoda za dobivanje nekoliko miRNA serumskih egzosoma povezanih s PRRSV-om, nakon čega slijedi identifikacija rezultata podataka korištenjem kvantitativne PCR u stvarnom vremenu (qRT-PCR).

2. Materijali i metode

2.1. Pokusi na životinjama

Šest dvostruko negativnih na PRRSV antigen i antitijela zdravih velikih bijelih svinja starih 42- dana stavljeno je u sustav za čisto hranjenje svinja radi izolacije, zdravstvene zaštite i prilagodbe okolišu. Sve su svinje mogle slobodno jesti i piti bez ograničenja. Kada su se upoznali s uvjetima u izolatoru, svinje su nazalno inokulirane s 2 mL 105 TCID50/mL PRRSV NADC30-kao što je CHsx1401, koji su spomenuli prethodnici [36,37]. Krv svinja prije (kontrolna skupina, n=6) i 7 dana nakon (liječena skupina, n=6) inokulacije virusa prikupljena je iz prednje šuplje vene za izolaciju seruma. Stanični ostaci u serumu uklonjeni su centrifugiranjem na 3000 g tijekom 15 minuta. Sve pokuse na životinjama u našoj studiji odobrio je Odbor za etiku životinja Instituta za znanost o životinjama Kineske akademije poljoprivrednih znanosti (CAAS) (Peking, Kina), IAS2022-130.

2.2. Izolacija i pročišćavanje serumskih egzosoma

Izolacija i pročišćavanje egzosoma provedeno je korištenjem exoEasy Maxi kompleta (QIAGEN, Hilden, Njemačka, kat. br. 76064) prema protokolu proizvođača.

2.3. Transmisijska elektronska mikroskopija (TEM)

Ekstrahirane suspenzije egzosoma nanesene su na bakrenu mrežicu obloženu karbonom formvarom, a egzosomi su isprani PBS-om i podvrgnuti standardnom bojenju uranil acetatom 3 minute na sobnoj temperaturi. Nakon nekoliko minuta sušenja na sobnoj temperaturi, mreža je vizualizirana i fotografirana na 100 kV transmisijskim elektronskim mikroskopom (HT-7700, Hitachi-High Tech, Tokio, Japan).

2.4. Analiza praćenja nanočestica (NTA)

Ekstrahirani egzosomi razrijeđeni su s 1 × PBS promjenom volumena od 10 do 30 µL. Nakon što je uzorak testiran, koncentracija i veličina serumskih egzosoma analizirani su protočnim nanoanalizatorom N30E prema uputama proizvođača (NanoFCM, Xiamen, Kina).

2.5. Western Blot

Ekstrahirani uzorci egzosoma dodani su u RIPA lizat pomiješan s inhibitorom proteaze (Invitrogen, Waltham, MA, SAD) i fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF) kako bi se ekstrahirao protein egzosoma, koji je liziran na ledu 30 minuta. Zatim smo, prema uputama Bradford kita, kvantificirali koncentraciju egzosomskog proteina u serumu. Proteini egzosoma podvrgnuti su toplinskoj denaturaciji. Ista količina proteina je odvojena na 12% SDS-PAGE gelu i zatim prebačena na membranu od poliviniliden fluorida (PVDF) (Millipore, Burlington, MA, SAD). Namočen je u TBST koji sadrži 5% obranog mlijeka u prahu i zatvoren 1 h na sobnoj temperaturi. Namočili smo membranu u razrijeđenom primarnom antitijelu (anti-CD9 antitijelo, Abcam, Boston, MA, SAD, #ab92726; anti-CD81 antitijelo, Abcam, Boston, MA, SAD, #ab109201) preko noći na 4 ◦C, i oporavili primarno antitijelo. Namočili smo membranu u razrijeđeno sekundarno antitijelo, inkubirali je na sobnoj temperaturi 1 h i izvukli sekundarno antitijelo. Položili smo isprani film PBST-a na film za svježinu, dodali jednaki volumen miješane ECL a/b kromogene otopine i stavili ga u uređaj za kemiluminiscenciju.

koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav

Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda za jačanje imuniteta

【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.6. Sekvenciranje egzosomalne male RNK i analiza podataka

Ukupna RNA iz egzosoma ekstrahirana je s Trizolom prema uputama proizvođača. Zatim smo detektirali koncentraciju RNK i vrijednost optičke gustoće (OD) i detektirali degradaciju i čistoću RNK elektroforezom u 1% agaroznom gelu. U međuvremenu, Agilent Bioanalyzer 2100 korišten je za otkrivanje integriteta RNA. Koristili smo ukupnu RNA egzosoma nakon provjere kvalitete. Prema uputama proizvođača koristili smo set za pripremu male RNA knjižnice NEB NEXT multiplex za Illumina® (Illumina, San Diego, CA, SAD). Komplet je pripremio malu biblioteku RNA cDNA i sekvencionirao je da proizvede 50 nt jednostranih očitavanja pomoću platforme Illumina Novaseq 6000. Sve postupke za pripremu male RNA knjižnice izvršio je Novogene (Peking, Kina). Podaci nakon kontrole kvalitete usklađeni su s referentnim genomom svinje (Sus scrofa 11.1) pomoću leptir mašne. Poznate miRNA identificirane su pomoću baze podataka miRbase (v22.0) [38] (https://www.mirbase.org, pristupljeno 14. siječnja 2022.), miRdeep2 (v0.0.5) [39] i miRevo (v1.1 ) [40] i korišteni su za predviđanje novih miRNA. U isto vrijeme, diferencijalna analiza ekspresije za miRNA provedena je pomoću DESeq (v1.24.0) [41], zahtijevajući |fold change| > 1,6 i p < 0,05. Usklađivanje je provedeno korištenjem MEGA (V11) [42] nakon čega je uslijedilo ocjenjivanje jedne baze korištenjem PHAST (v1.6.9) [43] i procjena najočuvanijih regija 10 virusnih gena, uključujući WUH3 (GenBank pristupni br. HM853973), VR2332 ( GenBank pristupni br. U87392), JXA1 (GenBank pristupni br. EF112445), CH-1a (GenBank pristupni br. AY032626), NADC30 (GenBank pristupni br. HN654459), HUN4 (GenBank pristupni br. EF635006), HLJZD 22-1812 (GenBank pristupni br. MN648450), SC/DJY (GenBank pristupni br. MT075480) i Lelystad (GenBank pristupni br. M96262.2). RNAhybrid (V2.0) [44] korišten je za predviđanje vezanja identificirane miRNA sekvence na 3 0 UTR genoma virusa CHsx1401. Miranda (v3.3a) i RNAhybrid korišteni su za ciljano predviđanje gena. Profil klastera [45] R paket korišten je za GO (Gene Ontology) analizu funkcionalnog obogaćivanja ciljnih gena i KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) analizu obogaćivanja puta.

2.7. Validacija ekspresije miRNA pomoću RT-qPCR

Ukupna RNA izolirana je iz serumskih egzosoma pomoću Trizola (Invitrogen, Šangaj, Kina) prema protokolu proizvođača. Izolirana RNA je verificirana pomoću RT-qPCR na uzorcima (n=6 po skupini). cDNA je sintetizirana u skladu s uputama kompleta za sintezu cDNA 1st strand miRNA (putem stem-loop) (Vazyme, Nanjing, Kina), a kvantifikacija fluorescencije provedena je pomoću ABI 7500 prema upute za miRNA univerzalnu SYBR qPCR glavnu mješavinu (Vazyme, Nanjing, Kina). Upotrijebljeni parametri toplinskog ciklusa bili su sljedeći: prvi stupanj: 95 ◦C tijekom 30 s; Faza 2: 95 ◦C 5 s, 60 ◦C 34 s i 40 ciklusa; Faza 3: 95 ◦C 15 s, 60 ◦C 1 min i 95 ◦C 15 s. Primer sekvence miRNA, U6 gen, korištene su kao referenca [46] i navedene u Dodatnoj tablici S1. Sve qRT-PCR provjere provedene su pomoću tri biološka ponavljanja i s tri ponavljanja za svaki uzorak. Relativna brojnost transkripata izračunata je 2-Ct metodom, a SPSS (v22.0) i GraphPad Prism (v8.0) korišteni su za analizu podataka, odnosno mapiranje. p < 0,05 znači da je razlika statistički značajna.

3. Rezultati

3.1. Relativna vrijednost antigena i antitijela nakon inokulacije virusa

Rezultati testova PRRSV antigena i protutijela prije (dan 0) i nakon (dan 7) izlaganja prikazani su u tablici 1. Serološka detekcija PRRSV antigena i protutijela prije izlaganja bila je negativna, a antigen je pozitivan nakon izlaganja, što ukazuje da su svinje uspješno zaražene s CHsx1401.

3.2. Izolacija i identifikacija serumskih egzosoma

Vezikule izolirane iz seruma otkrivene su TEM-om. Većina vezikula može vidjeti konkavne egzosome u obliku tanjura ili diska u sredini. Rub membrane egzosoma je vidljiv, a morfologija je relativno potpuna (Slika 1A, B). Analiza praćenja nanočestica pokazala je da 95,73% egzosoma ima promjer od 30-150 nm, uglavnom oko 72,25 nm, s prosječnim promjerom od 76,22 nm, što je u skladu s karakteristikama veličine egzosoma (Slika 1C). Ovaj raspon veličina bio je sličan onom otkrivenom TEM-om i dodatno je potvrdio identitet ovih vezikula kao egzosoma. Western blot analiza pokazala je da su vezikule izolirane iz uzoraka seruma bile pozitivne na proteine ​​CD9 i CD81 (Slika 1D). Gore navedene karakteristike u skladu su sa standardima identifikacije egzosoma koje je formuliralo Međunarodno društvo za dodatne vezikule (ISEV) u MISEV2018 [47].

Tablica 1. Antigen i protutijela (dan 0) i (dan 7) s izazovnim virusom.

Slika 1. Glavne karakteristike serumskih egzosoma. (A, B) prikazuju morfološke karakteristike vezikula pomoću TEM-a. Ljestvice su 500 nm, odnosno 100 nm. (C) NTA pokazuje promjer i koncentraciju većine vezikula. (D) Western blot je pokazao prisutnost egzosomskih markera CD81 i CD9 u serumskim egzosomima. Napomena: Mix in WB rezultati su uzorak miješane suspenzije izolirane exoEasy Maxi kitom

3.3. Sekvenciranje malih RNA egzosoma u serumu

Za svaki uzorak, čisti podaci dosegli su 0,5 Gb, a osnovni postotak Q30 bio je iznad 96,20%. Čista očitanja svakog uzorka su usklađena s referentnim genomom svinje. Među 12 uzoraka, kontrolna skupina je dobila 10,920,887, 10,248,696, 10,109,117, 10,655,494, 9,217,285, odnosno 9,782,523 očitavanja. Grupa za liječenje je dobila 11,889,518, 10,593,504, 10,593,504, 12,846,080, 10,105,325, 11,729,451, odnosno 9,789,542 očitavanja. U prosjeku, 77,96% ukupnih čistih očitanja sadržavalo je 19-22 nukleotida (nt) u duljinu (Slika 2A). Očitavanja nakon kontrole kvalitete činila su više od 92,59% ukupnih očitanja. Obrađena čista očitanja bila su usklađena s referentnim genomom svinje, a mapirana stopa 12 biblioteka na genomu bila je veća od 92,30%, a mapirana stopa bila je 94,98% (Slika 2B). Pokazalo se da je konstruirana egzosomska biblioteka miRNA u serumu bila visoke kvalitete i prikladna za daljnju analizu. Pojedinosti su navedene u Dodatnoj tablici S2.

Slika 2. Pregled podataka o malim RNA transkriptomima. (A) Distribucija duljine očitanih brojeva uzoraka egzosoma u serumu (nt=nukleotida); (B) stopa od 12 uzoraka mapiranih na referentni genom

3.4. Analiza diferencijalne ekspresije miRNA

Nakon kvantitativne analize identificirane ekspresije miRNA, miRNA su pregledane prema pragovima opisanim prethodno u odjeljku 2.6. Ukupno 305 miRNA dobiveno je prije i nakon inokulacije soja CHsx1401 (kontrola, n=6; tretman, n=6). Ukupno 33 različito izražene (DE) miRNA identificirane su između dviju skupina, 13 DE miRNA je regulirano prema gore, a 20 DE miRNA je smanjeno u liječenoj skupini (Slika 3 i Dodatna tablica S3).

3.5. Analiza funkcionalnog obogaćivanja ciljnih gena miRNA

Ukupno 7283 ciljna gena predvidjela su 33 DE miRNA, a funkcije ciljnih gena uglavnom su bile koncentrirane na pozitivnu regulaciju MAPK kaskade, proces metabolizma lipida, regulaciju unutarstanične transdukcije signala, ERK1 i ERK2 kaskade itd. (Slika 4A ). Što se tiče molekularnih funkcija, različito izraženi ciljni geni miRNA uglavnom su usmjereni na regulatornu aktivnost GTP-enzima, aktivnost kinaze, regulatornu aktivnost nukleozid trifosfataze i druge funkcije povezane s prijenosom signala i energetskim metabolizmom (Slika 4B). Osim toga, među komponentama stanice, ciljni geni uglavnom sudjeluju u biološkim funkcijama supramolekularnih polimera, Golgija, autofagosoma, stanične površine, ranih endosoma itd. (Slika 4C). Funkcije ovih komponenti usko su povezane s formiranjem egzosoma, što također objašnjava točnost sekvenciranja. Analiza obogaćivanja KEGG puta pokazala je da su ciljni geni značajno obogaćeni u endocitozi, MAPK signalnom putu, Rap1 signalnom putu, sfingolipidnom signalnom putu i PI3K Akt signalnom putu (p < 0.05) (Slika 5A ). U isto vrijeme, obogaćeni putovi su klasificirani i analizirani. Rezultati su pokazali da je KEGG put ciljnog gena uglavnom obogaćen u obradi informacija o okolišu, ljudskim bolestima i biološkim sustavima (Slika 5B).

Slika 3. Diferencijalna ekspresija miRNA u egzosomima. (A) Vulkanski dijagram miRNA između kontrolne i tretirane skupine; (B) hijerarhijska toplinska karta klasteriranja DE miRNA između kontrolnih i tretiranih skupina.

Slika 4. Analiza obogaćivanja funkcije GO ciljnih gena DE miRNA. (A) Biološki proces ciljanih gena DE miRNA; (B) molekularne funkcije DE miRNA ciljanih gena; (C) stanične komponente DE miRNA ciljnih gena

Slika 5. Analiza obogaćenja KEGG puta ciljnih gena. (A) Značajno obogaćen KEGG put s ciljnim genima DE miRNA; (B) klasifikacija značajno obogaćenih KEGG putova.

3.6. Predviđanje ciljanja serumske egzosomalne miRNA i PRRSV CHsx1401 genoma

Prema ocjeni phastCons jedne baze nakon poravnanja pomoću PHAST, među virusnim genomima dobiveno je ukupno osam najočuvanijih segmenata (crne trake iznad mape vrhova) (Slika 6). Utvrđeno je da se ukupno 31 DE miRNA veže za očuvani segment predviđanjem miRNA vezanih za očuvani segment. Među njima, u očuvanoj regiji (14 644–15 020 nt) najbližoj 30 UTR (14 870–15 020) genoma CHsx1401, predviđa se da će se 16 DE miRNA vezati na njega, uključujući 5 miRNA (ssc-miR-34 c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 i ssc-miR-6529) koji se mogu vezati na 30 UTR CHsx1401. Među tim miRNA-ima, samo je ssc-miR-223 reguliran prema gore nakon infekcije, a druge miRNA-e su regulirane prema dolje nakon infekcije. Pogledajte dodatnu tablicu S4 za detalje.

Slika 6. Konzervirani segmenti u genomu soja CHsx1401 koje predviđa PHAST

3.7. Probir DE miRNA povezanih s funkcijom egzosoma i PRRSV-om

Različite različito izražene miRNA povezane s funkcijom egzosoma i PRRSV-a pronađene su analizom funkcionalnog obogaćivanja ciljnih gena. Među njima, 11 DE miRNA kao što su ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 i ssc-miR-320 uključeni su u unos egzosoma, a njihovi ciljni geni uglavnom su koncentrirani u obitelj gena Ras, obitelj aneksina i obitelj gena za ribozilaciju ADP. Osamnaest DE miRNA, uključujući sscmiR-10b, ssc-miR-124a i ssc-miR-128, sudjeluje u putevima povezanim s imunološkim sustavom, a njihovi ciljni geni uglavnom su koncentrirani u MAPK obitelj gena, obitelj gena PIK3 i obitelj gena proteinske fosfataze. Dok je 11 DE miRNA uključeno u invaziju virusa, srodni ciljni geni uglavnom su koncentrirani u obitelji gena MAPK i obitelji gena proteinske fosfataze. Nadalje, višestruko različito izražene miRNA, kao što je nova_102. Šest DE miRNA, uključujući ssc-miR-320, ssc-miR-423-5p, ssc-miR-4331-3p,ssc-miR-7137-3p i ssc-miR{{ 25}}, koeksprimirani su u funkciji egzosoma, invaziji virusa PRRSV-a i putovima povezanim s imunološkim sustavom, kao što je prikazano na slici 7. Pojedinosti su prikazane u dodatnoj tablici S5.

Slika 7. DE miRNA povezane s unosom egzosoma, invazijom PRRSV-a i imunitetom

3.8. QRT-PCR analiza DE miRNA između dviju skupina

Pet DE miRNA nasumično je odabrano za verifikaciju. Prema rezultatima qRT-PCR, ekspresija ssc-miR-19a i ssc-miR-32 porasla je u terapijskoj skupini, dok su ssc-miR-124a, ssc-miR{ {8}} i ssc-miR-34c pokazali su veću ekspresiju u kontrolnoj skupini, u skladu s podacima sekvenciranja (Slika 8).

Slika 8. Pet DE miRNA potvrđenih qRT-PCR-om

4. Rasprava

PRRSV je još uvijek tvrdoglavi patogen u globalnoj industriji svinja, uzrokujući ogromne ekonomske gubitke u svijetu. Trenutno se cijepljenje uglavnom koristi za prevenciju i kontrolu PRRSV-a, među kojima je cjepivo s modificiranim živim (MLV) virusom koje se najviše koristi [48]. Iako je ovo cjepivo bilo učinkovito u smanjenju izbijanja i učestalosti PRRS-a, također je uvelike povećalo genetsku varijaciju i raznolikost virusa i dovelo do virusne rekombinacije između divljih i živih virusa cjepiva na terenu [49,50]. Posljednjih godina, širenje i prevalencija rekombinantnog virusa NADC30-nalik PRRSV soju uzrokovali su višestruka izbijanja reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja u Kini. Sličnost između CHsx1401 i NADC30 korištenih u ovoj studiji ostala je na 92,2–99,1%. Od tada je postao epidemijski soj u Kini. Egzosomi, kao posrednici stanične komunikacije, široko su prisutni u raznim tjelesnim tekućinama i imaju jedinstvene prednosti u dijagnozi i liječenju bolesti [51,52]. Prema prethodnim izvješćima, egzosomi igraju važnu komunikacijsku ulogu u prezentaciji antigena [53], imunološkom odgovoru [53,54], replikaciji virusa [54], raku [55], neurodegenerativnim bolestima [56], angiogenezi [57], tumorskim stanicama migracije [58] i invazije [59], te imaju veliku istraživačku vrijednost.

U ovoj studiji korištena je visokoučinkovita tehnologija sekvenciranja za konstruiranje profila ekspresije miRNA serumskih egzosoma, a identificirane su 33 DE miRNA. Kao što svi znamo, miRNA kodirana kod domaćina može se vezati s virusnim genomom i zatim regulirati replikaciju, sintezu i oslobađanje virusa kako bi se ograničila infekcija i utjecalo na patološki proces [15]. Studije miRNA koje ciljaju virusni genom također su više puta prijavljene na životinjama. gga-miR-454 i gga-miR-130b kod infektivne burzalne bolesti pilića mogu ciljati virusni genom da inhibiraju replikaciju virusa, dok gga-miR-21 izravno cilja virusni protein VP1 da inhibira translacija virusnog proteina [60,61]. U studijama PRRSV-a, ssc-miR-181 specifično se veže na visoko očuvanu regiju nizvodno od virusnog genoma ORF4 i snažno inhibira replikaciju PRRSV-a [62]. U ovoj studiji razlika u ekspresiji ssc-miR-181 između dviju skupina nije dosegla značajnu razinu. U našoj studiji uspoređeni su genomi devet različitih virusa PRRSV-a s genomima soja CHsx1401 i identificirano je osam najočuvanijih segmenata. Predviđeno je da bi se 31 DE miRNA mogla vezati za 8 najočuvanijih segmenata CHsx1401, a 16 DE miRNA moglo bi se vezati za očuvane sekvence blizu 30 UTR od CHsx1401. Među njima, 5 DE miRNA (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 i ssc-miR{{ 36}}) mogu se istovremeno vezati na CHsx1401 30 UTR. Osim toga, predviđeno je da se pojačana ekspresija ssc-miR-223 veže na cilj 30 UTR genoma PRRSV. Rezultati su pokazali da bi konzervirane sekvence genoma virusa mogle igrati ključnu ulogu u njegovoj patogenosti, a miRNA koje se mogu vezati na konzervirane sekvence između genoma različitih sojeva PRRSV-a mogu imati važan značaj u kontroli patogenosti virusa. Prethodne studije su pokazale da su neke različito izražene miRNA povezane s PRRSV-om i čak izravno uključene u regulaciju PRRSV-a, uključujući ssc-miR-10b [63], ssc-miR-378 [30] , ssc-miR-124a [64], neka-7f-5p [65], ssc-miR-744 [66] i ssc-miR{{57 }}a [67].

PRRSV može izbjeći obranu domaćina ometanjem urođenog imunološkog odgovora. Ovaj proces reguliraju mnogi signalni putovi, uključujući MAPK signalni put, PI3K Akt signalni put, autofagiju, kemokin i TNF signalni put. Trenutno MAPK signalni put uključuje tri glavna puta: ERK1/2, JNK i p38 put. Aktivacija MAPK kaskade može pospješiti apoptozu stanice domaćina, pomoći virusu da izbjegne imunološki obrambeni odgovor domaćina i potaknuti replikaciju PRRSV-a [68]. Štoviše, aktivacija c-Jun N-terminalnih kinaza (JNK) i p38 također može potaknuti oslobađanje upalnog faktora IL-10 [68-70] i pojačati upalni učinak. Uz induciranje apoptoze, PRRSV također može inducirati autofagiju, koja može pospješiti replikaciju PRRSV-a. Aktivacija PI3K/Akt neophodna je za ulazak virusa i promicanje replikacije virusa, a Akt aktiviran PRRSV-om inhibira apoptozu stanice domaćina negativnom regulacijom JNK puta [71]. TNF Može igrati važnu ulogu u indukciji i regulaciji upalnog odgovora zajedno s drugim upalnim čimbenicima, ali na ekspresiju TNF-a utječe negativna regulacija replikacije PRRSV-a [72]. U ovoj studiji miRNA (ssc-miR-10b, ssc-miR-122-5p, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, ssc-miR{ {24}}a-5p, itd.) obogaćeni tim putevima uključeni su u apoptozu, autofagiju i upalu izazvanu PRRSV-om i usko su povezani s virusnim imunološkim odgovorom, imunološkom evazijom i replikacijom.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Stanična plazma membrana bogata je raznim lipidnim splavima, a sfingolipidi bogati sfingolipidima i kolesterolom (sfingomijelin i glikosfingolipidi) ključne su molekule lipidnih splavi. Prepoznavanje lipida od strane nekih proteina virusa može biti nužan uvjet za ulazak virusa [73]. Virusi ovojnice umeću glikoproteine ​​virusne ovojnice u lipidne splavi u fazi ulaska virusa, stupaju u interakciju s receptorima koji se nalaze u lipidnim splavima ili se mijenjaju iz svog prirodnog stanja u aktivirani oblik kako bi započeli ili pospješili internalizaciju/fuziju virusa, kao što su HSV, SARS koronavirus i virus epidemijske dijareje prasadi [73,74]. Prethodne studije su otkrile da je uklanjanje kolesterola s površine MARC-145 stanica značajno smanjilo PRRSV infekciju, pokazujući da je inhibicija PRRSV infekcije specifično posredovana uklanjanjem staničnog kolesterola. Smanjenje kolesterola u staničnoj membrani značajno je inhibiralo ulazak virusa, osobito pričvršćivanje i oslobađanje virusa [75]. Metabolizam sfingolipida može regulirati strukturu i adheziju membrane, što je od velikog značaja u invaziji virusa PRRSV. Endocitoza je bila najznačajnije obogaćenje u ovoj studiji. Endocitoza je važan mehanizam preuzimanja egzosoma od strane ciljnih stanica. Prethodne studije su pokazale da je unos egzosoma proces koji zahtijeva energiju i ovisi o citoskeletu, što naglašava potencijalnu ulogu endocitoze u ovom procesu [76]. Dokazano je da nekoliko putova može posredovati u ovom procesu, uključujući fagocitozu, makropinocitozu, klatrin itd. [77,78], što je dovelo do različitih klasifikacija i uloga endocitoziranih tvari. Obogaćivanje različito izraženih egzosomalnih miRNA u ovom putu ukazuje na to da egzosomi igraju važnu ulogu u infekciji PRRSV-om, a regulacija transporta sadržaja i unosa u egzosome može dovesti do patofizioloških promjena u ciljnim stanicama i organima.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

5. Zaključci

Kroz identifikaciju i bioinformatičku analizu serumskih egzosomalnih miRNA iz svinja zaraženih PRRSV-om, u ovoj studiji dobiveni su različiti putevi povezani s PRRSV-om i različito izražene miRNA, kao što su ssc-miR-4331-3p, ssc-miR{{ 5}}, sscmiR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128 itd., koji imaju potencijalne funkcionalne uloge u PRRSV-u -inducirani imunološki odgovor, invazija i preuzimanje egzosoma. Osim toga, budući da jedna miRNA može ciljati više gena, a jedan gen također regulira više miRNA, nekoliko miRNA obavlja višestruke funkcije u gornjim putevima. Za neke miRNA je potvrđeno da reguliraju PRRSV infekciju djelovanjem na ključne receptore ili izravnim ciljanjem na genom virusa, kao što su ssc-miR-10b, ssc-miR-378, miR-124a, let-7f-5p, ssc-miR-744, ssc-miR-19a, itd. U međuvremenu, ova studija je također predvidjela niz miRNA koje se mogu vezati na najočuvaniji fragment 30 UTR genoma virusa CHX1401, uključujući ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR{{34} } i ssc-miR-6529, koji mogu biti važni za regulaciju virusne patogenosti.

Reference

1. Snijder, EJ; Kikkert, M.; Fang, Y. Molekularna biologija i patogeneza arterivirusa. J. Gen. Virol. 2013., 94, točka 10, 2141–2163. [CrossRef] [PubMed]

2. Lu, Y.; Zhang, Y.; Xiang, X.; Sharma, M.; Liu, K.; Wei, J.; Shao, D.; Li, B.; Tong, G.; Olszewski, MA; et al. Notch signalizacija pridonosi ekspresiji upalnih citokina izazvanih infekcijom visokopatogenim virusom reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (HP-PRRSV) u svinjskim alveolarnim makrofagima. Dev. Comp. Immunol. 2020, 108, 103690. [CrossRef] [PubMed]

3. Dea, S.; Sawyer, N.; Alain, R.; Athanassious, R. Ultrastrukturne karakteristike i morfogeneza virusa svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma razmnoženog u visoko permisivnom MARC{1}} staničnom klonu. Adv. Exp. Med. Biol. 1995, 380, 95–98. [PubMed]

4. Dokland, T. Strukturna biologija PRRSV-a. Virus Res. 2010, 154, 86–97. [CrossRef] [PubMed]

5. Johnson, CR; Griggs, TF; Gnanandarajah, J.; Murtaugh, MP Novi strukturni protein u virusu reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja kodiran alternativnim ORF5 prisutnim u svim arterivirusima. J. Gen. Virol. 2011, 92 Pt 5, 1107-1116. [CrossRef] [PubMed]

6. Lee, SC; Lee, S.; Yoo, GW; Choi, HW; Ne, YH; Park, CE; Shin, JH; Yoon, IJ; Kang, SY; Lee, C. Fenotipske i genotipske analize atenuiranog soja virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja nakon serijskih pasaža u uzgojenim svinjskim alveolarnim makrofagima. J. Vet. Sci. 2018, 19, 358–367. [CrossRef] [PubMed]

8. Zebrowska, A.; Skowronek, A.; Wojakowska, A.; Widlak, P.; Pietrowska, M. Metabolome egzosoma: fokus na vezikule koje oslobađaju stanice raka i prisutne su u tekućinama ljudskog tijela. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3461. [CrossRef]

8. Bebelman, MP; Smit, MJ; Pegtel, DM; Baglio, SR Biogeneza i funkcija izvanstaničnih vezikula kod raka. Pharmacol. Ther. 2018, 188, 1–11. [CrossRef]

9. Zaborowski, MP; Balaj, L.; Breakefield, XO; Lai, CP Izvanstanične vezikule: sastav, biološka važnost i metode proučavanja. Bioscience 2015, 65, 783–797. [CrossRef]

10. Almughlliq, FB; Koh, YQ; Peiris, HN; Vaswani, K.; Holland, O.; Meier, S.; Roche, JR; Burke, CR; Crookenden, MA; Arachchige, BJ; et al. Cirkulirajući egzosomi mogu identificirati biomarkere za krave s rizikom od metaboličke disfunkcije. Sci. Rep. 2019, 9, 13879. [CrossRef]

11. Zhang, RC; Du, WQ; Zhang, JY; Yu, SX; Lu, FZ; Ding, HM; Cheng, YB; Ren, C.; Geng, DQ Liječenje mezenhimalnim matičnim stanicama za ozljedu perifernih živaca: narativni pregled. Neuralna regen. Res. 2021, 16, 2170–2176. [PubMed]

12. Bryzgunova, OE; Zaripov, MM; Skvortsova, TE; Lekchnov, EA; Grigorjeva, AE; Zaporozhchenko, IA; Morozkin, ES; Ryabchikova, EI; Yurchenko, YB; Voitsitskiy, VE; et al. Usporedna studija izvanstaničnih vezikula iz urina zdravih osoba i bolesnika s rakom prostate. PLoS ONE 2016, 11, e0157566. [CrossRef] [PubMed]

13. Camussi, G.; Deregibus, MC; Bruno, S.; Grange, C.; Fonsato, V.; Tetta, C. Epigenetsko reprogramiranje stanica posredovano egzosomom/mikrovezikulama. Am. J. Cancer Res. 2011, 1, 98–110. [PubMed]

14. Tamkovich, SN; Tutanov, OS; Laktionov, PP Egzosomi: Generacija, struktura, transport, biološka aktivnost i dijagnostička primjena. Biochem. Mosc. Suppl. Ser. Član. Cell Biol. 2016, 10, 163–173. [CrossRef]

15. Bartel, DP MikroRNA: Genomika, biogeneza, mehanizam i funkcija. Ćelija 2004, 116, 281–297. [CrossRef]

17. Gordino, G.; Costa-Pereira, S.; Corredeira, P.; Alves, P.; Costa, L.; Gomes, AQ; Silva-Santos, B.; Ribot, JC MicroRNA-181a ograničava diferencijaciju ljudskih δ T stanica ciljanjem na Map3k2 i Notch2. EMBO Rep. 2022, 23, e52234. [CrossRef]

17. Liu, B.; Yan, L.; Chi, Y.; Sun, Y.; Yang, X. Duga nekodirajuća RNA AFAP1-AS1 olakšava napredovanje raka jajnika reguliranjem osi miR-107/PDK4. J. Ovarian Res. 2021, 14, 60. [Unakrsna Ref.]

18. Kim, Y.; Lee, DH; Park, SH; Jeon, TI; Jung, CH Međudjelovanje mikroRNA i faktora transkripcije u regulaciji autofagije kod nealkoholne masne bolesti jetre. Exp. Mol. Med. 2021, 53, 548–559. [CrossRef]

20. Kazmierczak, D.; Jopek, K.; Sterzynska, K.; Nowicki, M.; Ručinski, M.; Januchowski, R. Profil ekspresije mikroRNA i potencijalna uloga u regulaciji gena otpornih na lijekove kod staničnih linija raka jajnika otpornih na cisplatin i paklitaksel. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 526. [CrossRef]

20. Gong, Y.; Wei, X.; Sun, W.; Ren, X.; Chen, J.; Aweya, JJ; Ma, H.; Chan, KG; Zhang, Y.; Li, S. Egzosomski miR-224 doprinosi homeostazi mikrobiote hemolimfe tijekom bakterijske infekcije u rakova. PLoS Patog. 2021, 17, e1009837. [CrossRef]

21. Cheng, Y.; Kou, W.; Zhu, D.; Yu, X.; Zhu, Y. Budući smjerovi u dijagnozi, prognozi i praćenju bolesti adrenokortikalnog karcinoma: Novi neinvazivni biomarkeri. Ispred. Endocrinol. 2022, 12, 811293. [CrossRef] [PubMed]

22. Gallo, A.; Tandon, M.; Alevizos, I.; Illei, GG Većina mikroRNK koje se mogu otkriti u serumu i slini koncentrirana je u egzosomima. PLoS ONE 2012, 7, e30679. [CrossRef] [PubMed]

23. Fan, B.; Chopp, M.; Zhang, ZG; Liu, XS Nove uloge mikroRNA kao biomarkera i terapijskih ciljeva za dijabetičku neuropatiju. Ispred. Neurol. 2020, 11, 558758. [CrossRef] [PubMed]

24. Wei, H.; Chen, Q.; Lin, L.; Sha, C.; Li, T.; Liu, Y.; Yin, X.; Xu, Y.; Chen, L.; Gao, W.; et al. Regulacija proizvodnje egzosoma i razvrstavanje tereta. Int. J. Biol. Sci. 2021, 17, 163–177. [CrossRef]

25. Jia, X.; Bi, Y.; Li, J.; Xie, Q.; Yang, H.; Liu, W. Stanična mikroRNA miR-26a suzbija replikaciju virusa svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma aktiviranjem urođene antivirusne imunosti. Sci. Rep. 2015, 5, 10651. [CrossRef]

26. Li, L.; Wei, Z.; Zhou, Y.; Jiang, Y.; Yu, L.; Zheng, H.; Tong, W.; Yang, S.; Zheng, H.; Shan, T.; et al. MiR-26a domaćina potiskuje replikaciju virusa svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma pojačanom regulacijom interferona tipa I. Virus Res. 2015, 195, 86–94. [CrossRef]

28. Liu, F.; Wang, H.; Du, L.; Wei, Z.; Zhang, Q.; Feng, WH MicroRNA-30c cilja na beta lanac interferon–alfa/beta receptora za promicanje infekcije tipa 2 PRRSV. J. Gen. Virol. 2018, 99, 1671–1680. [CrossRef]

28. Zhang, Q.; Huang, C.; Yang, Q.; Gao, L.; Liu, HC; Tang, J.; Feng, WH MicroRNA-30c modulira odgovore tipa I IFN kako bi olakšao infekciju virusom reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja ciljanjem na JAK1. J. Immunol. 2016, 196, 2272–2282. [CrossRef]

29. Wang, D.; Cao, L.; Xu, Z.; Fang, L.; Zhong, Y.; Chen, Q.; Luo, R.; Chen, H.; Li, K.; Xiao, S. MiR-125b smanjuje replikaciju virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja negativnom regulacijom puta NF-κB. PLoS ONE 2013, 8, e55838. [CrossRef]

30. Zhang, Q.; Guo, XK; Gao, L.; Huang, C.; Li, N.; Jia, X.; Liu, W.; Feng, WH MicroRNA-23 inhibira replikaciju PRRSV-a izravnim ciljanjem na PRRSV RNA i vjerojatno pojačanom regulacijom interferona tipa I. Virologija 2014, 450–451, 182–195. [CrossRef]

31. Wu, J.; Peng, X.; Zhou, A.; Qiao, M.; Wu, H.; Xiao, H.; Liu, G.; Zheng, X.; Zhang, S.; Mei, S. MiR-506 inhibira replikaciju PRRSV-a u MARC-145 stanicama preko CD151. Mol. Ćelija. Biochem. 2014, 394, 275–281. [CrossRef]

32. Gao, L.; Guo, XK; Wang, L.; Zhang, Q.; Li, N.; Chen, XX; Wang, Y.; Feng, WH MicroRNA 181 suzbija infekciju virusom svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRSV) ciljanjem na PRRSV receptor CD163. J. Virol. 2013, 87, 8808–8812. [CrossRef]

33. Xiao, S.; Du, T.; Wang, X.; NIH.; Yan, Y.; Li, N.; Zhang, C.; Zhang, A.; Gao, J.; Liu, H.; et al. MiR-22 potiče replikaciju virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja ciljanjem na faktor domaćina HO-1. Veterinar. Microbiol. 2016, 192, 226–230. [CrossRef]

34. Xiao, S.; Wang, X.; NIH.; Li, N.; Zhang, A.; Liu, H.; Pu, F.; Xu, L.; Gao, J.; Zhao, Q.; et al. MicroRNA miR-24-3p potiče replikaciju virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja putem supresije ekspresije heme oksigenaze-1. J. Virol. 2015, 89, 4494–4503. [CrossRef]

35. Butler, JE; Šinkora, M.; Wang, G.; Stepanova, K.; Li, Y.; Cai, X. Poremećaj razvoja timocita leži u osnovi pandemije PRRS-a: hipoteza koja se može provjeriti. Ispred. Immunol. 2019, 10, 1077. [CrossRef]

36. Zhou, L.; Wang, Z.; Ding, Y.; Stepanova, K.; Li, Y.; Cai, X. NADC30-kao soj virusa svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma, Kina. Emerg. Zaraziti. Dis. 2015, 21, 2256–2257. [CrossRef]

37. Zhou, L.; Yang, B.; Xu, L.; Jin, H.; Ge, X.; Guo, X.; Han, J.; Yang, H. Procjena učinkovitosti tri modificirana živa virusna cjepiva protiv soja virusa svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma sličnog NADC30-. Veterinar. Microbiol. 2017., 207, 108–116. [CrossRef]

38. Wong, N.; Wang, X. miRDB: mrežni izvor za predviđanje cilja mikroRNA i funkcionalne bilješke. Nucleic Acids Res. 2015, 43, D146-D152. [CrossRef]

39. Friedländer, MR; Mackowiak, SD; Li, N.; Chen, W.; Rajewsky, N. miRDeep2 točno identificira poznate i stotine novih mikroRNA gena u sedam životinjskih klasa. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 37–52. [CrossRef]

40. Wen, M.; Shen, Y.; Shi, S.; Tang, T. miREvo: Integrativna platforma za evolucijsku analizu mikroRNA za eksperimente sekvenciranja sljedeće generacije. BMC Bioinform. 2012, 13, 140. [CrossRef]

42. Anders, S.; Huber, W. Diferencijalna analiza izraza za podatke brojanja sekvenci. Genome Biol. 2010, 11, R106. [CrossRef] [PubMed]

43. Tamura, K.; Stecher, G.; Kumar, S. MEGA11: Analiza molekularne evolucijske genetike verzija 11. Mol. Biol. Evol. 2021, 38, 3022–3027. [CrossRef] [PubMed]

43. Hubisz, MJ; Pollard, KS; Siepel, A. PHAST i RPHAST: Filogenetička analiza s prostorno/vremenskim modelima. Kratak. Bioinform. 2011, 12, 41–51. [CrossRef] [PubMed]

45. Krüger, J.; Rehmsmeier, M. RNAhybrid: mikroRNA ciljano predviđanje jednostavno, brzo i fleksibilno. Nucleic Acids Res. 2006, 34, W451-W454. [CrossRef]

45. Yu, G.; Wang, LG; Han, Y.; He, QY clusterProfiler: R paket za usporedbu bioloških tema među klasterima gena. OMICS 2012, 16, 284–287. [CrossRef]

46. ​​Que, R.; Ding, G.; Chen, J.; Cao, L. Analiza serumskih egzosomalnih mikroRNA i kliničko-patoloških značajki bolesnika s adenokarcinomom gušterače. Svijet J. Surg. Oncol. 2013, 11, 219. [CrossRef]

47. Théry, C.; Witwer, KW; Aikawa, E.; Alcaraz, MJ; Anderson, JD; Andriantsitohaina, R.; Antoniou, A.; Arapin, T.; Archer, F.; Atkin-Smith, GK; et al. Minimalne informacije za studije izvanstaničnih vezikula 2018. (MISEV2018): Izjava o stavu Međunarodnog društva za izvanstanične vezikule i ažurirane smjernice MISEV2014. J. Extracell. Vesicles 2018, 7, 1535750. [CrossRef]

48. Lyoo, K.-S.; Choi, JY; Hahn, TW; Park, KT; Kim, HK Učinak cijepljenja modificiranim živim cjepivom protiv virusa reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja na učinak rasta tovnih svinja u poljskim uvjetima. J. Vet. Med. Sci. 2016, 78, 1533–1536. [CrossRef]

50. Bian, T.; Sun, Y.; Hao, M.; Zhou, L.; Ge, X.; Guo, X.; Han, J.; Yang, H. Rekombinantni tip 2 virusa svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma između NADC30-sličnog i MLV-sličnog: Genetska karakterizacija i patogenost za prasadi. Zaraziti. Genet. Evol. 2017, 54, 279–286. [CrossRef]

50. Li, Y.; Ji, G.; Wang, J.; Tan, F.; Zhuang, J.; Li, X.; Tian, ​​K. Potpuna sekvenca genoma virusa NADC30-poput svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma karakterizirana rekombinacijom s drugim sojevima. Objava genoma. 2016, 4, e00330-16. [CrossRef]

52. Kalluri, R.; Lebleu, VS Biologija, funkcija i biomedicinske primjene egzosoma. Znanost 2020, 367, eaau6977. [CrossRef] [PubMed]

52. Miao, XY Nedavni napredak u razumijevanju uloge miRNA u egzosomima i njihov terapeutski potencijal. J. Integr. Agric. 2017, 16, 753–761. [CrossRef]

53. Šenoda, BB; Ajit, SK Modulacija imunoloških odgovora pomoću egzosoma izvedenih iz stanica koje predstavljaju antigen. Clin. Med. Uvidi Pathol. 2016, 9 (Dodatak S1), CPath-S39925. [CrossRef] [PubMed]

54. Li, S.; Li, S.; Wu, S.; Chen, L. Egzosomi moduliraju replikaciju virusa i imunološki odgovor domaćina kod HBV infekcije. BioMed Res. Int. 2019, 2019, 2103943. [CrossRef]

55. Greening, DW; Gopal, SK; Xu, R.; Simpson, RJ; Chen, W. Egzosomi i njihove uloge u imunološkoj regulaciji i raku. Na seminarima iz stanične i razvojne biologije; Academic Press: Cambridge, MA, SAD, 2015.; Svezak 40, str. 72–81.

56. Howitt, J.; Hill, AF Egzosomi u patologiji neurodegenerativnih bolesti. J. Biol. Chem. 2016, 291, 26589–26597. [CrossRef]

57. Ribeiro, MF; Zhu, H.; Millard, RW; Fan, G. Egzosomi funkcioniraju u pro- i anti-angiogenezi. Curr. Angiogeneza 2013, 2, 54–59. [CrossRef]

59. Lan, J.; Sun, L.; Xu, F.; Liu, L.; Hu, F.; Pjesma, D.; Hou, Z.; Wu, W.; Luo, X.; Wang, J.; et al. Egzosomi izvedeni iz M2 makrofaga potiču migraciju stanica i invaziju kod raka debelog crijeva. Cancer Res. 2019, 79, 146–158. [CrossRef]

60. Aga, M.; Bentz, GL; Raffa, S.; Torrisi, MR; Kondo, S.; Wakisaka, N.; Yoshizaki, T.; Pagano, JS; Shackelford, J. Exosomal HIF1 podržava invazivni potencijal LMP1-pozitivnih egzosoma povezanih s nazofaringealnim karcinomom. Oncogene 2014, 33, 4613–4622. [CrossRef]

60. Fu, M.; Wang, B.; Chen, X.; On, Z.; Wang, Y.; Li, X.; Cao, H.; Zheng, SJ gga-miR-454 suzbija replikaciju virusa zarazne burzalne bolesti (IBDV) putem izravnog ciljanja IBDV genomskog segmenta B i staničnih supresora citokinske signalizacije 6 (SOCS6). Virus Res. 2018, 252, 29–40. [CrossRef]

62. Fu, M.; Wang, B.; Chen, X.; On, Z.; Wang, Y.; Li, X.; Cao, H.; Zheng, SJ MicroRNA gga-miR-130b suzbija replikaciju virusa zarazne burzalne bolesti putem ciljanja virusnog genoma i staničnih supresora signalizacije citokina 5. J. Virol. 2018, 92, e01646-17. [CrossRef]

62. Guo, XK; Zhang, Q.; Gao, L.; Li, N.; Chen, XX; Feng, WH Povećanje ekspresije mikroRNK 181 inhibira replikaciju virusa svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma i ima implikacije na kontrolu virusne infekcije. J. Virol. 2013, 87, 1159–1171. [CrossRef] [PubMed]

63. Cong, P.; Xiao, S.; Chen, Y.; Wang, L.; Gao, J.; Li, M.; On, Z.; Guo, Y.; Zhao, G.; Zhang, X.; et al. Integrirani transkriptomi miRNA i mRNA svinjskih alveolarnih makrofaga (PAM stanica) identificiraju molekularne potpise miRNA specifične za soj povezane s H-PRRSV i N-PRRSV infekcijom. Mol. Biol. Rep. 2014, 41, 5863–5875. [CrossRef] [PubMed]

64. Li, N.; Huang, K.; Chen, Y.; Huang, Z.; Zhang, Y.; Leng, C.; Liu, Y.; Shi, J.; Xiao, S.; Yao, L. MicroRNA ssc-miR-124a pokazuje antivirusno djelovanje protiv virusa svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma putem supresije gena domaćina CD163. Veterinar. Microbiol. 2021, 261, 109216. [CrossRef] [PubMed]

65. Li, N.; Du, T.; Yan, Y.; Zhang, A.; Gao, J.; Hou, G.; Xiao, S.; Zhou, EM MicroRNA let-7f-5p inhibira virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma ciljanjem na MYH9. Sci. Rep. 2016, 6, 34332. [CrossRef]

66. Zhen, Y.; Wang, F.; Liang, W.; Liu, J.; Gao, G.; Wang, Y.; Xu, X.; Su, Q.; Zhang, Q.; Liu, B. Identifikacija različito izražene nekodirajuće RNA u svinjskim alveolarnim makrofagima iz Tongchenga i velikih bijelih svinja koje su odgovorile na PRRSV. Sci. Rep. 2018, 8, 15621. [CrossRef]

67. Zhou, X.; Michal, JJ; Jiang, Z.; Liu, B. Profiliranje ekspresije mikroRNA u alveolarnim makrofagima autohtonih kineskih Tongcheng svinja zaraženih PRRSV-om in vivo. J. Appl. Genet. 2017, 58, 539–544. [CrossRef]

68. Lee, YJ; Lee, C. Replikacija virusa svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma potiskuje se inhibicijom signalnog puta kinaze regulirane izvanstaničnim signalom (ERK). Virus Res. 2010, 152, 50–58. [CrossRef]

70. Song, S.; Bi, J.; Wang, D.; Fang, L.; Zhang, L.; Li, F.; Chen, H.; Xiao, S. Infekcija virusom svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma aktivira proizvodnju IL-10 kroz puteve NF-κB i p38 MAPK u alveolarnim makrofagima svinja. Dev. Comp. Immunol. 2013, 39, 265–272. [CrossRef]

70. Yin, S.; Huo, Y.; Dong, Y.; Fan, L.; Yang, H.; Wang, L.; Ning, Y.; Hu, H. Aktivacija c-Jun NH (2)-terminalne kinaze potrebna je za apoptozu izazvanu virusom svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma, ali ne i za replikaciju virusa. Virus Res. 2012., 166, 103–108. [CrossRef]

71. Fan, L. Signalni putovi uključeni u regulaciju indukcije apoptoze u stanicama domaćina nakon infekcije PRRSV-om. Geni virusa 2019, 55, 433–439. [CrossRef]

73. Lopez-Fuertes, L.; Campos, E.; Domenech, N.; Ezquerra, A.; Castro, JM; Domínguez, J.; Alonso, F. Virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRS) smanjuje proizvodnju TNF-a u zaraženim makrofagima. Virus Res. 2000, 69, 41–46. [CrossRef]

73. Teissier, É.; Pécheur, EI Lipidi kao modulatori membranske fuzije posredovane virusnim fuzijskim proteinima. Eur. Biophys. J. 2007, 36, 887–899. [CrossRef]

74. Jeon, JH; Lee, C. Stanični kolesterol potreban je za infekciju svinjskim nidovirusom. Arh. Virol. 2017., 162, 3753–3767. [CrossRef]

75. Sun, Y.; Xiao, S.; Wang, D.; Luo, R.; Li, B.; Chen, H.; Fang, L. Kolesterol stanične membrane potreban je za ulazak i otpuštanje virusa svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma u MARC-145 stanicama. Sci. China Life Sci. 2011, 54, 1011–1018. [CrossRef]

77. Tian, ​​T.; Zhu, YL; Zhou, YY; Liang, GF; Wang, YY; Hu, FH; Xiao, ZD Preuzimanje egzosoma kroz endocitozu i makropinocitozu posredovanu klatrinom i posredovanje isporuke miR-21. J. Biol. Chem. 2014, 289, 22258–22267. [CrossRef]

77. Mulcahy, LA; Ružičasta, RC; Carter, DRF Rute i mehanizmi preuzimanja izvanstaničnih vezikula. J. Extracell. Vesicles 2014, 3, 24641. [CrossRef]

78. Zhang, M.; Zang, X.; Wang, M.; Li, Z.; Qiao, M.; Hu, H.; Chen, D. Nanonosači temeljeni na egzosomima kao biološki inspirirana i svestrana vozila za dostavu lijekova: nedavni napredak i izazovi. J. Mater. Chem. B 2019, 7, 2421–2433. [CrossRef]